שיטה מהירה ופשוטה עבור בידוד גבוה באמצעות-לשים של מירנה מן ליפופרוטאין בצפיפות הגבוה מאוד מטוהר

סיכום

מייקרו RNA לשחק תפקיד רגולטורים חשוב והם מתעוררים כמו מטרות טיפוליות חדשניות למחלות אנושיות שונות. הוכח כי miRNAs נישאים ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה. פיתחנו שיטה פשוטה לבודד HDL מטוהרים במהירות מתאים לניתוח מירנה מפלסמה אנושית.

תקציר

רנ"א קטנים שאינם מקודדים (miRNAs) היו מעורבים במגוון מחלות אנושיות, כולל תסמונות מטבוליות. הם עשויים לשמש כסמנים ביולוגיים לאבחון ופרוגנוזה או עשויים לשמש כמטרות לפיתוח תרופות, בהתאמה. לאחרונה הוכח כי miRNAs נישאים בליפופרוטאינים, במיוחד ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה (HDL) ומועברים לתאים הנמענים לספיגה. זה מעלה את האפשרות ש-miRNAs ממלאים תפקיד קריטי ומרכזי בתפקוד התאים והאיברים באמצעות ויסות ביטוי גנים כמו גם שליח לתקשורת תא-תא ודיבור צולב בין איברים. השיטות הנוכחיות לבידוד miRNA מ-HDL מטוהר אינן מעשיות בעת שימוש בדגימות קטנות בקנה מידה גדול. זה נובע בעיקר מהשיטות הגוזלות זמן ועמלניות המשמשות לבידוד ליפופרוטאין. פיתחנו גישה פשוטה לבידוד מהיר של HDL מטוהר המתאים לניתוח miRNA מדגימות פלזמה. שיטה זו אמורה להקל על חקירות תפקידם של miRNAs בבריאות ומחלות ובמיוחד לספק תובנות חדשות לגבי מגוון הפונקציות הביולוגיות, מחוץ להובלת כולסטרול הפוכה, שיוחסו ל-HDL. כמו כן, מיני ה-miRNA הקיימים ב-HDL יכולים לספק מידע רב ערך על סמנים ביולוגיים קליניים לאבחון מחלות שונות.

מבוא

MicroRNAs הם מיני RNA זעירים אנדוגניים שאינם מקודדים שמורים מאוד ונחשבים לשחקני מפתח בוויסות תהליכים ביולוגיים שונים על ידי פירוק או דיכוי של RNA שליח מטרה^{ספציפי 1}. מכיוון ש-miRNAs פועלים באופן תוך-תאי, הם נחקרו כסמנים ביולוגיים שמקורם ברקמות, מה שהוביל לגילוי פונקציות ספציפיות לרקמות של miRNA אלה. עם זאת, miRNAs נמצאים גם מחוץ לתאים הקשורים לחלבונים או באקסוזומים/מיקרו שלפוחיות שיכולות להגן עליהם ביעילות מפני פירוק על ידי RNases² חוץ-תאיים. מחקרים עדכניים יותר הראו כי ייתכן שההשפעה המגנה של HDL אינה קשורה קשר הדוק ליכולתו לקדם פליטת כולסטרול אלא למטען שאינו כולסטרול שלו, במיוחד כנשא miRNA במחזור ^{3, 4}. miRNAs אלה עשויים לא רק לווסת את חילוף החומרים של השומנים, אלא גם קשורים להשפעות אנטי דלקתיות, נוגדות חמצון ואנטי-טרומבוטיות של קומפלקס HDL-miRNA ^{5, 6}.

כדי לחקור עוד יותר את תפקידם של miRNAs הנישאים בחלקיקי HDL, יש לקבוע פרוטוקול פשוט וקל למיצוי miRNA מ-HDL מבודד ומטוהר מאוד לשימוש בשגרה קלינית. תוארו שיטות רבות לבידוד HDL. שיטות אלו גוזלות זמן רב או דורשות נפח גדול של פלזמה שעלולה לדרוש איגום דגימות, דיאליזה נרחבת להתפלת ליפופרוטאינים מבודדים והן אינן מסירות לחלוטין אקסוזומים כמקור ל-miRNAs³, בהתאמה. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה שיכולה לבודד miRNA מ-HDL מטוהר מאוד תוך שימוש בנפח קטן של דגימות דם בקנה מידה גדול יותר. אנו מאמינים כי שיטה זו עשויה לשמש כהתייחסות טובה לקידום המחקר על תפקידם של miRNAs במחזור הדם ובמיוחד על תפקידו של HDL בהקלת התקשורת בין תאים ואיברים שונים.

