הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

עירוי IV רציף הוא כביש טיפול הבחירה עבור ארגינין-וזופרסין קולטן חוסם Conivaptan עכברים ללמוד בצקת מוחית עורר שבץ

8.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54170

⸱

1 בספטמבר 2016

 ,  , 
1Neurotrauma Research, Swedish Medical Center, 2Neurosurgery, Colorado Brain and Spine Institute

במאמר זה

סיכום

המחקרים שלנו גילו שההשפעות המועילות של conivaptan תלויות בשיטת המסירה לאחר שבץ ניסיוני בעכברים. פיתחנו פרוטוקול מחקר להעברת חוסם הקולטן באמצעות קטטר IV על היווצרות בצקת מוחית המעוררת שבץ בעכברים.

תקציר

שבץ הוא אחד הגורמים העיקריים לתחלואה ותמותה בעולם. שבץ מסתבך בשל בצקת במוח ואירועים pathophysiological אחרים. בין השחקנים החשובים ביותר בפיתוח האבולוציה של בצקת במוח עורר שבץ הוא הורמון ארגינין-וזופרסין ואת הקולטנים שלו, V1a ו- V2. לאחרונה, conivaptan חוסם קולטן V1a ו V2 כבר למשוך תשומת לב כתרופה פוטנציאל להפחתת הבצקת במוח לאחר שבץ. עם זאת, במודלים של בעלי החיים אשר כרוכים יישומי conivaptan במחקר שבץ צריכים להיות שונים בהתבסס על נתיבים ריאליים של ממשל. הנה התוצאות של ורידי רציף 48 שעות (IV) מושוות עם ההזרקה (IP) טיפולי conivaptan לאחר שבץ ניסיוני בעכברים. פיתחנו פרוטוקול שבו באמצע חסימה בעורק מוחי היה בשילוב עם התקנה קטטר לווריד הצוואר לטיפול IV של conivaptan (0.2 מ"ג) או ברכב. מחזורים שונים של בעלי חיים טופלו 0.2בולוס מ"ג IP conivaptan או רכב יומי. בצקת במוח ניסיוני עורר שבץ הוערכה בעכברים לאחר IV הרציפה וטיפולי IP. השוואה של התוצאות הראתה כי ממשל IV הרציף של conivaptan מקל בצקת במוח שלאחר איסכמי בעכברים, בניגוד לממשל IP של conivaptan. אנו מסיקים כי המודל שלנו יכול לשמש למחקרים עתידיים של יישומי conivaptan בהקשר של שבץ בצקת במוח.

מבוא

שבץ מוחי ממשיך להוות נטל עצום עבור מטופלים ורופאים. מודלים של שבץ מוחי של בעלי חיים שימשו במעבדה במשך כמעט שני עשורים. 1 אף על פי כן, טיפולים ניסיוניים הפועלים בבעלי חיים נכשלים לעתים קרובות בבני אדם. 2 פער זה בתוצאות הטיפול עשוי לנבוע מגורמים שונים, כגון דרכי מתן לתרופות המשמשות במחקר בבעלי חיים, חילוף חומרים ושיעור סילוק תרופות, והיבטים רבים אחרים. אחד הסיבוכים העיקריים של שבץ מוחי, בצקת מוחית, הוא מוקד המחקר הנוכחי במדעי המוח. מנגנונים של היווצרות בצקת מוחית כוללים הפרעות במאזן המים והאלקטרוליטים המופעלים על ידי תגובת ארגינין-וזופרסין (AVP) לפגיעה מוחית איסכמית. 3 לכן, AVP והקולטנים שלו (V1a ו-V2) הם מוקד עיקרי של מחקרים על היווצרות בצקת מוחית פוסט-איסכמית. 3

