Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

סיכום

פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי של צעדים renoprotective.

תקציר

הכליות הן רגישות לפגוע מחשיפה לכימיקלים שהם לסנן ממחזור הדם. זה יכול להוביל לפציעת איבר הקשורים ירידה מהירה בתפקוד הכלייתי ופיתוח של התסמונת הקלינית המכונית אי-ספיקת כליות חריפה (AKI). סוכנים תרופתיים המשמשים לטיפול נסיבות רפואיות החל זיהום חיידקים לסרטן, כאשר מנוהלים בנפרד או בשילוב עם תרופות אחרות, יכולים ליזום AKI. דג זברה היא מודל חיה כדאי ללמוד את ההשפעות הכימיות על תפקוד כלייתי in vivo, כפי שהם יוצרים כליה עוברית המורכבת מיחידות פונקציונליות נפרון כי הם משומרים עם חוליות גבוהות, כולל בני אדם. יתר על כן, דג זברה יכול להיות מנוצל כדי לבצע מסך גנטי וכימי, המספק הזדמנויות להבהיר את ההיבטים התאיים ומולקולריים של AKI ולפתח אסטרטגיות טיפוליות כגון זיהוי של מולקולות כליה. הנה, אנחנו מדגימים microinjection איך לתוךעובר דג זברה יכול להיות מנוצל כפרדיגמה מחקרי nephrotoxin.

מבוא

AKI הוא אובדן פתאומי של בתפקוד הכליות, אשר יכול להוביל לתוצאות הרסניות לבריאות ^1. AKI הוא נושא בריאות משמעותי ברחבי העולם בשל שכיחותה הגבוהה של כ -20% בקרב חולים מאושפזים, עם אף גבוהים יותר שיעורים 30-50% במקרים בטיפול נמרצים והקשישים, ושיעורי תמותה של 50-70% ^1-3. למרבה הצער, השכיחות של AKI גדלה והוא צפוי להסלים עוד יותר בעשור הקרוב, בין שאר כתוצאת המגוון של גורמים שיכולים לגרום AKI, הכולל שלאחר ניתוח מתח, איסכמיה, וחשיפת nephrotoxins כגון אנטיביוטיקה תרופות כימותרפיות ^4.

AKI כרוך ניזק לתאים פתאומי בתוך הכליה, שכיח ב nephrons, שהן היחידות הפונקציונליות החיוניות, והם מורכבים של מסנן דם וכן אבובית מפולחת המנקזת שתנו לתוך צינוריות איסוף מרכזיות ^1. כאשר מספר לא מבוטל של nephrons הואניזוק במהלך AKI, ההשפעות המיידיות כוללות הפרעה בסילוק פסולת מהמחזור, ואת זרימת נוזל מופחת או בוטלו באמצעות nephrons עקב חסימה מתאי מתים וגוססים ^1. במשך הזמן, חסימה צינורי יכול להוביל לניוון של nephrons כולו, אשר מפחית ¹ תפקוד כלייתי לצמיתות. שינויים פיסיולוגיים הכליה הבאה AKI גם הקשורות בתופעות דלקתיות מורכבות שיכולים להוביל צלקות כרוניות ^1.

למרות התוצאות הללו, nephrons יש כמה היכולת לעבור התחדשות לאחר AKI כי reconstitutes ^5,6 אפיתל צינורי. אמנם יש כבר הבנה מולקולרית גדל והולך של התחדשות נפרון, המנגנונים להישאר חמקמקה לגבי רבים מחייבים המשך חקירה ^7. המידה שבה AKI גורם לנזק כלייתי קבע גם נותר עלום. המחקר הנוכחי מצביע על פוטנציאל ההתחדשות עבור הכליה הואגבוה ביותר בעקבות מקרים חמורים פחות של AKI, בעוד יותר פרקים בולטים או חוזרים להוביל מחלת כליות כרונית (CKD) ותסתיים ב סופנית מחלת כליות (ESRD) הדורש השתלת מצילות חיים או דיאליזה ^8,9. בנוסף, אנשים שכבר סובלים CKD נמצאים בסיכון גבוה עוד יותר להידבקות פרק חמור של AKI ^8,9. יחדיו, ברור שהמשך מחקר בסיסי וקליני חיוני להבין, לטפל ולמנוע AKI.