פרוטוקול

1. איסוף של דגימות דם

1. אסוף בצום דגימות דם ורידי היקפי ל -10 צינורות מ"ל פלסטיק המכילים חומצה Ethylenediaminetetraacetic קרישה (EDTA) (שבה יש מספר יתרונות על פני תרופות נגד קרישת דם אחרים) על ידי venipuncture רמת וריד בולט fossa antecubital.
2. צנטריפוגה דגימות דם 1,600 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה השולחן להשיג פלזמה חינם של כדוריות דם אדומות וכמויות קטנות של RNA.
3. ברצף בצנטריפוגה supernatant ב -3,000 גרם (4 ° C) ב הרוטור דלי מתנדנד במשך 10 דקות כדי להסיר WBC & טסיות ולאחר מכן עוד 15 דקות כדי להסיר פסולת התא הנותרים בהתאמה.
4. מדוד את הצפיפות של הפלזמה באמצעות densitometer ב RT לפי הוראות ייצור.
   הערה: התאמת צפיפות (ד = 1.023 גרם / מ"ל) עם תמיסת מלח 0.9% עשויה להידרש לאחר הסרת exosomes אבל לפני ultracentrifugation שיפוע צפיפות.

הסרת 2. Exosome מ פלזמה

1. הסר את exosomes במחזור כי יש צפיפות דומה HDL ולייצג מקור משמעותי כמותית של מירנה ^3.
   1. עושים זאת על ידי הוספת פתרון ממטרים 252 μl exosome עד 1 מ"ל פלזמה ואחריו הדגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C. כדי גלול את exosomes, צנטריפוגות את התערובת במשך 30 דקות ב 1500 גרם ב 4 מעלות צלזיוס.
   2. כדי לבודד HDL, להעביר 1 מ"ל של supernatant וכתוצאה לצינור ultracentrifuge פוליקרבונט עבה חומה לעיבוד נוסף עם ultracentrifugation שיפוע צפיפות (ראה להלן).

3. צפיפות Gradient ultracentrifugation (איור 1).

1. כדי להפריד HDL משתמשים בתהליך 3 שלבים העסקת ultracentrifuge הרצפה עם רוטור קבוע זווית הפעלה ב 448,811 x G ו -8 מעלות צלזיוס, בהתאמה.
2. כן שלושה ברצף פתרונות צפיפות שונים ורענן לכל בידוד.
   1. הכן פתרון A (בידוד של VLDL, ד = 1.006 גרם / מ"ל) על ידי המסת 11.4 גרם NaCl (NaCl: 0.195 mol), EDTA2Na 0.1 גרם ו 1 מ"ל 1N NaOH ב 1,000 מ"ל מים autoclaved מזוקקים. ואז להוסיף 3 מ"ל נוספים של מים autoclaved מזוקקים.
   2. הכן פתרון B (בידוד של LDL, ד = 1.182 גרם / מ"ל) על ידי הוספת NaBr 25.2 גרם ל -100 מ"ל פתרון (NaCl 0.195 mol, NaBr 2.44 mol).
   3. הכן פתרון C (בידוד של HDL, ד = 1.470 גרם / מ"ל) על ידי ערבוב NaBr 78.8 גרם עם 100 מ"ל של פתרון (mol 0.195 NaCl, NaBr 7.7 mol). אשר את הצפיפות המתאימה ב RT באמצעות densitometer. שמור את כל הפתרונות על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

בידוד 4. של VLDL

1. מערבבים 1 מ"ל של פלזמה (הצפיפות הממוצעת = 1.023 גרם / מ"ל) ו nuclease חינם 200 μl של שומן האדום 7B בתוך שפופרת ultracentrifuge 6.5 מ"ל פוליקרבונט עבה חומה.
2. אז בזהירות שכבה 5 מ"ל של פתרון העליון של התערובת. במידת הצורך, להוסיף 7B האדום שומן נוסף על גבי t פתרוןo לאזן את המשקל של כל צינור. צנטריפוגה במשך שעה 2 (האצת - 5), (האטה - 7).
   הערה: במהלך צנטריפוגה, ליפופרוטאינים נצברים כלהקה לאזורי צפיפות שיווי המשקל שלהם.
3. בסוף בטווח להתבונן 2 שכבות. סור 1.5 מיליליטר של שבריר VLDL המייצג את השכבה ולאחסן העליון על 4 מעלות צלזיוס.
4. לבסוף, באמצעות העברת פיפטה 4 מ"ל מתחתית הצינור המכיל את ה- LDL, HDL, אלבומין שברים חומצות שומן אל צינור פוליקרבונט חדש לבידוד LDL.

