הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

6.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54190

⸱

30 ביולי 2016

 ,  ,  , 
1Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול המובא במחקר זה מתאר שיטות לניטור בזמן אמת של התקדמות מחדש באמצעות מדידת הקינטית של סמנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים חיוביים ושליליים באמצעות ניתוח תזרים cytometry. הפרוטוקול גם כולל את הערכה המבוססת על הדמיה של מורפולוגיה, סמן או ביטוי הכתב במהלך הדור iPSC.

תקציר

תכנות מחדש סומטי איפשר המרה של תאים בוגרים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) מרקעים גנטיים מגוונים ופנוטיפים של מחלות. ההתקדמות האחרונה זיהתה שיטות יעילות ובטוחות יותר להכנסת גורמי תכנות מחדש. עם זאת, ישנם מעט כלים לניטור ומעקב אחר התקדמות התכנות מחדש. השיטות הנוכחיות לניטור תכנות מחדש מסתמכות על בדיקה איכותית של מורפולוגיה או צביעה בצבעים ונוגדנים ספציפיים לתאי גזע. כלים לניתוח התקדמות יצירת iPSC יכולים לסייע בהבנה טובה יותר של התהליך בתנאים שונים ממקורות תאים מגוונים.

מחקר זה מציג גישות מפתח למדידה קינטית של התקדמות תכנות מחדש באמצעות ציטומטריית זרימה וכן ניטור בזמן אמת באמצעות הדמיה. כדי למדוד את הקינטיקה של תכנות מחדש, בוצע ניתוח זרימה בנקודות זמן נפרדות באמצעות נוגדנים כנגד סמני תאי גזע פלוריפוטנטיים חיוביים ושליליים. השילוב של ויזואליזציה בזמן אמת וניתוח זרימה מאפשר מחקר כמותי של תכנות מחדש בשלבים שונים ומספק השוואה מדויקת יותר בין מערכות ושיטות שונות. ניתוח מבוסס תמונה בזמן אמת שימש לניטור רציף של פיברובלסטים כשהם מתוכנתים מחדש במערכת מדיום נטולת מזין. הקינטיקה של היווצרות המושבה נמדדה על סמך מפגש בתעלות ניגוד פאזה או פלואורסצנטיות לאחר צביעה בצבע פוספטאז אלקליין חי או נוגדנים כנגד SSEA4 או TRA-1-60. התוצאות הצביעו על כך שמדידת המפגש מספקת מדדים כמותיים למחצה לניטור התקדמות התכנות מחדש.

מבוא

החולה שמקורם בתאי גזע מושרים (iPSCs) הם כלים מבטיח טיפול בתא ההקרנה התרופה. הם מספקים מקור עצמי של תאים לטיפול. בנוסף, הם כוללים סט רחב מאוד של רקע גנטי, מה שמאפשר ניתוח במבחנה מפורט של מחלות גנטיות מעבר למה תאי גזע עובריים נוכחיים (ESC) קווים ייאפשרו. ההתקדמות שחלה באחרונה הוביל לפיתוח של מספר שיטות להפקת iPSCs, כולל תכנות מחדש בנגיף סנדאי, פלסמידים episomal או mRNAs 1,2. יש לציין, שיטות תכנות מחדש שונות קשורות עם רמות משתנות של יעילות ובטיחות, וכן צפויים שונים באופנים אחרים המשפיעים והתאמתו ליישומים שונים. עם הזמינות של מגוון רחב של טכנולוגיות תכנות מחדש, זה הפך להיות חשוב לפתח שיטות להערכת תהליך תכנות מחדש. רוב השיטות הקיימות להסתמך על בדיקה איכותית של מורפולוגיה או מכתיםעם צבעים ונוגדני תא ספציפי גזע. שיטה שפותחה לאחרונה אחת עושה שימוש לכתבי קרינת lentiviral רגישים miRNAs PSC ספציפי או mRNAs תא ספציפי בדיל 3. שיטות מעקב כזה להקל על הבחירה ואופטימיזציה של טכניקות תכנות מחדש למצבים שונים. לדוגמא, CDy1 שמש בדיקת ניאון עבור iPSCs מוקדם כדי למסך מאפנני תכנות מחדש 4. היכולת להתבונן ולהשוות ניסויים תכנות מחדש שונים הינה עניין מהותי, להבנה טובה יותר של התהליך עצמו. למשל, כיום ידוע כי סוגים מסוימים תא סומטי קלים יותר לתכנת מחדש מאחרים 5, וכי תאים לעבור מצבי ביניים במהלך תכנות מחדש 6-8. למרבה הצער, את המנגנונים העומדים בבסיס תהליך תכנות מחדש עדיין אינם מובנים לחלוטין וכתוצאה מכך, ההבדלים המדויקים בין שיטות תכנות מחדש להישאר גם כדי להיות Defined. לפיכך, שיטות לניטור, שמאות והשוואת אירועי תכנות מחדש להמשיך להיות קריטי עבור השדה התא גזע.