מחקר במודלים של בעלי חיים כבר סייע להעריך את ההתקדמות של שינויים מקומיים וסביבתיים המתרחשים במהלך AKI ^10. כדי להרחיב את ההבנה הזאת, כמו גם לפתח טיפולים חדשים, במודל חיה דג הזברה כבר המועסקים במגוון דרכים ^11,12. Nephrons של הכליה דג הזברה, בשני העובר מבוגר, להציג רמה גבוהה של שימור עם יונקים ^13-16. יתר על כן, פגיעה אפיתל נפרון ב zebrafish דומה לתהליך חוליות גבוהות, לפיה ההרס המקומי של תאים צינורי ואחריו התפשטות intratubular ואת הקמתה מחדש של נפרון אדריכלות ^17-19. בעובר, אולם ניזק אבובית נרחב מן nephrotoxins כמו ציספלטין קשור קטלני ^20,21. לשם השוואה, מבוגרי דג זברה לשרוד AKI ולהציג יכולות משובים מהותיות הכליות. כך למשל, בעקבות החשיפה גנטמיצין אנטיביוטי aminoglycoside, דג הזברה להתחדש נזק אפיתל אבובית ולגדול יחידות נפרון חדשים וכן ^22-24. בעוד גנטמיצין הנגרמת אלה מחקרים AKI סיפקו מידע שלא יסולא בפז, להבנת נזק כלייתי מ nephrotoxins מגוונים נותר קריטי להעריך את ההשפעות בתגובה סוגים שונים של נזק ^25.

עובר דג הזברה, בשל גודלו, שקיפות עקיבות גנטיות, יש יתרונות רבים ללימודי nephrotoxin ^{25, שבהם השיטה של microinjection 20,21 משמשת לניהול המולקולה (ים) לחקירה. Nephrons נוצרות על ידי הפריה 24 שעות שלאחר (hpf) ומתחילים לסנן דם בכ 48 hpf 26,27. לפיכך, ההיווצרות המהירה והתפקוד של הכליה העוברית מאפשרים ניתוח הניסיון. עם זאת, תהליך של microinjection יש אתגרים טכניים ויש יכול להיות עקומת למידה תלולה מאסטרינג טכניקה. במאמר זה וידאו, אנו מתארים כיצד לבצע microinjections ולספק עצות לפתרון בעיות כדי להגביר את שיעור זריקות מוצלחות.}

פרוטוקול

הנהלים לעבודה עם עוברי דג הזברה המתוארת פרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת נוטרדאם.

