מאמר שיטה

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים Brucella זיהום של תאים הלה

DOI:

10.3791/54263

⸱

5 באוגוסט 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, 3Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, 4BioDataAnalysis GmbH

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארות שתי בדיקות לבדיקת תפוקה גבוהה מבוססת מיקרוסקופיה של גורמי מארח המעורבים בזיהום ברוצלה. בדיקת הכניסה מזהה גורמי מארח הנדרשים לכניסת ברוצלה ובדיקת נקודת הקצה הנדרשים לשכפול תוך תאי. בעוד שרלוונטי לגישות חלופיות, בדיקת siRNA בתאי HeLa משמשת להמחשת הפרוטוקולים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיני Brucella הם פתוגנים תאיים פקולטטיבי מדביקי חיות כמארחים הטבעיים שלהם. הילוכים לבני האדם נגרמים לרוב על ידי מגע ישיר עם בעלי חיים נגועים או על ידי בליעה של מזון מזוהם והוא יכול לגרום לזיהומים כרוניים קשים.

Brucella יכול לפלוש תאים phagocytic המקצועיים והלא-מקצועיים משכפל בתוך reticulum endoplasmic (ER) vacuoles -derived. הגורמים המארחים הנדרשים לשם כניסת Brucella לתוך תאי מארחים, הימנעות שפלת lysosomal, ושכפולים בתא ER-כמו להישאר אלמונים למדי. כאן אנו מתארים שני מבחנים לזהות גורמי מארח מעורבים כניסת Brucella ושכפול בתאים הלה. הפרוטוקולים מתארים את השימוש של התערבות RNA, בעוד שיטות הקרנה חלופיות יכולות להיות מיושמות. המבחנים מבוסס על זיהוי של חיידקים שכותרתו fluorescently שכותרתו fluorescently תאי מארח באמצעות אוטומטימיקרוסקופיה רחב בתחום. התמונות פלורסנט מנותחות באמצעות צינור ניתוח תמונה סטנדרטי CellProfiler המאפשר ניקוד זיהום מבוסס תא בודד.

ב assay נקודות הקצה, שכפול תאיים נמדד ימים לאחר ההדבקה. זה מאפשר לחיידקי תנועת הנישה בשכפול הדנ"א שלהם שבו התפשטות הוא יזם כ -12 שעות לאחר כניסת חיידקים. Brucella אשר הקים בהצלחת נישה תאית יהיה וכך התרבו מאוד בתוך תאי מארחים. מאז חיידקים תאיים יהיה מאוד במספרם חיידקים תאיים או תאיים בודדים שאינם בשכפול הדנ"א, זן המבטאים constitutively GFP יכול לשמש. אות GFP החזקה לאחר מכן נעשתה שימוש כדי לזהות תאים נגועים.

לעומת זאת, עבור assay הכניסה חיוני להבדיל בין תאיים ובקטריות התאיות. הנה, קידוד זן עבור GFP טטרציקלין מושרה משמש. הַשׁרָאָהשל GFP עם איון סימולטני של חיידקים תאיים על ידי גנטמיצין מאפשרת הבחנה בין תאיים ובקטריות תאיים על פי האיתות GFP, עם חיידקים תאיים רק להיות מסוגל להביע GFP. זה מאפשר זיהוי החזק של חיידקים תאיים יחידים לפני התפשטות תאית היא יזמה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיני Brucella הם גראם שליליים, פתוגנים תאיים פקולטטיבי השתייכות למעמד של α-פרוטאובקטריה. הם לגרום הפלות פוריות אצל מארחיהם טבעיים כגון בקר, עזים או כבשים וכתוצאה מכך הפסדים כלכליים חמורים באזורים אנדמיים. ברוצלוזיס היא אחת מחל zoonotic החשובות ביותר בעולם גורמים יותר מחצי מיליון זיהומי אדם חדשים מדי שנת 1. הילוכים לאדם נגרמים לרוב על ידי מגע ישיר עם בעלי חיים נגועים או על ידי בליעה של מזון מזוהם כמו חלב לא מפוסטר. הסימפטומים של המחלה חום הם נוקבים, הגורמת לקשיים באבחון של ברוצלוזיס. בהעדר טיפול, חולים יכולים לפתח דלקת כרונית עם תסמינים חמורים יותר כגון דלקת פרקים, דלקת פנים הלב, וכן נוירופתיה 2.