השיטות שתוארו בפרוטוקול זה לאפשר הניטור והערכה של תהליך תכנות מחדש ותדגמנה טכניקות אלה יכולים לשמש כדי להשוות קבוצות שונות של ריאגנטים תכנות מחדש. נקודת המבט הראשון הוא cytometry זרימה מנתח באמצעות שילובים של נוגדנים נגד תאי גזע פלוריפוטנטיים חיוביים ושליליים סמנים (PSC). הדמיה בזמן אמת זוגות הגישה השנייה ומדידת מפגש הכולל (שטח הפנים אחוזים מכוסה על ידי תאים) ואת המפגש של אותות סמן (שטח הפנים אחוזים מכוסה על ידי אותות ניאון).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1.Solution והכנה בינוני

  1. מטריקס ממברנה מרתף (מטוהרים מן הגידול Engelbreth-הולם-נחיל)
    1. לאט להפשיר המטריצה ​​קרום במרתף (5 מ"ל) על הקרח על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. לדלל את פתרון מניות 1: 1 עם 5 מיליליטר של קר כקרח, DMEM סטרילי / בינוני F-12 צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי, מראש צונן. לוותר aliquots לתוך מראש צונן, צינורות 1.5 מ"ל צנטריפוגות מיקרו סטרילי ולאחסן מיד ב -20 ° C.
    3. לפני השימוש, להפשיר את 1 קפוא: aliquot מטריקס 1 מרתף קרום לילה ב 4 מעלות צלזיוס. בעת השימוש, נוסף לדלל את 1: aliquot 1 50 אחר לקפל עם קרים כקרח, DMEM סטרילי / F-12 בינוני עד דילול סופי של 1: 100.
    4. מוסיף את הכמות המתאימה של 1: פתרון מטריקס קרום 100 מדולל המרתף אל בתרבית הרקמה המתאימה (TC) כלי לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. בדרך כלל, השתמש 3 מ"ל של הפתרון מטריקס קרום במרתף מדולל מעיל o צלחת TCf 20 ס"מ שטח הפנים 2, מעיל כל שאר סוגי מאכלים TC / צלחות לפי יחס של 0.15 מ"ל של מטריקס המדולל ס"מ 2 של שטח הפנים. לשאוב את הפתרון הנותרים לפני תוספת של כל מדיום ותאי תרבות.
  2. פיברובלסטים בינוניים
    1. להפשיר בקבוק 100 מ"ל של מוסמך ES עוברית שור סרום (ES-FBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. הוסף 50 מ"ל של FBS-ES מופשר 5 מ"ל של ממ שאינם חיוניים פתרון חומצות אמינו (1x) 445 מ"ל של מדיום DMEM. לעקר את הרכיבים בשילוב דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן המדיום ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
  3. iMEF בינוני
    1. להפשיר בקבוק 100 מ"ל של ES-FBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. הוסף 50 מ"ל של FBS מופשר, 5 מ"ל של ממ שאינם חיוניים אמינו חומצה פתרון (1x), ו -500 μl של 2-mercaptoethanol כדי 445 מ"ל של מדיום DMEM.
    3. לעקר את הרכיבים בשילוב דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן את ליdium ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
  4. פתרון פקטור גדילה בסיסי פיברובלסטים (ב-FGF)
    1. הוסף 10 μl של החלפת סרום 990 μl של D-PBS ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    2. מוסיפים את 1 מ"ל של 1% (v / v) פתרון החלפת סרום בקבוקון אחד של 10 מיקרוגרם lyophilized ב-FGF. לערבב ביסודיות על ידי pipetting מעלה מטה בעדינות.
    3. Aliquot הפתרון 10 מיקרוגרם / מ"ל-FGF b לתוך 200 aliquots μl צינורות מיקרו צנטריפוגות ולאחסן ב -20 ° C עד הצורך עד 4 שבועות.
  5. תאים אנושיים גזע פלוריפוטנטיים (hPSC) בינוני
    1. להפשיר בקבוק 100 מ"ל של החלפת סרום על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. הוספת 100 מ"ל של החלפת סרום מופשר, 5 מ"ל של ממ שאינם חיוניים אמינו חומצה פתרון (1x), ו -500 μl של 2-mercaptoethanol כדי 395 מ"ל של מדיום DMEM / F-12.
    3. לעקר את הרכיבים בשילוב דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאחסן המדיום בבית4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
    4. בעת השימוש, מראש לחמם את המדיום hPSC ל -37 מעלות צלזיוס, להשלים עם 4 ng / ml של bFGF.
  6. iMEF אוויר בינוני (CM)
    1. להוסיף 18 מ"ל של 0.1% ג'לטין בקבוק תרבות T-175 ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. הסר את פתרון ג'לטין 0.1% אחרי שעה אחת של דגירה. להוסיף 9.1 x 10 6 פיברובלסטים עובריים בעכבר mitotically מומת (iMEF) ב 45 מ"ל של מדיום iMEF דגירה של 37 ° C חממה לילה.
    3. לאחר דגירה לילה, להסיר את המדיום iMEF הישן ולשטוף פעם עם 25 מ"ל של D-PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. לשאוב את D-PBS לשטוף ולהוסיף 90 מ"ל של מדיום hPSC מחומם מראש, בתוספת 4 ng / ml של bFGF. דגירת 37 מעלות צלזיוס החממה בדיוק 24 שעות.
    5. לאחר 24 שעות של דגירה, בסביבה נקייה מחיידקים להסיר את המדיום hPSC מהבקבוק iMEF לעקר דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. Aliquot לתוך 50 צינורות מ"ל ולהקפיא חרוטים ב -20 ° C עד צורך. iMEF CM ניתן לאחסן עד 6 חודשים ב -20 ° C.
    6. הוסף עוד 90 מ"ל של מדיום מראש התחמם hPSC השלימו עם 4 ng / ml של bFGF אל הבקבוק iMEF. דגירת 37 מעלות צלזיוס החממה בדיוק 24 שעות. חזור על הקצירה של CM עד 7 ימים.
    7. בעת השימוש, מראש ולחמם את iMEF-CM ל -37 מעלות צלזיוס, להשלים עם 4 ng / ml של bFGF.
  7. E8 בינוני
    1. להפשיר תוספת 10 מ"ל E8 ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. הסר 10 מ"ל של המדיום הבסיס E8 ו בסביבה נקייה מחיידקים להוסיף את התוכן של המוסף E8 מופשר למדיום הבזליים הנותרים. מערבבים היטב לעקר דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. אחסן את הבינוני המלא ב 4 ° C עד 2 שבועות.
    3. בעת השימוש, מראש ולחמם את aliquot של המדיום כדי לשמש לטמפרטורת החדר. זה לא מומלץ טרום חם E8 בינוני עד 37 ° C.
  8. Cell אזrting הצפה
    1. הכן חיץ מיון טרי ממש לפני מיון התא על ידי הוספת פתרון EDTA (1 הריכוז הסופי מ"מ), חיץ HEPES (25 מ"מ הריכוז הסופי) פתרון פניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / הריכוז הסופי מ"ל) שור סרום אלבומין (1% ריכוז סופי) לתוך פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (סידן ומגנזיום חינם).
    2. לעקר למאגר דרך פילטר 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
  9. מיון תאי שחזור בינוני
    1. שינוי 50 מיליליטר של פיברובלסטים בינוניים על ידי הוספת פניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / ריכוז סופי מיליליטר) ורוק מונע Y-27632 (10 מיקרומטר ריכוז סופי). טרום חם בינוני עד 37 ° C לפני זריעת התאים הממוינים.