פיתחנו מתודולוגיה לחקר ההשפעות של חוסם קולטנים מעורב ארגינין-וזופרסין (V1a ו-V2) על בצקת מוחית פוסט-איסכמית בעכברים. 4 מטרות מולקולריות של conivaptan5 הופכות את התרופה למועמדת מתאימה לחקר תכונותיה בהקלה על בצקת מוחית. יתר על כן, יש לחקור את conivaptan בהקשר של אירועים פתופיזיולוגיים של שבץ מוחי. 6 בתכנון מחקר זה, שקלנו להשוות את תוצאות הטיפול באמצעות שני דרכי מתן שונות לקוניבפטן: תוך-ורידי (IV)4 ותוך צפקי (IP). 7 הוערכו השפעות הטיפולים על בצקת מוחית הנגרמת על ידי שבץ מוחי. כאן מתוארים פרוטוקולים מפורטים לאינדוקציה כירורגית של שבץ מוחי ניסיוני על ידי חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO), ולאחריו טיפול מתמשך בקוניבפטן באמצעות התקנת קטטר IV צוואר. לאחר השראת שבץ מוחי, בעלי החיים חולקו באופן אקראי לקבוצות הבאות: רכב או קוניבפטן (0.2 מ"ג ליום) שטופלו בעירוי או IP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב לטיפול ולשימוש בחיות במחקר אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים במרכז הרפואי השוודי ועדת שימוש. כל הנהלים בוצעו עם טכניקות aseptic מתאימות. בחיות מעבדה מנוצלות ללימוד היו גברים, בן 3 חודשים, סוג בר עכברי C57 עם משקל גוף מפני 25 כדי 27 גרם.