בידוד 5. של LDL

1. מערבבים 2 מ"ל של B פתרון ו 100 μl nuclease חינם 7B האדום שומן לתוך שפופרת המכילה את החלק היחסי LDL ו- HDL (סעיף 4), בהתאמה.
2. ואז צנטריפוגות החוצה עבור 3 שעות (האצה 9, האטה 7). לאחר מכן, להסיר 1.5 מ"ל של שבריר LDL המייצג את השכבה העליונה ולשמור על 4 מעלות צלזיוס או לאחסן ב -80 ° C. לבסוף, להעביר 4 ​​מ"ל מתחתית הצינור המכיל את HDLחלק לצינור פוליקרבונט חדש.

בידוד 6. של HDL

1. מערבבים 2 מ"ל של C פתרון, 100 7B חינם μl nuclease שומן האדום 15 μl של 98% β-mercaptoethanol לתוך שפופרת המכילה את החלק היחסי HDL, בהתאמה.
2. צנטריפוגה במשך 3 שעות (אצה 9, האטה 7). לאחר מכן להסיר 2 מ"ל של שבריר HDL המייצג את השכבה העליונה גם לשמור על 4 מעלות צלזיוס או לאחסן ב -80 ° C.

7. Desalting וריכוז של שברי Lipoprotein

1. כדי למנוע הפרעה עם ג'ל אלקטרופורזה לאחר agarose ו- PCR, להסיר מלח מופרז הוסיף במהלך ultracentrifugation שיפוע צפיפות באמצעות התקנים מסננים צנטריפוגלי עם הפסקת המשקל המולקולרית המתאימה (שפופרת 3K עבור VLDL צינור 10K עבור LDL / HDL) כפי שתואר על ידי הוראות היצרן.
   1. בקצרה, לאחר הוספת 2.5 מ"ל קר PBS (137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCL, 8 מ"מ Na2HPO4, 2 מ"מ KH2PO4; pH 7.4) centrifuge השבר VLDL שנגבה-במהלך ultracentrifugation שיפוע צפיפות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות באמצעות הרוטור דלי מתנדנד.
   2. Desalt השבר LDL פעמיים עם 10 מ"ל קרח קר PBS במשך 30 דקות כל אחד. לאחר מכן, השתמש 13 מ"ל קרח קר PBS פעמיים עבור Desalting השבר HDL. היקף PBS הגבוה יש צורך לשפר את ניידות עם ג'ל אלקטרופורזה agarose. לאחר צנטריפוגה, להסיר את המומסים ליפופרוטאין המכילים ולשמור על 4 מעלות צלזיוס או לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

8. ג'ל אלקטרופורזה agarose

1. Perfrom ג'ל אלקטרופורזה agarose ליפופרוטאין העסקה בערכה עם שינויים קלים של הוראות היצרן כדלקמן.
   הערה: שלב זה הוא רק כדי להעריך את האיכות וטוהר של דגימות ליפופרוטאין מרוכזות.
   1. בקצרה, לקבל 6 μl של שבריר ליפופרוטאין desalted עם ultracentrifugation שיפוע צפיפות ולטעון על ג'ל ליפופרוטאין מראש יצוק. השתמש lipop אדםסטנדרטי rotein עבור VLDL, LDL ו- HDL כהפנית גודל. לבצע אלקטרופורזה ב RT ב -100 V עבור 60 דקות באמצעות חיץ הכנת הנציג.
   2. יבש את הג'ל למשך 10 דקות ולאחר מכן להכתים במשך 10 דקות ב RT עם שומן האדום 7B. Destain הג'ל בתערובת של מים מתנול 75:25 (v / v) ויבש שוב במשך 5 דקות.

הפקת RNA 9. וטיהור

1. Perfrom הבידוד של מירנה ידי HDL האדם מטוהרים באמצעות ערכת בידוד מירנה בסרום / פלזמה וטיהור.
   1. בקצרה, להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט תמוגה RNA 200 μl של HDL מטוהרים, לערבב עם vortexer ואז וטופחו במשך 5 דקות ב RT על מנת להבטיח ניתוק מוחלט של מתחמי nucleoprotein ו איון של RNases.
   2. ואז ספייק 3.5 μl של סינתטי Caenorhabditis elegans microRNA (cel-miR-39; 1.6 x 10 ⁸ עותקים / μl) לתוך התערובת. ואז לבצע מיצוי RNA על פי הוראות היצרן.
2. בצע purificatiעל של מירנה חילוץ עם עמודות ספין elute לפי הוראות היצרן. למדוד את הריכוז של מירנה מה- HDL מטוהר עם spectrophorometer.
   הערה: Elution של מירנה מטורי הספין מועסק 16 μl של RNase ללא מים.