2. סנדאי מתווך תכנות מחדש של פיברובלסטים אדם

  1. 24 שעות לפני התמרה עם וירוסים סנדאי, לזרוע את הפיברובלסטים בצפיפות של 2 × 10 5 גאמות לכל טוב לתוך הבארות הרצויות של צלחת TC 6 באר.
  2. בצע התמרה ביום 0 כדלקמן.
    1. טרום חם 2 מיליליטר של פיברובלסטים בינוניים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. סור קבוצה אחת של צינורות וירוס סנדאי מ -80 אחסון ° C ו להפשיר צינור אחד אחד בכל פעם על ידי הטבילה הראשונה התחתון של הצינור בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 - 10 שניות, ולאחר מכן להסיר את הצינור מן המים לרחוץ ולאפשר לו להפשיר בטמפרטורת החדר. לאחר מופשר, בקצרה צנטריפוגות צינור ולמקם אותו מיד על הקרח.
    2. משתמשים בוירוסים דורות שני סנדאי מסחרי על ידי הוספת הכמויות המתאימות (לפי COA) עבור כל אחד הצינורות על מנת להשיג את הריבוי הבא של זיהום (משרד פנים) עד 1 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים מחומם מראש לכל טוב להיות transduced כמו בצע : KOS = 5 x 10 6 CIU, HC-Myc = 5 x 10 6 CIU, hKlf4 = 3 x 10 6 CIU.
    3. לערבב ביסודיות הפתרון ויראלי ידי pipetting את התערובת בעדינות מעלה ומטה. משליםte לשלב הבא תוך 5 דקות.
    4. לשאוב פיברובלסטים בינוני מהבאר של פיברובלסטים, לתכנת מחדש, ולהוסיף 1 מ"ל של הפתרון ויראלי היטב כל אחד. מניח את התאים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור דגירת הלילה.
  3. לאחר דגירת הלילה, לשאוב את המדיום התמר ולסלק את המדיום הישן כראוי (פתרון אקונומיקה 10% למשך 30 דקות). חלף עם 2 מיליליטר של טרום חמם פיברובלסטים בינוניים וממשיכים תרבות תאי transduced.
  4. תרבות התאים למשך 6 ימים נוספים, החלפת המדיום הישן עם פיברובלסטים בינוניים טריים בכל יום אחר.
    הערה: אל מעבר התאים לתכנות מחדש עד 7 ימים שלאחר התמרה.
  5. כלי היכונו דור iPSC: יום 6
    1. עבור דור iPSC תלוי מזין, להוסיף 1.5 מיליליטר של תמיסת הג'לטין 0.1% היטב בכל צלחת 6-גם בתרבית רקמה (TC) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. הסר את הג'לטין 0.1% כךlution אחרי שעה 1 של דגירה. הוסף 3 x 10 5 פיברובלסטים עובריים בעכבר mitotically מומת (iMEF) ב 2 מ"ל של מדיום iMEF לכל היטב דגירה של 37 מעלות צלזיוס חממה לילה.
    3. עבור דור מזין עצמאי iPSC, להוסיף 1.5 מיליליטר של מטריקס קרום במרתף המדולל (דילול 1: 100) היטב בכל צלחת 6-גם בתרבית רקמה (TC) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  6. שבעה ימים לאחר התמרה, לקצור את פיברובלסטים transduced מחדש צלחת אותם על תרבות המנות שהוכנו מראש עבור דור מושבת iPSC.
    1. לשאוב את מדיום התרבות הנורמלי מן פיברובלסטים, לשטוף את התאים פעם עם 2 מיליליטר של D-PBS.
    2. לשאוב את D-PBS לשטוף ולהוסיף 0.5 מ"ל של טריפסין מחומם מראש 0.05% / EDTA. דגירת התאים למשך 3 - 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. כאשר התאים יש מעוגל למעלה, להוסיף 2 מ"ל של טרום חימם פיברובלסטים בינוני לבאר כל להפסיק trypsinization. לסלק את התאים מן היטב על ידי pipetting בעדינות tהוא בינוני על פני השטח של המנה. אסוף את השעית תא צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חרוטים.
    4. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 2 דקות. לשאוב supernatant, מחדש להשעות את התאים 2 מיליליטר טרי, בינוניים פיברובלסטים מחוממים מראש.
    5. ספירת התאים בשיטה הרצויה (hemocytometer או נגד תא אוטומטי) וזרע את כלי התרבות המוכנים מראש עם 5 x 10 4 תאים תנאים מזינים תלוי 1 x 10 5 תאי תנאים מזינים-עצמאי, לכל טוב של 6 "טוב צלחת לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך הלילה.
    6. בעקבות הדגירה לילה, לשנות את ממדיום למדיום hPSC, בינוני E8 או מדיה ממוזג iMEF, בהתאם ליישום. החלף את המדיום הישן עם מדיום חדש כל יום לאחר מכן.