1. אינדוקציה שבץ Vivo

  1. טרום מעיל נימה עם שרף שיניים לפני הניתוח.
    1. חותכים חתיכה ארוכה 12 מ"מ של נימה מתוך תפר ניילון 7-0. מערבבים 2 חלקים של שרף עם חלק 1 של המקשה, ומיד טובלים את קצה החוט לתוך התערובת לכסות כ 1/3 לכל אורכו. הסר את זה מהר ולוודא כי הוא מכוסה במעיל חלקה ועלו של שרף שיניים.
    2. אוויר יבש הנימה עבור 2 שעות לפני השימוש.
  2. מניחים את העכבר לתוךn תא הרדמת אינדוקציה (2 נפח L), ולהגדיר את זרימת isoflurane 1.5% ב 25% מועשרים בחמצן חדר אוויר 2 ליטר / דקה נכנסה לתא.
  3. אפשר העכבר כדי להישאר בחדר האינדוקציה עד בהרדמה מלאה, 8 כפי שנקבע על ידי חוסר תגובת קמצוץ זנב.
  4. מניחים את העכבר על שולחן הניתוחים עם משטח לוהט, ולהגדיר את ריכוז isoflurane ב -1% לצורך תחזוקה של הרדמה נמסר ספונטני דרך חרטומו.
  5. קליפ שיער על חלקו הקדמי לחלק האחורי של הצוואר, ולרסס את הצוואר עם אלכוהול לחיטוי. החל משחת עיניים וטרינרי על שתי העיניים.
  6. כדי לפקח באופן רציף על טמפרטורת גוף, להשתמש בדיקת טמפרטורה רקטלית מחוברת תצוגה דיגיטלית במהלך הניתוח.
  7. מניחים את העכבר במצב שכיבה, ליישם פתרון לקרצף 10% povidone יוד לחיטוי, לכסות עם וילון סטרילית, ולאחר מכן לעשות חתך קו האמצע לאורך הצוואר עם להב אזמל כירורגי בגודל 10.
  8. זמני ולקשור את העורק הראשי משותף שמאלה (CCA) עם 6.0 תפר משי.
  9. למקום אחר עניבה על העורק הראשי החיצוני השמאל (ECA).
  10. מניח קליפ כלי דם על עורק התרדמה הפנימי (רשפ"ת).
  11. חותכי חור קטן על עורק התרדמה החיצוני במספרי כלי דם. הכנס נימה עשויה תפר ניילון 7-0 מצופה שרף שיניים לתוך פתח ECA, ולקדם אותה cephalically, תוך הסרת קליפ, עד התנגדות מורגשת (כ 5-7 מ"מ מנקודת ההסתעפות של CCA).
  12. מניח עניבה זמנית על עורק התרדמה הפנימי כדי לאבטח את הנימה בעמדה. עיין בתרשים, איור 1 א. סגור את העור עם תפר משי, ולחדור הפצע על החלק הקדמי של הצוואר עם 0.2 מ"ל של bupivacaine 0.5%, כמו בשלב 2.6.
  13. אפשר העכבר כדי להתעורר מההרדמה להכרתו בתא התאוששות למשך 60 דקות. אין להשאיר את החיה ללא השגחה עד שהוא חזרהתודעה מספיק כדי לשמור recumbence sternal.
  14. בדוק את העכבר על הניקוד חסר נוירולוגים (NDS) כדלקמן: 0 תפקוד מוטורי = רגיל, 1 = כפיפה של גו ושל forelimb הנגדי על להרים זנב, 2 חגות = לצד הנגדי אך היציבה נורמלית במנוחה, 3 = נשען אל נגדי בצד במנוחה, 4 = אין פעילות מוטורית ספונטנית. 4,9
    1. כדי לבצע את הבדיקות NDS, להרים העכבר בזנב ומניחים על משטח שטוח לצורך השגחה (2-3 דקות). לחלופין, להתבונן עכברים בחדר ההתאוששות. אל תכלול עכברים כי התערוכה NDS נמוך מ -2 מהניסוי בשל חסימה מספקת של MCA.
      הערה: טכניקת Flowmetry ליזר דופלר ניתן להשתמש כדי לאשר חסימת MCA 9-11.
  15. Re-להרדים את החיה לאחר 60 דקות של התאוששות בחדר אינדוקציה כמתואר לעיל, מחדש לעקר את החתך בעור הקודם עם 10% פתרון לשפשף-יוד povidone, ולפתוח מחדש את הפצע כירורגית עלהקדמי של הצוואר על ידי חיתוך והסרת תפר משי.
  16. כדי להסיר את הנימה מן ECA לבצע את הפעולות הבאות:
    1. מניח קליפ כלי דם על ICA. שחרר את התפר על ICA ולמשוך הנימה החוצה כשהוא אוחז קליפ פתוח.
    2. סגור את קליפ ומקום עניבה על ECA proximally הקיצוץ.
    3. הסר את הקליפ ולהסיר המיתר מן המרכז לאמנות עכשווית כדי לשחזר את זרימת הדם אל המוח. עיין בתרשים, איור 1B.

התקנה 2. IV צנתר לווריד הצוואר עבור רציף 48 שעות טיפול

הערה: המשך ההתקנה של הקטטר מיד לאחר השלב 1.16.3 ללא התעוררות של העכבר.

