מאמר שיטה

שיטה יעילה להשיג תאי Dedifferentiated שומן

DOI:

10.3791/54177

⸱

15 ביולי 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינינו את התנאים ליצירת תאי DFAT ומספקים כאן מידע לגבי השימוש במצע גידול משופר לייצור תאים אלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנדסת רקמות טיפול בתאים להחזיק הבטחה גדולה קלינית. בהקשר זה, תאי מולטיפוטנטיים, כגון תאי גזע mesenchymal (MSCs), ניתן להשתמש לצורך טיפולי בעתיד הקרוב, כדי לשקם את תפקוד לאיברים פגומים. אף על פי כן, כמה בעיות טכניות, לרבות הליך פולשני מאוד לבודד MSCs ואת יעילות שמסביב הגברה שלהם, כרגע לעכב את השימוש הקליני הפוטנציאל של שיטות טיפול אלה. בזאת, אנו מציגים שיטה יעילה ביותר עבור הדור של תאי שומן dedifferentiated (DFAT), תאי MSC דמויים. מעניין לציין, כי תאים DFAT ניתן להבדיל לכמה סוגי תאים כולל adipogenic, osteogenic, ותאי chondrogenic. למרות קבוצות אחרות בעבר הציגו שיטות שונות להפקת תאי DFAT מרקמות שומן בוגרות, השיטה שלנו מאפשרת לנו לייצר תאי DFAT בצורה יעילה יותר. בהקשר זה, אנו מראים כי מדיום תרבות DFAT (DCM), בתוספת 20% FBS,הוא יעיל יותר ביצירת תאי DFAT מ DMEM, בתוספת 20% FBS. בנוסף, תאי DFAT המיוצרים על ידי שיטת תרבית תאים שלנו ניתן redifferentiated לתוך סוגי רקמות שונים. ככזה, מודל מעניין ושימושי מאוד לחקר dedifferentiation רקמות מוצג.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cell טיפול והנדסת רקמות הם נושאים חמים בתחום של רפואה רגנרטיבית 1-5. בעוד שיטות טיפול אלה מחזיקות הבטחה גדולה, כמה בעיות טכניות כרגע לעצור בשימושו הקליני שלהם. בהקשר זה, כמו בדור של תאי שב"ס, כל טיפולי הנדסת הרקמות חייבים לייצר תאים ללא transductions גן החיצוני על מנת לשמור על בטיחות חולה. בהתאם לכך, היינו הקבוצה הראשונה לייצר תאי DFAT אדם בהצלחה 6. מספר קבוצות מחקר אחרות מאז אמצו את השיטה שלנו כדי לייצר תאי DFAT ממוצא יונק 7-9, עוד המדגישות את התועלת של המודל שלנו.

במהלך מספר מחקרים, מצאנו כי איכות סביבת תרבית תאים ניתן לשנות על ידי התאמת התוכן של המדיום הסלולרי. ממצא זה הוביל לעלייה בשיעור ההצלחה של ייצור תאי DFAT ואיכות תא משופר; הן גורמים קריטייםיצירת תאים ביעילות לניסויים קליניים עתידיים. בהקשר זה, מדיום תרבות משופר DFAT (DCM, מדיום דומה mesenchymal גזע מדיום סלולארי, המכיל אינסולין אנושי רקומביננטי, אלבומין, חומצת L-גלוטמית, כמה חומצות שומן, כולסטרול) שיטה לייצור תאי DFAT ו התפשטות פותחה (מידע נוסף על התוכן של DCM זמין לפי בקשה). שימוש זה תאי שיטה באיכות גבוהה DFAT נוצרו עם היכולת להתמיין לסוגי תאים שונים, הכוללים adipogenic, osteogenic, ותאי chondrogenic. בסך הכל, פרוטוקול תרבית תאי תוקף זה משפר את איכות תאי DFAT ועשוי להיות שימושי למדי עבור שיפור יישומים קליניים של טיפול בתאים והנדסת רקמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמאות של שומן תת עורי האנושי התקבלו מחולים שעברו ניתוח במחלקות לכירורגיה פלסטית, אורולוגיה, כירורגיה ילדים כירורגיה אורתופדית בבית החולים איטבאשי אוניברסיטת ניהון (טוקיו, יפן). החולים נתן הסכמה בכתב הודיע, וועדת האתיקה של אוניברסיטת ניהון לרפואה אישרה את המחקר.

1. רקמות הכנה

  1. תביאו את דגימת רקמה מחדר הניתוח למעבדה.
  2. לשטוף 1-2 גרם של רקמה שומנית עם 5 מ"ל של PBS (-) בטמפרטורת החדר (RT) פעם, בתוך שפופרת 50 מ"ל ולאחר מכן הנח את הדוגמה צלחת פלסטיק 10 ס"מ.

2. עיכול Collagenase

  1. הסר את המדגם מתוך PBS (-), ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של 0.1% סטרילי (w / v) פתרון collagenase (סוג Collagenase השנייה) כדי בצלחת המכילה את דגימת רקמה.
  2. לרכך את הרקמה עם מספרי כירורגיות למשך כ 15 דקות, עד שהוא מגיע מחיה מורכבתency.
  3. בהמשך לכך, לעכל את הרקמה טחון ב -0.1% (w / v) פתרון collagenase על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (60 סל"ד) בצינור 50 מ"ל עם תסיסה עדינה על שייקר.
  4. סנן המדגם מתעכל דרך פילטר 100 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל. לאחר מכן, להעביר 10 מ"ל של DCM (ראו טבלה של חומרים) בתוספת 2% FBS דרך המסנן.