1. הכנת פתרונות

1. הכן פתרון מניות 50x של התקשורת העובר E3 על ידי ערבוב 73.0 גרם NaCl, 3.15 גרם KCl, 9.15 גרם CaCl _2, ו 9.95 גרם MgSO ₄ ב 5 ליטר של מים מזוקקים, ולאחסן ב RT.
2. עבור culturing של עוברי דג זברה, לדלל את תמיסת 50x המלאה של תקשורת עובר E3 לפתרון עובד 1x עם מים מזוקקים, ולאחר מכן להוסיף 200 μl של מתילן כחול 0.05% לכל 1 ליטר של 1x E3 לפעול כמו פטריות, ולאחסן ב RT.
3. בצע פתרון חסימת פיגמנטציה של התקשורת העובר E3 עם 0.003% 1-פניל-2-thiourea (PTU) על ידי שילוב 40 מ"ל של המניה 50x E3 עם 0.06 מ"ג PTU. ואז להביא את הנפח לסך של 2 ליטר עם מים מזוקקים.
4. מערבבים את O E3 / PTU / N ב RT כדי לקבל את אבקת PTU אל הפתרון. ואז לאחסן את E3 / PTU בRT.
   הערה: E3 / PTU יש חיי מדף של כשבוע, ופתרונות ישנים יהיו פחות יעילים חסימת פיתוח פיגמנטציה זחלי דג זברה.
5. תן ההרדמה של 0.2% Tricaine (MS-222) על ידי הוספת 1 גרם של Tricaine 500 מ"ל מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל 7.2 עם 1 M טריס, pH 9.5.
6. הכן לבצע פתרון methylcellulose 2% עבור הדמיה על ידי הצבת פתרון של E3 1x (לא מתילן כחול), עם 1/10 נפח ^ה של 0.2% Tricaine הוסיף ב 4 ° C..
   הערה: פתרון methylcellulose הוא פתרון עבה, ברור כי משמש כדי לייצב עובר לחיות בעדינות במיקרוסקופ. לאחר המניפולציות מבוצעות העוברים ניתן לכבס ב 1x E3 לפזר את methylcellulose מבלי לפצוע את החיה ולאפשר מיקרוסקופיה בשלבים הבאים באותה הדגימה.
7. כאשר מקורר 4 ° C, ומערבבים הפתרון 1x E3 / Tricaine במרץ בצלחת ומערבבים ומוסיפים בהדרגה את הכמות המתאימה של מתילאבקת תאית תוך המשך לבחוש במרץ. מוסיפים בהדרגה את אבקת הפתרון למנוע היווצרות של אגרגטים methylcellulose מסיס.
8. אחרי הכל את האבקה מערבבת לתוך תמיסת 2% methylcellulose / E3 / tricaine, מערבבי הפתרון המשולב בחדר הקר ° C 4 O / N.
   ההערה: הטמפרטורה הקרה היא טובה ביותר עבור המסת האבקה מלאה. אם הפתרון אינו ברור לאחר לילה אחד, ומערבבים במשך יום עבודה נוסף ו / או O השני / N.
9. כדי להסיר בועות אוויר מן methylcellulose 2% / E3 / tricaine פתרון, aliquot את התערובת לתוך צינורות 1.5 מ"ל ספין במהירות גבוהה (12,000 XG) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או עד 2 שעות.
10. מניחים את פתרון 2% methylcellulose / E3 / Tricaine ב 4 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
    הערה: לפני השימוש, aliquots צריך להיות מחומם מראש ל RT לעבודה עם דגימות דג הזברה.

2. הכנת כלים

1. כן כלי מניפולטור העובר, המשמש positioning עובר microinjection, על ידי הצמדת טיפ טעינת ג'ל על קצה מחט לנתח 5 "ישר, ובטוח עם קלטת או דבק מגע.
2. כן מחטי microinjection באמצעות חולץ מחט, על ידי הנחת ראשון אש מלוטשת 10 זכוכית בורוסיליקט סנטימטר עם נימה לתוך המכשיר ולאבטח את הזכוכית בורוסיליקט ידי הידוק הידיות.
3. משוך את זכוכית בורוסיליקט לעצב מחטים דקות-מחודדות. השתמש בהגדרות הבאות: מחממים 540, למשוך 245, מהירות 200, וזמן 125.
4. מחטי מקום בתוך צלחת פטרי, השעיית אותם על רצועת פלסטלינה כדי להגן על טיפי מחט, ולשמור את הכלי הסגור למניעת הצטברות אבק.
5. כדי לסיים להכין את המחט עבור microinjections, להשתמש בסכין גילוח או מלקחיים בסדר קצה לחתוך את קצה משך של המחט כדי ליצור טיפ הזרקת זוויתי חד בקוטר של כ 0.05-0.1 מ"מ.
6. כדי להפוך את מגש microinjection, להכין פתרון 1.5% agarose / E3 בתוך 100 מ"ל בבקבוק Erlenmeyer ו לפזר את agarose על ידי חימום E3 לרתיחה במיקרוגל ואז להתקרר ב RT במשך כ -10 דקות.
7. יוצקים את הפתרון agarose / E3 מקורר לתוך צלחת פטרי כדי להפוך בסיס עם עומק של כ -0.5 ס"מ. כאשר זה יש הקרושה לשפוך שכבה שנייה עם עומק של כ 0.3 סנטימטרים ולהכניס את התבנית היטב עובר הטרומית ולאפשר agarose כדי לחזק ב RT.
   הערה: כאשר מכניסים את התבנית לתוך השכבה אגר העליון / E3, הצבת את התבנית לתוך אגר בזווית כדי להקטין את מספר בועות אוויר.
8. כאשר מגש microinjection כולו קבע, להרים את העובר הטרומי גם לעצב לאט ובזהירות באמצעות scoopula, ולאחר מכן למלא את המנה עם פתרון ולאחסן E3 על 4 מעלות צלזיוס.