  1. השתמש בשני גדלים שונים של צינורות גמישים: להכניס את הצינורות הפנימיים (0.94 מ"מ מחוץ קוטר; להכיל את התרופה להיות חדור) לתוך הצינורות החיצוניים (3.18 מ"מ מחוץ קוטר; להגנה על הצינורות הפנימיים).
  2. Pלשרוך את העכבר אפרקדן, להחיל 10% הפתרון לשפשף povidone יוד לחיטוי, ולעשות חתך 1 ס"מ בחלק האחורי של הצוואר עם להב אזמל כירורגי בגודל 10. הפכו את העכבר לתוך במצב שכיבה, מחדש לעקר החלק הקדמי של הצוואר עם 10% פתרון לשפשף povidone יוד, ולפתוח מחדש את הפצע כירורגית על החלק הקדמי של הצוואר. מנהרת צינורות מתחת לעור מן החתך נעשה על חזרה בקדמת הצוואר, ואת exteriorize זה מן הפצע הפעור 1 ס"מ.
  3. הסרה של רקמה שומנית תת עורית מהאגף השמאלי של החלק הקדמי של הצוואר על רוחבית 1 ס"מ מן קו האמצע. האתר את וריד הצוואר שמאלה, הנח שני קשרים לאורך הווריד 5 מ"מ זה מזה, ומעט למתוח הווריד. עושה חור קטן על עורק הצוואר בין שני קשרים עם מספרי כלי דם; הכנס את קצה caudally עמוק צינורות 5 המ"מ הפנימי (לכיוון הלב).
  4. אבטח את הצינורות עם שני קשרי וריד הצוואר. סגור את העור על החלק הקדמי של הצוואר עםתפר משי 3-0. עיין בתרשים, איור 1 ג.
  5. אבטח את הצינורות על העור על החלק האחורי של הצוואר עם תפר, ולחבר את הצינורות אל משאבת IV microinfusion באמצעות מסתובב. חח המאפשר תנועה חופשית של עכברים בתוך הכלוב עם גישה מלאה במזון ובמים.
  6. חדור החתכים בעור בחזית ובחלק האחורי של הצוואר עם 0.2 מ"ל של bupivacaine 0.5% על מנת למנוע את הכאב שלאחר הניתוח.
    הערה: בהתאם פרוטוקולים חיים ספציפית מוסדיים, בעלי חיים עשויים להיות מטופלים עם אופיואידים, NSAIDs, או אנטיביוטיקה לפני ואחרי ניתוח. עם זאת, טיפולים שהוזכרו עשויים לשנות את התוצאות של תוצאת שבץ איסכמי (ראה סעיף דיון). 11-14
  7. אפשר החיה להתעורר בחדר ההתאוששות, ולאחר מכן לשכן את החיה בכלוב נפרד עד לנקודת הסיום של הניסוי. אין להשאיר את החיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור sternalrecumbence.
  8. הגדר את קצב עירוי לטיפול IV רציפה 48 שעות של conivaptan (0.14 מ"ג / מ"ל ב דקסטרוז 5%) או הרכב 1.5 מ"ל / ק"ג / שעה, 4 ולהתחיל עירוי.
    הערה: הסכום הכולל של conivaptan IV חדורים צריך להיות כ 0.2 מ"ג / עכבר / יום בהיקף כולל של 1.44 מ"ל.
    הערה: בצע הזרקה (IP) הזרקה של conivaptan פעמיים ביום עם סך של 0.2 מ"ג ב 1.44 מ"ל של 5% דקסטרוז. ליישם הזרקת IP הייתה כפי שתוארה לעיל. 15 לרסן עכברים על ידי אחיזת העור של פני השטח האחוריים של הגוף ואת הזנב. להזריק conivaptan או רכב לתוך ברבע השמאלי התחתון של הבטן באמצעות מחט אינץ 26 G / 1/2. 15
  9. שימו לב החיות פעמיים ביום למשך כל תקופת הניסוי (48 שעות). אפשר החיות יש גישה מלאה במזון ובמים. אם החיה מפגינה סימני מצוקה או קוצר נשימה להתייעץ עם וטרינר. אם המתת חסד הוא הכרחי עבור בעל החיים dist חמורהress מתייחס לשלב 3.1 להלן, ואינו כולל את החיה מן המחקר.