ברמה התאית Brucella הוא מסוגל לפלוש תאים phagocytic והלא phagocytic משכפל בתוך תאייםתא המכונה vacuole המכילים Brucella (BCV). הפנמה של חיידקים דורש rearrangements cytoskeleton אקטין ידי RAC, Rho, והפעלה ישירה של Cdc42 3. בתוך התא המארח איקריוטיים, את BCV traffics לאורך מסלול endocytic ולמרות אינטראקציה עם lysosomes, חיידקים מצליחים למנוע השפלה 4. החמצה של BCV ידי שלפוחי ATPase נדרש כדי לגרום הביטוי של מערכת הפרשת IV סוג בקטריאלי (T4SS) 5. הוא האמין כי effectors חיידקי מופרש T4SS חיוני Brucella להקים הנישה בשכפול הדנ"א שלו, מאז מחיקה של T4SS 6 או עיכוב של עופרת ATPase שלפוחי מפגמי הקמת הנישה התאית 7. חיידקים אינם משתכפלים במהלך שלב של סחר עד שהם להגיע תא vacuolar הנגזרות ER 8. לאחר התפשטות תאיים מתרחשת, BCV נמצא CLעמותת OSE עם סמני ER כגון calnexin וגלוקוז-6-phosphatase 6.

המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו Brucella נכנס לתאים, נמנע שפלת lysosomal, ולבסוף משכפל ב תא ER-כמו להישאר אלמונים למדי. גורמי מארח מעורבים שלבים שונים של זיהום זוהו בעיקר על ידי גישות ממוקדות או מסך RNA התערבות קטן בקנה מידה קטנה (siRNA) בצע בתאים תסיסנית 9. אלה שפכו אור על תרומתם של גורמים ממארחים במהלך הדבקת Brucella אבל אנחנו עדיין רחוקים הבנה מקיפה של התהליך כולו.

הנה, פרוטוקולים המאפשרים זיהוי של גורמי מארח אנושיים באמצעות התערבות RNA בקנה מידה גדולה (RNAi) הקרנה בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום אוטומטי ניתוח תמונה אוטומטי מוצגים. transfection siRNA ההפוך של תאים הלה מבוצע described קודם לכן 10,11 עם שינויים קלים. את assay קצה מכסה חלק גדול של מחזור החיים התאיים Brucella למעט היציאה והזיהום של תאי שכנים. כדי להמשיך לאפיין את הנפילות ב assay נקודות הקצה, פרוטוקול שונה כדי לזהות גורמים הכרוכות בביצוע הפעולות הראשונות של הזיהום משמש.

זן abortus Brucella כי constitutively מבטא GFP משמש עבור assay הסיום שבו חיידקים מותרים להדביק תאים במשך ימים. במהלך תקופה זו, חיידקים לחדור לתאים, תנועה לנישה בשכפול הדנ"א הנגזרות ER, לשכפל במרחב פרי-גרעיני. הרמות הגבוהות של אות ה- GFP לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לזהות תאים בודדים מהימן אשר מכילים חיידקים משכפלים.

כדי ללמוד כניסת Brucella ב assay תפוקה גבוהה, חשוב להיות מסוגל להבחין בין חיידקים תאיים תאיים. השיטה המוצגת כאן circumvמכתים נוגדן הפרש המציג של חיידקים תאיים תאיים. היא מבוססת על זן Brucella להביע GFP טטרציקלין מושרה בשילוב עם ביטוי המכונן של dsRed. הנוכחות של סמן dsRed מכונן מאפשרת זיהוי של כל החיידקים שנמצאים במדגם. ביטוי של GFP הוא המושרה על ידי תוספת של anhydrotetracycline אנלוגי טטרציקלין רעיל (ATC) בו זמנית עם איון של חיידקים תאיים על ידי גנטמיצין (GM). בעוד תא-חדיר אנטיביוטי Gm הורג חיידקים תאיים, ATC יכול להיכנס לתא המארח להשרות ביטוי של GFP סלקטיבי חיידקים תאיים. כתב כפול זה מאפשר הפרדה החזקה של חיידקים תאיים יחידים (GFP אות dsRed) מחיידקים תאיים (אות DsRed בלבד) באמצעות מיקרוסקופ השדה רחב. כדי להגיע ביטוי GFP לזיהוי על ידי Brucella תאיים מצאנו כי 4 שעות של אינדוקציה ידי ATC התוצאה היא רליאות מסוגל. תוכניות אינדוקציה דומות להביע GFP סלקטיבי חיידקים תאיים כבר השתמשו בעבר כדי ללמוד Shigella התאי 12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל העבודה עם זני abortus חיים Brucella חייבת להתבצע בתוך מעבדת בטיחות ביולוגית ברמה 3 (BSL3) בהתחשב בכל התקנות הנדרשות אמצעי בטיחות.