3. תכנות מחדש סנדאי של תאי גזע BGO1v hOct4-GFP כתב עובריים (hESC) הנגזר פיברובלסטים משנית

  1. דרive פיברובלסטים אדם משני מקו hESC כתב BG01v hOct4-GFP לפי הנוהל שתואר לעיל 9.
  2. יומיים לפני התמרה, צלחת BGO1v / HOG נגזר פיברובלסטים לשתי בארות של צלחת 6-היטב ב -2 x 10 5 תאים לכל טוב, באמצעות פיברובלסטים בינוני.
    1. ביום של התמרה, טרום חם 2 מ"ל של פיברובלסטים בינוני עד 37 ° C.
    2. הסר קבוצה אחת של צינורות סנדאי מהאחסון -80 ° C. הסר הצלוחיות מן הכיס להפשיר צינור אחד אחד בכל פעם על ידי טבילה בתחתית הראשונה של הצינור בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 - 10 שניות, ולאחר מכן, לאפשר את הצינורות כדי להפשיר בטמפרטורת חדר. לאחר מופשר, בקצרה צנטריפוגות צינור ולמקם אותו מיד על הקרח.
    3. מוסיף את הכרכים המצוינים של כל אחד מהשלושה צינורות סנדאי (ראה CoA עבור הנפח המתאים) 2 מיליליטר של פיברובלסטים בינוניים, מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס וביסודיות לערבב פתרון ויראלי ידי pipetting למעלה ולמטה. השלם את STE הבאp בתוך 5 דקות.
      הערה: לצורך ניסוי זה, משרד פנים של 5: 5: 6 נוצלו.
    4. לשאוב פיברובלסטים בינוני מבארות פיברובלסטים להיות transduced. הוסף 1 מ"ל של ההשעיה ויראלי לכל אחד שתי בארות להיות transduced. מניח את התאים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור דגירת הלילה.
    5. לאחר דגירת הלילה, להסיר את מדיום התמרה ועושה את זה כמו שצריך (פתרון אקונומיקה 10% למשך 30 דקות). החלף כל טוב עם 2 מ"ל של מדיום פיברובלסטים מחומם מראש ולהמשיך התרבות תאים transduced.
  3. תרבות התאים למשך 6 ימים נוספים, לשנות את המדיום הישן עם פיברובלסטים בינוניים טריים בכל יום אחר.
    1. שבעה ימים שלאחר התמרו, לקצור את פיברובלסטים transduced מחדש צלחת אותם על תרבות המנות שהוכנו מראש עבור דור מושבת iPSC.
    2. לשאוב את מדיום התרבות הנורמלי מן פיברובלסטים, לשטוף את התאים פעם עם 2 מיליליטר של D-PBS.
    3. לשאוב את העקוריםBS לשטוף ולהוסיף 0.5 מ"ל של טריפסין מחומם מראש 0.05% / EDTA. דגירת התאים למשך 3 - 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. כאשר התאים יש מעוגל למעלה, להוסיף 2 מ"ל של טרום חימם פיברובלסטים בינוני לבאר כל להפסיק trypsinization. לסלק את התאים מן היטב על ידי pipetting המדיום בעדינות על פני השטח של המנה. אסוף את השעית תא צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חרוטים.
    5. צנטריפוגה התאים ב 200 x גרם במשך 2 דקות. לשאוב supernatant, מחדש להשעות את התאים כמות מתאימה של בינוני פיברובלסטים טרי, מחומם מראש.
    6. ספירת התאים בשיטה הרצויה (hemocytometer או נגד תא אוטומטי).
    7. זרעי תאי transduced בצפיפות של 1 x 10 5 תאים לכל טוב של מטריצת קרום במרתף מצופה צלחת 6 היטב דגירה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך הלילה.
  4. בעקבות דגירת הלילה, לשנות את המדיום כדי iMEF בינוני אוויר, בתוספת 10 ng / ml של FGF ב. החלף את המדיום הישן עם היומיום iMEF CM טרי לאחר מכן.
  5. שלושה שבועות לפרסם התמרה, מכאני לנתח ולהעביר המושבות הרצויות עבור שיבוטים או להשתמש לניתוח.