3. עובר כנה

1. הגדרת טנקי הזדווגות דג זברה על ידי הצבת מחיצות לתאי הזדווגות וממלאת במי מערכת.
2. מניחים דג אחד בכל צד של המחיצה שלuch כי כל תא מכיל הזדווגות נקבה אחד ודגי זכר אחד, ומכסה כל תא הזדווגות.
3. למחרת בבוקר, להסיר את המחיצות כדי לאפשר השרצה.
4. בדוק את הדגים לאחר כ -30 דקות, ולאחר חזרת המבוגרים לאקווריום, לאסוף העוברים שלהם על ידי העברת מי טנק הזדווגות באמצעות כלי מסננת מתכת-רשת בסדר.
5. הפוך את המסננת מעל צלחת פטרי ולשטוף עם E3 לאסוף את העוברים.
6. דגירה עוברים על 28.5 ° CO / N.
7. כאשר עוברים הגיעו 24-26 somite שלב ^26, למזוג רוב כלי התקשורת E3 ואז dechorionate על ידי הוספת 100 μl של 50 מ"ג / מ"ל pronase על כל מנה של עוברים דוגרים צלחת ב RT (23 מעלות צלזיוס) במשך כ 15 דקות.
   הערה: זה ייקח כ 24-25 שעות מרגע הפריה כלפי העובר להגיע לשלב 24-26 somite אם הם נאספים באופן מתואר וטופח O / N ב 28.5 מעלות צלזיוס.
8. מלאו את הצלחת עםE3 ולאחר מכן מערבולת בעדינות כדי לסלק את chorions מן העוברים.
9. למזוג E3 / pronase ולשטוף את המנה עם 25 מיליליטר של E3 הטרי. צעד לשטוף חזור להסיר את כל pronase.
10. כדי לעצור התפתחות פיגמנטציה, למזוג E3 ולהחליף עם 25 מ"ל של טרי E3 / PTU כאשר עוברים הגיעו 24 שעות שלאחר ההפריה.
    הערה: בניסויים פורשים כמה ימים, להחליף את פתרון E3 / PTU עם תקשורת טריה פעם ביום כדי לשמור על הצלחת נקיה.

4. Microinjection של פתרון Nephrotoxin

1. ביום הזרקה, להכין את פתרון nephrotoxin הרצויה יחד עם השליטה ברכב המתאימה.
2. וורטקס או ומערבבים בעדינות כדי להבטיח את התרופה (ים) הוא / הם בתמיסה, בדיקת צידי הצינור העליון של עמודת המים.
   הערה: פתרונות Nephrotoxin ניתן להכין להכיל כמויות זעירות של dextran מצומדות fluorescently לפקח יעילות microinjection וגם להעריך פינוי כלייתי ב subseqזמן uent מצביע ^20,28.
3. טען מחט microinjection גזוז עם ~ 2-3 μl של nephrotoxin ידי השחלה טיפ טעינת ג'ל בסדר לחלק האחורי של המחט להשעות את המחט בצורה אנכית עם חתיכת סרט לאפשר הפתרון למלא את קצה המחט גזוז על ידי כוח הכבידה.
4. ברגע שקצה המחט מלא, לאבטח את המחט הטעונה micromanipulator.
5. בדוק את נפח microinjection ידי הצבת טיפה של שמן מינרלי לשקופית מיקרומטר ולהזריק לתוך השמן כדי להעריך את גודל טיפה. נפח הזרקה של 500 pl בעל קוטר של 0.1 מ"מ.
6. מוציאים את המאפה של עוברים מן החממה, להרדים ידי הוספת כ 5 מ"ל של Tricaine 0.2% כדי בצלחת העובר.
7. כדי להבטיח הרדמה מלאה, לגעת העובר בעדינות עם קצה של כלי מניפולטור העובר. חוסר התנועה מצביע הרדמה מספיק.
8. לאחר הרדמה מוצלחת, להעביר עובר אל עובש ההזרקה עם transfפיפטה אה.
9. לתמרן כל עובר לתוך באר שונה של עובש נחת הראש באזור העמוק ביותר של כאלה היטב כי המטען נח לאורך השקע ואת הזנב מזדקר אל מחוץ למיתון.
10. הכנס את המחט המלאה לתוך micromanipulator ומקם את קצה המחט ליד עובר.
11. הכנס בעדינות את המחט לתוך כלי הזנב על ידי הזזת הג'ויסטיק קדימה על דוושת הרגל כדי לספק את microinjection.
    הערה: זריקה מוצלחת תעיד על ידי צפייה הנוזל להיכנס במחזור. יתר על כן, שיתוף הזרקה של nephrotoxicant עם dextran מצומדות fluorescently מאפשרת לחוקר לאמת זריקה מוצלחת לאחר ההליך.
12. משוך בעדינות בחזרה על הג'ויסטיק כדי להוציא את המחט מן העובר.
13. לאחר הזרקה, להעביר את העוברים כדי בצלחת נקיה ולשטוף להסיר את Tricaine ולהחליף עם E3 טרי / PTU.
14. דגירה העובר לנקודת הזמן הרצוי כדי ישבניםמורפולוגיה של, אשר יכול להיות מתועד על ידי צילום תקשורת הרכבת methylcellulose, או תהליך לניתוח הניסיון כרצונכם.
    הערה: שחזור של עוברים יש לבחון כדי לקבוע את אחוז האנשים עם בצקת, אשר מציינת פגיעת כלייתית נפוצה.