1. הכנת צלחות הקרנת Culturing של חיידקים ותאים

  1. הכנת תרבויות Starter Brucella abortus
    1. Streak Brucella abortus 2308 (B. abortus) מ -80 ° C המניות חלב על אגר סויה tryptic (TSA) צלחת המכילה 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin (TSA / ק"מ). דגירה הצליחו במשך 3-4 ימים ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש זן Brucella abortus 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 13 עבור assay הסיום ומתח Brucella abortus pAC042.08 (apht :: dsRed, TETO :: tetR-GFP) עבור assay הכניסה.
      ההערה: lipopolysaccharide החלק (LPS) של Brucella abortus הוא הקובע ארסיות חשובה אבל מוטציות מחוספסות יכולות להתרחש בתדרים גבוהים יחסית 14. Wדואר ובכך ממליץ לבחון את מעמדה של זן התרבות לפני שמתחיל עם ניסוי זה.
    2. חיידקים Restreak על ארבע צלחות TSA / ק"מ המכסה את צלחת מלאה דגירה של 2-3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. באמצעות לולאה פלסטיק חד פעמיות, העברת וחיידקים resuspend מהצלחות TSA / ק"מ ב 10 מ"ל 10% חלב רזה autoclaved. ודא כי החיידקים הם resuspended היטב על מנת להבטיח ריכוז חיידקים עקביים בכל התרבויות המתנע.
    4. Aliquot 250 μl של ההשעיה חיידקים לתוך 2 מ"ל בורג צינורות כובע ולהקפיא ב -80 ° C.
    5. להפשיר aliquot של תרבות המתנע ולהעביר 25 μl, 50 μl, ו 100 μl של תרבות המתנע חיידקי להפריד 250 מ"ל בורג בקבוקי כובע עם 50 מ"ל tryptic סויה מרק (TSB) המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin (TSB / ק"מ) . חותם את הבקבוקים עם Parafilm.
    6. דגירת בקבוקי לילה על שייקר מסלולית ב 100 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס.
    7. מדוד את הצפיפות האופטית ב 600 nמ '(OD 600) כדי לקבוע את עוצמת הקול של תרבות המתנע נדרש להגיע OD 600 = 0.8-1.1 לאחר תרבות לילה.
  2. הכנת תאים הלה
    1. לגדל תאי הלה Dulbecco השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% נסיוב עגל עוברי (FCS) (DMEM / 10% FCS) בתוך חממה ולחה 37 ° C עם 5% CO 2. לגדל תאים 80% confluency.
  3. הכן את צלחות הקרנה עם siRNAs.
    1. לדלל siRNAs במים RNase ללא לריכוז סופי של 0.32 מיקרומטר. העברת 5 μl / היטב 384 גם צלחות שחורות ברור היטב שטוחות תחתונות.
      1. שימוש בעמודות 1, 2, 23, ו -24 עבור פקדים רגילים. עבור פקדים שליליים, להשתמש ללא מיקוד siRNA (מקושקש) ובארות מדומה ללא siRNAs (מגיב transfection בלבד). עבור פקדי transfection, השתמש siRNA שגורם מוות תאי (KIF11), כמו גם בקרות חיוביות של גורמי מארח ידועים המשתתפים בתהליך הדבקת Brucella (למשל, ARPC3,מרכיב של המתחם Arp2 / 3 מעורב פילמור אקטין). העבר זמין מסחרי ספריות siRNA או siRNAs המותאם אישית אל הבארות הנותרות.
      2. צלחות חותמות עם רדידי אלומיניום peelable. צלחות חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
        הערה: ניתן לאחסן צלחות ב -20 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים לפחות ועד שנים בהתאם להמלצות היצרן.