4. הדמיה של תא חי פיברובלסטים תכנות מחדש

  1. ניטור בזמן אמת
    1. 7 ימים שלאחר התמרה עם ערכת תכנות מחדש סנדאי, לזרוע את הכמות הרצויה של תאים על גבי צלחות 6-היטב עם מערכות בינוניות מטריקס הרצוי כפי שתואר לעיל. מניחים את מנות זרע בתוך תרמי, ממוקם בתוך חממה humidified נקבע על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    2. הגדר את תוכנת ההדמיה כדי ללכוד תמונות גם של כל אחד מבין היטב פרט במרווח סט (כל 6 - HR 8) של תמונה רציפה הלכידה עבור 14 הימים הבאים על פי הפרוטוקול של היצרן.
      הערה: הגדרות תמונה בניגוד שלב נבחרו לתכנות מחדש נורמלי להעריך התקדמות המושבה. במקרהשל BG01v / HOG נגזר תכנות מחדש פיברובלסטים, עדיף ללכוד תמונות בניגוד שלב ובערוץ פלואורסצנטי ירוק כמו הפעלה מחדש של הכתב Oct4-GFP אנדוגני ניתן לעקוב לאורך כל תהליך תכנות מחדש.
    3. שינוי המדיום יומי, זה יכול להיות בינוני hPSC, בינוני E8, או iMEF-CM, תלוי בניסוי, כפי שתואר לעיל מ יום 8 כדי 21 שלאחר התמר. הבארות ניתן לבצע עיבוד נוסף עבור היווצרות המושבה באמצעות immunofluorescence עקיפה.
    4. בסוף הניסוי ביום 19 עד 21, להסיר את מדיום התרבות מכל טוב להיות נחקר עם נוגדנים פיברובלסטים גזע סמני תא של בחירה.
    5. לשטוף היטב כל פעם עם 2 מ"ל של מדיום מראש חימם DMEM / F-12.
    6. הכן aliquots של כל זוגות נוגדן ראשוני חיובי / שלילי 1 מ"ל של מדיום DMEM / F-12 כדלקמן: SSEA4 אנטי עכבר (1: 200) ו CD44 אנטי עכברוש (1:50), אנטי עכבר TRA-1- 60 (1: 200) ו CD44 אנטי עכברוש (1:50), אלקליין פוספטאז Live כתם (1:50) ו CD44 אנטי עכברוש (1:50). הוסף 1 פתרונות הנוגדן ראשונים מיליליטר לכל מקביל היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
    7. לשאוב את הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף פעמיים עם מדיום מראש חימם DMEM / F-12.
    8. הכן פתרונות נוגדנים משני (1 מיליליטר לכל היטב) באמצעות עזים אנטי עכבר אלקסה פלואוריד 488 משני מצומדות (1: 500) על קרינה ירוקה-עכברוש עז אנטי Alexa פלואוריד 594 משני מצומדות (1: 500) על קרינה אדומה DMEM / בינוני F-12. הוסף היטב כל לאחר השטיפה של הדבר. דגירת הנוגדנים משני למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: בשל אלקליין phosphatase Live של הכתם (APLS) אות חולפת, הדגירה העיקרית אנטי CD44 צריכה להתבצע תחילה על ידי עצם ואת APLS יש להוסיף בעת הדגירה עם נוגדנים משני
    9. לאחר דגירה נוגדנים משני, לשאוב את הפתרון ולשטוף פעמיים עם DMEM / בינוני F-12. הוסף DMEM מראש חימם טרי / F-12בינוני זה טוב לפני לכידת תמונה סופית.
    10. הגדר את התוכנה תרמי לרכוש תמונות גם של כל אחד מבין היטב באמצעות כל שלושת הפרמטרים סריקה: בניגוד שלב, פלואורסצנטי ירוק אדום פלואורסצנטי. יצירת תמונות בהגדלה שונה וליצור זמן לשגות סרטים עם התוכנה לניטור צמיחת ביטוי סמן. השתמש הפרוטוקול של היצרן.
    11. ניצול תוכנת ניתוח, להעריך מפגש של זמן מעל היטב בניגוד שלב וביחידות פלואורסצנטי ירוק עבור תכנות מחדש BG01v / HOG.
  2. ניטור שטח פני התא סמנים באמצעות ביניים Reprogramming
    1. מעקב אחר אירועי תכנות מחדש בנקודות זמן שונות על ידי חיטוט מנות תכנות מחדש בנקודות זמן שונות עם נוגדנים כנגד סמנים שליליים חיוביים / תאי גזע שונים על מנת לפקח על תהליך תכנות מחדש. תרבויות Probe כל 2 עד 3 ימים בהתאם לזמינות של משכפל. לחקור את דיס תכנות מחדשהס ב יום 19 עד 21 באמצעות האסטרטגיה המכתימה הכפולה לזהות מושבות iPSC לתכנות מחדש באופן מלא מושבות לתכנות מחדש באופן חלקי על בסיס דפוסי המכתים.
    2. בנקודת הזמן הרצויה, לשאוב את מדיום הצמיחה הנורמלי מכל טוב להיות נחקר עם נוגדני הסמנים של בחירה.
    3. לשטוף היטב כל פעם עם 2 מ"ל של מדיום מראש חימם DMEM / F-12.
    4. הכן aliquots של כל זוגות נוגדן ראשוני חיובי / שלילי 1 מ"ל של מדיום DMEM / F-12 כדלקמן: SSEA4 מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1: 200), TRA-1-60 מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1: 50), הכתם חי אלקליין (1: 500), CD24 מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1:50), B2M מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1:50), EpCAM מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1:50) העכבר, CD73 (1: 100) אשר נחקר עם נוגדנים משני אנטי עכבר מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1: 500), ו CD44 חולדה (1:50) אשר נחקר עםנוגדנים משני אנטי עכברוש מצומדות כדי fluorophore הניאון האדום (1: 500). הוסף 1 פתרונות הנוגדן ראשונים מיליליטר לכל מקביל היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
    5. לשאוב את הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף פעמיים עם מדיום מראש חימם DMEM / F12.
    6. עבור נוגדני unconjugated, להמשיך בשיטת 2-צעד בהכנת פתרונות נוגדנים משני המתאימים דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. ודא נוגדנים משני הם למארחים הראשיים ולא לחצות להגיב. בצע שלבים לשטוף נוספים כפי שתואר לעיל.
    7. אחרי הכל שוטף המתאים, להוסיף מראש חימם טרי DMEM / F-12 בינוני זה טוב לפני לכידת התמונה הסופית.
    8. ללכוד את התמונות פלורסנט תחת המסנן המתאים בהגדלת 100X באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולנתח את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח זמינה.