תוצאות

תחנת microinjection להגדיר כולל סטראו, micromanipulator ו ווסת לחץ (איור 1 א). שקוף של צלחת ההזרקה עדיפה להציג דגימות במהלך הליך זה (איור 1 ב). הכנת מחט הזריקה כרוכה משייכת הזכוכית בורוסיליקט המתאימה, ולאחריו הכנת הקצה עם חיתוך ולבסוף חזרה טעינה את המחט. באופן אופטימלי, קצה המחט הוא משופע ולא להקהות (התרשים 1C), חתך כי נעשה על ידי לדוג הקצה חד של מכשיר החיתוך, כגון מלקחיים בסדר, במהלך הליך החיתוך <...

דיון

מספר רחב של סוכנים טיפוליים קושר עם AKI ^29. היו מקדמות מחקר משמעותי בהבנת הנזק הנגרמת על ידי תרכובות בודדים רבים, כגון גנטמיצין aminoglycoside ³⁰ ו ציספלטין כימותרפיות בשימוש נרחב ^31,32. שינויים פתולוגיים מסוימים מעורבים בתנאים אלה, עם זאת, להישאר בנושא של מחקר מתמשך. אתגר המתהווה אחת נותר הבנה כיצד תרופות מרובות להשפיע לרעה חולה, במיוחד אלה באוכלוסיות בסיכון גבוה כגון אלה במסגרות טיפול נמרצות ואת ²⁹ הקשישים. לפיכך, מודלים המאפשרים מחקרי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן כלורי	AB01915		ביואנליטי אמריקאי
אשלגן כלורי	AB01652		ביואנליטי אמריקאי
סידן כלוריד	AB00366		ביואנליטי אמריקאי
N-פנילתיאוריאה (PTU)	Aldrich Chemistry	P7629
אתיל 3-אמינובנזואט (טריקאין)	פלוקה אנליטי	A5040
זכוכית בורוסיליקט	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
חולץ מיקרופיפטה בוער/חום	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
מגנזיום גופרתי	Sigma-Aldrich	M7506
מתילן כחול	סיגמא-אולדריץ'	M9140
פלקון צלחות פטרי חד פעמיות, סטרילי, קורנינג:
60 מ"מ x 15 מ"מ	VWR	25373-085
100 מ"מ x 15 מ"מ	VWR	ברקוד 25373-100
( מגש מיקרו-הזרקה) 150 מ"מ x 15 מ"מ	VWR	25373-187
אינקובטור בטמפרטורה נמוכה	Fischer Scientific	11 690 516DQ
מיקרו ניתוח פינצטה	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
מיקרומטר	טד פלה, בע"	2280-24

מ