הערכה 3. בצקת מוחית עורר שבץ בנקודת הסיום

  1. להקריב את העכבר על ידי יתר בהרדמה עם 5% isoflurane.
  2. השתמש אזמל לעשות חתך בעור מעל לעצם הגולגולת לאורך קו האמצע, לסגת העור כדי לחשוף את הגולגולת כולה על המוח. החל בבית מגנום foramen, לחתוך את עצם הגולגולת רוחבית לאורך ההיקף של המוח בכל צד, והרם אותו בזהירות בלי לגעת במוח מתחתיו. לנתק את המוח מעמוד השדרה ואת העצבים מצורפים על בסיס הגולגולת.
  3. הסר את המוח, להפריד אותו נורת חוש הריח ואת המוח הקטן, לנתח את המוח הגדול לאורך בקע המיספרי לתוך אונות מוח איסכמי ולא איסכמי, כפי שתואר לעיל. 9
  4. להעריך בצקת במוח על ידי השוואה רטובה אל יבש יחסים (WDR) כפי שתואר לעיל 4,9. לשקול רקמותלפני ואחרי הייבוש במשך 3 ימים ב 100 מעלות צלזיוס בתנור. חישוב תכול מי מוח (BWC) כמו% H 2 O = (WT 1-יבש. / WT הרטוב.) X 100%.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

טמפרטורת הגוף של בעלי החיים בתוך הטווח הפיזיולוגי ויציבה לאורך ההליך הכירורגי של אינדוקציה שבץ. שני עכברים אשר הציג NDS נמוך מ -2 מיד לאחר MCAO הוצאו מהמחקר.

MCAO בעכברים מייצר נפח האוטם בחצי הכדור ipsilateral ב 48 שעות. הערכת הפרוסות מוכתמת TTC מראה כי כ -50% בחצי הכדור מושפעים אוטם לאחר MCAO (איור 1D), כפי שפורסמו על ידי Zeynalov...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למחקר זה יש ערך חשוב למחקר שבץ בבעלי חיים. מחקר זה מגלה כי עירוי IV הרציף של conivaptan (0.2 מ"ג / יום) לאחר שבץ ניסיוני בעכברים ביעילות מפחית בצקת במוח לאחר 48 שעות של טיפול. השפעת הזרקת ה- IP של אותו המינון של conivaptan על בצקת במוח גם נחקרה. טיפול Conivaptan ידי שני מסלולי IV ו- IP מייצר aquaresis בעכברים כפי שצוין על ידי: 1) עליית osmolality פלזמה מעל הרמות פיסיולוגיות מעט; ו -2) ירידה osmolality שתן בשל חסימה של הספיגה החוזרת מים בכליה. לכן, בהתבסס על תוצאות הטיפול, אנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

אנו מודים מרכז רפואי שבדי למתן מימון ומתקנים. אנו מודים גם קרייג החולים לשימושם הנדיב של שטח מעבדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כרית מחוממתK& H Manufacturing Inc1060
מוניטור טמפרטורה עם בדיקה רקטליתPhysitemp7029
סליל תפר משי, 6-0Surgical Specialties CorporationSP114
תפר משי על מחט, 3-0Ethicon1684G
תפר ניילון, 7-0Ethicon1696G
שרף שיניים פוליסילוקסן עם מקשהHeraeus משאבת Kulzer65817930
Microinfusion IV קנטScietificGT0897
מסתובבת 22GAInstech375/22PS
צינורות מעבדה, 0.94 מ"מ x 0.51 מ"מDow Corning508-002
, 3.18 מ"מ x 1.98 מ"מDow Corning508-009
צינורות מעבדה