מדידת 5. של קינטיקס תכנות מחדש באמצעות זרימת Cytometry

  1. מדידה קינטי כמותי של תכנות מחדש באמצעות נוגדנים פני התא
    1. לפני תכנות מחדש, להגדיר את המספר המתאים של ניסויי תכנות מחדש עבור כל נקודת זמן. למדידת קינטיקה של תכנות מחדש של תכנות מחדש 7 ימים הראשונים, transductions הפרט מבוצע עבור כל נקודת זמן רצויה. לקבלת מועדים לפי שעון לאחר יום 7, זרע נקודות זמן מספיק עצמאי מזין להמשיך למדוד את אירועי תכנות מחדש. באר אחד של צלחת 6-גם תניב כמויות מספיקות של תאים לביצוע ניתוח תזרים cytometry.
    2. מדוד בכל נקודות זמן תכנות מחדש הרצויות מתוך בארות בודדות, כפי מדובר assay נקודת סיום. לשאוב את פיברובלסטים בינוני מן הרצוי היטב. שטפי פעם עם D-PBS.
    3. לשאוב את לשטוף D-PBS. הוסף 1 מ"ל של תמיסת 0.05% טריפסין-EDTA אל הבאר כדי להיבדק. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    4. לאחר הדגירה, dissociאכלו את התאים לתוך תאים בודדים ידי שטיפה ההשעיה תא 1 מ"ל נגד פני השטח של הבאר ולהעביר את ההשעיה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. השתמש 3 מ"ל של D-PBS לשטוף את כל התאים הנותרים מהבאר ולהוסיף אותם אל חרוטי 15 מ"ל. השתמש 10 מיליליטר של D-PBS הנוספת כדי לדלל את תמיסת תא נוסף בצינור החרוטים.
    5. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 2 דקות. לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה לתוך 1 מ"ל של מדיום DMEM / F-12. בצעו ספירת תאים לפי הצורך כדי ליצור ההשעיה תא סטנדרטי כי הוא פחות מ 1 x 10 6 תאים / מ"ל.
    6. כן aliquot כל נוגדנים חיוביים / שליליים ישירות מצומדות בחירה 1 מיליליטר של מדיום DMEM / F-12 עבור פחות 1 x 10 מיליליטר 6 תאים / באמצעות השילובים הבאים: SSEA4 מצומדות כדי fluorophore פלואורסצנטי ירוק (1: 200) עם CD44 מצומדות כדי PE-Cy5, או CD44 מצומדות כדי fluorophore ניאון ירוק SSEA4 מצומדות כדי fluorophore fluorescing אדום לכת. לִדגוֹרהנוגדנים עם ההשעיה תא במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. לשאוב את הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף פעמיים עם מדיום מראש חימם DMEM / F-12.
    8. לשאוב לשטוף הסופי מחדש להשעות את התא גלולה ב 1 מ"ל של D-PBS. Pipet את התוכן של כל השעיה צינורות FACS הפרט.
    9. באמצעות הפקדים השליליים המתאימים (שולט בלא כתם אלוטיפ), לאשר את הפיזור קדימה וצד נכון הפרופיל ומתחים על cytometer. הגדר את המתחים עבור fluorophores המתאים על פי פרמטרים כתמים יחיד ראשוניים, כך fluorophores הירוק מופעלים על ידי הליזר הכחול האותות רכשו בערוץ BL1, בעוד fluorophore fluorescing האדום רחוק fluorophore PE-Cy5 מופעלים על ידי הליזר האדום אותות רכשו בערוץ RL1. רוכש את האוכלוסייה הכפולה מוכתם עבור כל נקודת זמן.
    10. לנתח את קבצי FCS עבור כל נקודת זמן באמצעות תוכנת ניתוח המתאים ולהשתמש לעורך ערהנתוני nge לקיים את משמרת ביטוי אוכלוסייה לאורך זמן.
    11. בצע את שלבי 5.1.1 כדי 5.1.6, אם מיון תא הוא רצוי בנקודות זמן שונות. השתמש שילובים fluorophore המתאים בהתאם לתצורת לייזר של סדרן התא כדי לשמש.
    12. בעקבות לשטוף הסופי, מחדש להשעות את התא גלולה ב 1 מ"ל של חיץ מיון התא. הגדרת סדרן תא פיזור קדימה וצד הנכון ההגדרות באמצעות פקד בלא כתם. השתמש בפקדים צבעוניים אחת להגדיר את ההגדרות המתאימות עבור כל fluorophore.
    13. השתמש מדגם קטן של השעית התא הכפולה מוכתם; לבחור את 2 האוכלוסיות להיות מסודרות ולהקצות את המטען המתאים כדי להבטיח אוסף התקין של התאים הממוינים.
    14. הוסף 200 μl של מדיום התאוששות תא לתוך הצינורות האוספים כדי להבטיח כי השעית התא המסודרת מרופדת ומוגנת בעת מיון. קציר את מספר הרצון של תאי ולהעביר על מנות iMEF חדשות המכילות טריly מוכן בינוני התאוששות.
    15. שינוי המדיום הבא הדגרתי לילה עם מדיום ההתאוששות. התרבויות חייבות להיות מוזן מכן ובאופן שגרתי passaged באמצעות מדיום hPSC המכיל פניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / ריכוז סופי מיליליטר).