10. הפוך תמלול (RT-PCR)

1. לבודד 100 ננוגרם של מירנה מה- HDL ומשובץ מירנה סינטטי (cel-miR-39) ו הפוך עבד בנפח תגובת 20 μl העסיק בערכת השעתוק לאחור ועל פי הוראות היצרן.
2. בצע בקרה נאותה ללא תבנית מירנה (NTC) וללא תמהיל אנזים transcriptase הפוך (NRT).

11. בזמן אמת PCR (qRT-PCR)

1. Perfrom PCR בזמן אמת בהיקף כולל של 20 μl עם 2 μl של דילול 1: 2 של cDNA, 10 μl PCR לערבב, 2 פריימר אוניברסלי μl, 2 μl של פריימרים מירנה ו -4 μl מים RNase חינם.
2. הפעל את Reactiעל ב 96-גם צלחות על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואחריו 45 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לבין שלב הארכה על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 s.ec Perfrom כל תגובות triplicates .
3. לאחר מכן, כמויות יחסית Calcuate של מירנה באמצעות 2 שיטת Ct ^-ΔΔ לאחר נורמליזציה אל גן משק סינתטי לפי הוראות היצרן.

תוצאות

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה לאחר הסרת Exosomes
כדי להשיג מירנה מה- HDL הנקי במיוחד יש צורך להסיר exosomes המייצג מקור מירנה זיהום ^7. הדבר נעשה לפני ultracentrifugation שיפוע צפיפות עם ערכה זמינה מסחרי. למטרות מעשיות פרוטוקול ultracentrifugation שיפוע צפיפות התקן דן בשלוש צעד שפותחה על ידי חברה מסחרית שונה (איור 1). פרוטוקול זה דורש צנטריפוגה עם רוטור קבוע זווית במהירות של 140...

דיון

זיהוי סמנים ביולוגיים רומן מדם יסייע לקביעת האבחנה הקלינית ופרוגנוזה של מחלות שונות. מיקרו-רנ"א הינם ידוע כבעל כל התכונות של סמנים ביולוגיים הוכחו במחקרים שונים ^14-17. במחקר זה אנו הוכחנו שיטה קלה מהירה ופשוטה לבודדים מירנה מה- HDL בפלזמה. שיטת שיפוע אולטרה צנטריפוגה צפיפות קונבנציונלית בידוד של VLDL, LDL ו- HDL תלוי דגימה מדויקת של פלזמה, הכנה מדויקת של תמיסת הבופר, מדידת הצפיפות והעברת כמותי של שברים ליפופרוטאין תחתונים ^8. ישנן שיטות רבות תוארו לבודד H...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שואב אבק מפלסטיק צינורות לבנדר K2EDTA	בקטון, דיקינסון ושות'	366643
צנטריפוגה	תרמו סיינטיפיק, Sorvall Legend X1R
Densito 30PX Densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick solution	Invitrogen	4484451
צינור אולטרה-צנטריפוגה עבה פוליקרבונט	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 אולטרה-צנטריפוגה	תרמו סיינטיפיק	46902
אדום שומן 7B	סיגמא-אולדריץ'	201618
&בטא;-מרקפטואתנול	סיגמא-אולדריץ'
Amicon Ultra-15 התקני סינון צנטריפוגלי 10K	Millipore	UFC901008
Amicon מכשירי סינון אולטרה צנטריפוגלי 3K	Millipore	UFC800308
ערכת QuickGel Lipo	מעבדות הלנה	3344,3544T
תקני ליפופרוטאין אנושי עבור VLDL, LDL ו-HDL	LipoTrol; מעבדות הלנה	5069
מאגר הכנה לנציגים	מעבדות הלנה	3100
RNeasy MinElute עמודות ספין	מנתח Qiagen
NanoDrop 1000	ערכת Thermo Scientific
miScript II RT	Qiagen	218161
CFX96 מגע מערכת זיהוי PCR בזמן אמת	BioRad
miRNeasy ערכת סרום/פלזמה	QIAGEN	217184
miScript בדיקות פריימר	QIAGEN	141078139
miScript ערכת PCR ירוקה SYBR	QIAGEN	218073
miRNeasy סרום/פלזמה בקרת ספייק אין	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH
0.20 & #181; מסנן מזרק סטרילי M	SIGMA-ALDRICH	Z227536