בידוד תא 3.

  1. צנטריפוגה תאים המסוננים ב 100 XG דקות 1 ב RT.
  2. בשלב זה, להכין 5 מ"ל של DCM בתוספת 2% FBS בתוך שפופרת 50 מ"ל.
  3. בשלב הבא, לצייר את תאי השומן צף בעזרת פיפטה 1,000 μl ולהוסיף את התאים במדיום המכיל 50 מ"ל צינור.
  4. בהמשך לכך, לנער את שפופרת 50 מ"ל בעדינות לתערובת המדיום DCM עם התאים.
  5. לאחר מכן, צנטריפוגות הצינור ב 100 XG דקות 1 ב RT.
  6. מחק את המדיום בתחתית הצינור באמצעות מחט 18 G ו מזרק 20 מ"ל.
  7. לאחר מכן, להוסיף 10 מ"ל של DCM supplemented עם 2% FBS אל התאים שנאספו.
  8. מערבבים את DCM עם התאים על ידי טלטול שפופרת 50 מ"ל בעדינות.
  9. צנטריפוגה הצינור ב 100 XG דקות 1 ב RT.

4. תאי ציפוי

  1. להוסיף 41 מ"ל של DCM או DMEM בתוספת FBS 20% בבקבוק 12.5 ס"מ.
  2. לאחר מכן, בעזרת פיפטה 200 μl להוסיף 40 μl של תאי השומן אל הבקבוק.
  3. לאחר מכן, למלא את הבקבוק עם DCM או DMEM בתוספת 20% FBS. שלב קריטי: בשלב זה, להבטיח כי התאים מפוזרים ברחבי בינוני. ראייה לבדוק את התאים המנותקים ולאחר מכן לשמור את הבקבוק על המכסה של צלחת פטרי עגולה כדי לקבע אותו שטוח.
  4. לבסוף, הניחו את הבקבוק בתוך האינקובטור ולהשאיר אותה ללא הפרעה חממה 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.
  5. לאחר שבוע של דגירה, להפוך את הבקבוק לאיתור תאי DFAT. לאחר מכן, להעריך שליטת דור תא DFAT כמתואר 10 מאז ב fibrobl בנקודה זותאי אס 'דמוי (תאי DFAT) ממוקמים באזורים מובחנים מתאי שומן.
  6. הוסף 5 מ"ל של DCM או DMEM בתוספת 20% FBS אל הבקבוק לאחר הסרת המדיום תרבית תאים הקודמת. אפשר תאי DFAT לגדול במשך שבוע נוסף לאחר שינוי המדיום.
  7. באמצעות דלפק תא, לספור את מספר תאי DFAT שנוצרו בתנאי תרבית תאים שונים (DCM לעומת DMEM).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, שיטת ערכת הכלים עבור דור תא DFAT השתפרו (איור 1). השיטה שלנו מאפשרת לנו לייצר תאי DFAT היא באמצעות DCM ו DMEM בינוני המכילים 20% FBS (איור 2 א). ככזה, השווינו את היעילות של DCM ו DMEM ביצירת תאי DFAT. בהקשר זה, DCM משופרת התפשטות תאים DFAT פי שלושה בהשוואה DMEM, ללא קשר למספר של adipocytes (איור 2 א 'וב'). באמצעות 20% FBS גם משפר את צמיחת תאים בהשוואה פרוטוקולים באמצעות 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adipocytes מבוגרים שעוברים ב dedifferentiation במבחנה, תהליך המכונה תרבות תקרה, עלול לחזור פנוטיפ פרימיטיווי יותר ולהשיג יכולות שגשוג. תאים אלה מכונים שומן dedifferentiated כתאים (DFAT). פוטנציאל בידול multilineage של תאי DFAT הוערך. Cytometry זרימה חשף ניתוח ביטוי ניתוח גנים שתאי DFAT היו הומוגנית מאוד בהשוואה 6 ASCs. למעשה, הפרופיל אנטיגן פני קרום התא של תאי DFAT דומה מאוד לאלה שנמצאו ASCs 6. בהתאם לכך, תאי DFAT עשויים פועלים באופן דומה MS...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי התוכנית ליצירת סטארט-אפים ממחקר וטכנולוגיה מתקדמים (תוכנית START) של האגודה היפנית לקידום המדע (ST261006IP, TM) ועל ידי התוכנית לקרן המחקר האסטרטגי באוניברסיטאות פרטיות (2014-2019) (S1411018, TM) ממשרד החינוך, הספורט, המדע והטכנולוגיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
CSTI303-MSC בינוני CSTI87-671מדיום זה מוגדר כ-DCM בטקסט
PBS(-)Wako166-23555הוא אינו מכיל Mg2+ ו-Ca2+
DMEM בינוניGibco11965-092
סרום בקר עובריסיגמא172012
קולגנאז סוג IISigmaC-6885
מספרייםTakasago תעשיה רפואית ושות', בע"מTKZ-F2194-1
שייקרTAITECBioshaker V.BR-36
מסננת תאי פלקון 100 μ מ צהובקורנינג מדעי החיים DL 352360
פלקון 12.5 ס"מ&סופ2; בקבוק תרבית תאי צוואר מלבני עם מכסה בורג מאוורר כחולCORNING LIFE SCIENCES 
מחט 18 גרםNIPRO02-002
מזרק 20 מ"ל NIPRO08-753
Z סדרת קולטר מונהבקמן קולטר383550
353107

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
  2. de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
  3. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
  4. Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
  5. Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
  6. Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
  7. Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
  8. Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).
  9. Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651(2015).
  10. Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
  11. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DFATDCM

מאמרים קשורים