6. ניתוח Endpoint

  1. Terminal אלקליין phosphatase (AP) מכתים
    1. השתמש מכתים AP chromogenic מסוף לתאם אירועים הקינטית מורפולוגיים הנצפית עם יעילות תכנות מחדש הסופי.
    2. בעקבות 21 ימים של תכנות מחדש, להסיר את המדיום תרבות מהבאר להיות מוכתם בכתם מסוף AP ולשטוף פעם עם 200 mM Tris-HCl (pH 8.0).
    3. הכן את הכמות המתאימה של פתרון מכתים כפי שיורה במדריך של היצרן ב 200 mM Tris-HCl.
    4. לשאוב לשטוף ולהוסיף 2 מ"ל של הפתרון מכתים מוכן היטב כל אחד. דגירה במשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר, הרחק האור הדואר.
    5. לשאוב את הפתרון מכתים ולשטוף פעם עם 200 מ"מ טריס HCl. הסר לשטוף ולהוסיף מים מזוקקים לפני להדמיה.
    6. ללכוד את אות colorimetric באמצעות מצלמה בשידורים רגילה. ספירת מושבות מוכתמות חיובי ביד. דמיינו את הכתם באמצעות ניתוח פלורסנט בערוץ טריט-C, כמו הכתם הוא גם פלורסנט בטבע ולבצע הדמיה כולו היטב ונותחו באמצעות תרמי היטב כולו. השתמש הפרוטוקול של היצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניטור קינטיקס Reprogramming שימוש cytometry זרימה

CD44 הוא סמן פיברובלסטים בעוד SSEA4 הוא סמן PSC 6,10. כצפוי מדפוס הביטוי הזה, cytometry זרימה של ב"ג פיברובלסטים מראה SSEA4 - CD44 + האוכלוסייה המאפשרת יצירת שערים ברבע בשילוב עם מדגם בלא כתם. במהלך תכנות מחדש של פיברובלסטים DF1 עם וירוסים סנדאי, CD44 ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מספק אסטרטגיות לניטור ומעקב אחר תהליך התכנות מחדש באמצעות ציטומטריית זרימה וניתוח מבוסס הדמיה בזמן אמת. השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם התחלת תכנות מחדש, מדידת התקדמות תכנות מחדש על סמך ביטוי סמן וניטור בזמן אמת של תכנות מחדש. ניתן להשתמש בכל שיטת תכנות מחדש לבחירה, אך כאן אנו מתמקדים בתכנות מחדש מבוסס סנדאי של פיברובלסטים אנושיים. היתרון בשיטה זו הוא קלות השימוש והיעילות הגבוהה העקבית של תכנות מחדש.