מקורות

  1. Gueniau, C., Oberlander, C. The kappa opioid agonist niravoline decreases brain edema in the mouse middle cerebral artery occlusion model of stroke. J Pharmacol Exp Ther. 282, 1-6 (1997).
  2. Krafft, P. R., et al. Etiology of stroke and choice of models. Int J Stroke. 7, 398-406 (2012).
  3. Vakili, A., Kataoka, H., Plesnila, N. Role of arginine vasopressin V1 and V2 receptors for brain damage after transient focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 25, 1012-1019 (2005).
  4. Zeynalov, E., Jones, S. M., Seo, J. W., Snell, L. D., Elliott, J. P. Arginine-Vasopressin Receptor Blocker Conivaptan Reduces Brain Edema and Blood-Brain Barrier Disruption after Experimental Stroke in Mice. PloS one. 10, e0136121(2015).
  5. Med Lett Drugs Ther.. Conivaptan (Vaprisol) for hyponatremia. The Medical letter on drugs and therapeutics. 48, 51-52 (2006).
  6. Zhao, X. Y., et al. Effect of arginine vasopressin on the cortex edema in the ischemic stroke of Mongolian gerbils. Neuropeptides. 51, 55-62 (2015).
  7. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans Blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195, 206-210 (2011).
  8. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Curr Protoc Mouse Biol. 5, 51-63 (2015).
  9. Zeynalov, E., et al. The perivascular pool of aquaporin-4 mediates the effect of osmotherapy in postischemic cerebral edema. Crit Care Med. 36, 2634-2640 (2008).
  10. Zeynalov, E., Dore, S. Low doses of carbon monoxide protect against experimental focal brain ischemia. Neurotox Res. 15, 133-137 (2009).
  11. Zeynalov, E., Nemoto, M., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Neuroprotective effect of selective kappa opioid receptor agonist is gender specific and linked to reduced neuronal nitric oxide. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 414-420 (2006).
  12. Ma, M. C., Qian, H., Ghassemi, F., Zhao, P., Xia, Y. Oxygen-sensitive {delta}-opioid receptor-regulated survival and death signals: novel insights into neuronal preconditioning and protection. J Biol Chem. 280, 16208-16218 (2005).
  13. Ahmad, M., Zhang, Y., Liu, H., Rose, M. E., Graham, S. H. Prolonged opportunity for neuroprotection in experimental stroke with selective blockade of cyclooxygenase-2 activity. Brain Res. 1279, 168-173 (2009).
  14. Meisel, C., et al. Preventive antibacterial treatment improves the general medical and neurological outcome in a mouse model of stroke. Stroke. 35, 2-6 (2004).
  15. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17, 250-251 (1969).
  16. Adis International Limited. Conivaptan: YM 087. Drugs in R&D. 5, 94-97 (2004).
  17. Murphy, T., Dhar, R., Diringer, M. Conivaptan bolus dosing for the correction of hyponatremia in the neurointensive care unit. Neurocrit Care. 11, 14-19 (2009).
  18. Liu, X., Nakayama, S., Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P., Bhardwaj, A. Arginine-vasopressin V1 but not V2 receptor antagonism modulates infarct volume, brain water content, and aquaporin-4 expression following experimental stroke. Neurocrit Care. 12, 124-131 (2010).
  19. Wallace, B. K., Jelks, K. A., O'Donnell, M. E. Ischemia-induced stimulation of cerebral microvascular endothelial cell Na-K-Cl cotransport involves p38 and JNK MAP kinases. Am J Physiol Cell Physiol. 302, C505-C517 (2012).
  20. O'Donnell, M. E., et al. Intravenous HOE-642 reduces brain edema and Na uptake in the rat permanent middle cerebral artery occlusion model of stroke: evidence for participation of the blood-brain barrier Na/H exchanger. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 225-234 (2013).
  21. Walcott, B. P., Kahle, K. T., Simard, J. M. Novel treatment targets for cerebral edema. Neurotherapeutics. 9, 65-72 (2012).
  22. Shen, Z., et al. Inhibition of G protein-coupled receptor 81 (GPR81) protects against ischemic brain injury. CNS Neurosci Ther. 21, 271-279 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מתן Conivaptanטיפול תו-פריטונאליחסימת העורק המוחי האמצעיקטטריזציה של הווריד הג'וגולריהערכת בצקת מוחיתמודל עכביש לשבץ מוחינתיב הולכת תרופהחוסם קולטני V1a V2בצקת מוחית פוסט-איסכמית
עירוי IV רציף הוא כביש טיפול הבחירה עבור ארגינין-וזופרסין קולטן חוסם Conivaptan עכברים ללמוד בצקת מוחית עורר שבץ
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.