כדי להעריך את התקדמות התכנות מחדש, תאים נקצרים בשלבים נפרדים של תכנות מחדש ונתונים לניתו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים [RHQ, JSTA, KS, ו UL] הם עובדי תרמו פישר סיינטיפיק, אשר מייצרת חלק ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

תודות

המחברים מודים צ'אד מקארתור לדיונים מועילים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEM, גלוקוז גבוה, GlutaMAXSupplement, פירובטתרמו פישר סיינטיפיק10569-010
סרום בקר עוברי, מוסמך לתאי גזע עובריים, ממקור ארה"בThermo Fisher Scientific16141-061
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)Thermo Fisher Scientific11140-050
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום Thermo Fisher Scientific25300-054
עכבר (ICR) פיברובלסטים עובריים מומתיםThermo Fisher ScientificA24903
חלבון גורם התקשרות (1x)Thermo Fisher ScientificS-006-100
DMEM/F-12, תוסף GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565-018
החלפת סרום נוקאאוטThermo Fisher Scientific
2-מרקפטואתנול (55 מ"מ)Thermo Fisher Scientific21985-023
קולגנאז, סוג IV, אבקהThermo Fisher Scientific17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x), ללא פנול אדום תרמו פישר סיינטיפיק12563-011
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום Thermo Fisher Scientific14190-144
Geltrex LDEV-Free, מוסמך hESC, גורם גדילה מופחת מטריצת ממברנת מרתףThermo Fisher ScientificA1413302
Essential 8Medium Thermo Fisher ScientificA1517001
FGF-Basic (AA 1-155) חלבון אנושי רקומביננטיThermo Fisher ScientificPHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0תרמו פישר סיינטיפיק15575-020
אלבומין בקר שבר V (תמיסה של 7.5%)תרמו פישר סיינטיפיק15260-037
HEPES (1 מ')תרמו פישר סיינטיפיק15630-080
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/מ"ל)תרמו פישר סיינטיפיק15140-122
InSolution Y-27632EMD Millipore688001
ערכת תכנות מחדש של CytoTune-iPS SendaiThermo Fisher ScientificA1378001
CytoTune-iPS 2.0 ערכת תכנות מחדש של SendaiThermo Fisher ScientificA16517
Countess II מונה תאים אוטומטיThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Countess תא ספירת תאים שקופיותThermo Fisher ScientificC10228
BJ ATCC פיברובלסטים של עורלה אנושית, יילודיםATCCCRL-2522
DF1 פיברובלסטים עוריים אנושיים למבוגריםתרמו פישר מדעיN/A
BG01V/hOG תאים וריאנט hESC hOct4-GFP תאי דיווחThermo Fisher ScientificR7799-105
IncuCyte ZOOMEssen BioScience
SSEA-4 נוגדן, מצומד Alexa Fluor 647 (MC813-70)Thermo Fisher ScientificSSEA421
נוגדן SSEA-4, מצומד Alexa Fluor 488 (eBioMC-813-70 (MC-813-70))Thermo Fisher ScientificA14810
SSEA-4 נוגדן (MC813-70)Thermo Fisher Scientific41-4000
TRA-1-60 נוגדן (cl.A)Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 חולדה אנטי-אדם/עכבר mAb (שיבוט IM7), PE-Cy5 מצומדThermo Fisher ScientificA27094
CD44 Alexa Fluor 488 ערכה מצומדת להדמיית תאים חייםThermo Fisher ScientificA25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7)Thermo Fisher ScientificRM-5700 (כבר לא זמין)
נוגדן משני IgG (H+L) נגד עכבר עיזים, Alexa Fluor 488 מצומדThermo Fisher Scientific  A-11029
נוגדן משני נגד חולדות IgG (H+L), Alexa Fluor 594 מצומדThermo Fisher Scientific  A-11007
אלקליין פוספטאז כתם חיThermo Fisher ScientificA14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 ערכת מצומד להדמיית תאים חייםThermo Fisher ScientificA25618
CD24 עכבר אנטי-אנושי mAb (שיבוט SN3), FITC מצומדThermo Fisher ScientificMHCD2401
נוגדן מיקרוגלובולין בטא-2, מצומד FITC (B2M-01)Thermo Fisher נוגדן מדעיA15737
EpCAM / CD326, מצומד FITC (VU-1D9)נוגדן Thermo Fisher ScientificA15755
CD73 / NT5E (7G2)Thermo Fisher Scientific41-0200
VECTOR ערכת מצע פוספטאז אלקליין אדום (AP)מעבדות וקטורSK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 מיקרוסקופ Carl Zeiss491912-0003-000
תוכנת ניתוח נתונים FlowJoFLOJO, LLCN/A
Attune Accoustic Focus Cytometer, לייזר כחול/אדוםThermo Fisher שימוש מדעיAttune NXT 
S3e\ סדרן תאים (488/561 ננומטר)BIO-RAD1451006
פלקון 12 x 75 מ"מ שפופרת עם מכסה מסננת תאים352235
פלקון 15 מ"ל, מכסה בורג אטום כיפה בבהירות גבוההקורנינג352097
פלקון T-75 353136
פלקון T-175353112
פלקון צלחת 6 בארותקורנינג353046
Heraeus Heracell CO2 חממה מתגלגלתתרמו פישר סיינטיפיק51013669
נון-סטיק, צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"לAM12450
HulaMixer מיקסר15920D
10828010 לדוגמא

מקורות

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  2. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  3. Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834(2010).
  4. Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
  5. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  6. Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419(2014).
  7. Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
  8. Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728(2014).
  9. Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
  10. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
  11. Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
  12. Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
  13. Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
  14. Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
  15. Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
  16. Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הפקת iPSCציטומטריית זרימהדימוי בזמן אמתסממנים על פני השטח של התאקינטיקה של תכנות מחדשתכנות מחדש של פיברובלסטיםמדידת התלכדותצביעה בנוגדניםדימוי תאים חיים
מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.