2. הפוך siRNA Transfection

  1. להפשיר צלחת 384 גם שחור על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: זה יפיל את כל הנוזלים אשר עלול לדבוק במכסה או בצד של הבארות.
  2. הכן את המדיום transfection ידי דילול מגיב transfection 1: 200 ב DMEM ללא FCS בטמפרטורת החדר. הכן את המדיום transfection לא יותר מ -20 דקות לפני השימוש. בזהירות ומערבבים את הפתרון לפני השימוש.
  3. הוסף 25 μl בינוני transfection לכל גם באמצעות מתקן מגיבומערבבים הפתרונות ידי הזזת צלחת הלוך ושוב.
  4. דגירה את הצלחת עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר כדי לאפשר היווצרות מורכבת מגיבה siRNA / transfection.
  5. בינתיים, להכין תאים הלה על ידי שטיפת התאים תת ומחוברות של בקבוקון 75 ס"מ 2 פעם עם 2.5 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA ב PBS (טריפסין).
  6. הוסף 1.5 מ"ל טריפסין טרי ולהעביר את הבקבוק עד 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות עד שהתאים לעגל כלפי מעלה.
  7. Resuspend התאים 10 מ"ל מראש חימם DMEM / 16% FCS.
  8. ספירת תאים באמצעות נגד תא אוטומטי להכין השעית תא של 10,000 תאים / מיליליטר DMEM / 16% FCS.
  9. הוסף 50 μl השעית תא היטב כל משתמש מנפק מגיב וכתוצאה מכך 500 תאים / היטב.
  10. הזז את הצלחת קדימה ואחורה כדי להשיג אפילו חלוקת התאים. השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות, כדי לאפשר לתאים להתיישב.
  11. חותם את הצלחת עם Parafilm ו דגירה אותו במשך 72 שעות על אלומיניום מחומם מראשצלחת בתוך חממה ולחה 37 ° C עם 5% CO 2.
    הערה: צלחת אלומיניום מחומם מראש מאפשר התפלגות הטמפרטורה שווה לאורך כל צלחת 384 גם כולה.

זיהום קיבוע 3.

  1. יום אחד לפני ההדבקה, לחסן לסכום הקבוע 1.1.7 של B. תרבות המתנע abortus ב 50 מ"ל בינוני TSB / ק"מ בתוך 250 מ"ל בורג בקבוק כובע. חותם את הבקבוק עם Parafilm ולגדול חיידקים לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 100 סל"ד על שייקר מסלולית כדי OD 600 = 0.8-1.1.
  2. מדוד OD 600 של התרבות חיידקי ולהכין המדיום זיהום על ידי דילול התרבות חיידקים FCS DMEM / 10% כדי להשיג את ריבוי הרצוי של זיהום (משרד הפנים).
    הערה: כדי לקבל שיעור ההידבקות של 5-10% בתאים הלה, משרד הפנים של 10,000 משמש. עקומת טיטרציה משרד הפנים יש לבצע עבור כל סוג תא להשיג שיעורי זיהום אופטימלי.
  3. חילופי בינוני transfection של צלחת 384 גםעם 50 μl של מדיום הזיהום באמצעות מכונת כביסת צלחת אוטומטית.
  4. צנטריפוגה צלחת 384 גם ב 400 XG ו -4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    הערה: זה עוזר לסנכרן את תהליך ההדבקה.
  5. חותם את הצלחת עם Parafilm ו דגירה אותו על צלחת אלומיניום מחוממת מראש בתוך חממה ולחה 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 4 שעות.
  6. שוטף את התאים עם FCS DMEM / 10% המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר Gm כדי להשבית חיידקים תאיים באמצעות מכונת כביסת הצלחת האוטומטית (השתמש 200 μl / טוב לשטוף הצפה).
    הערה: במהלך לשטוף הצפה, מכונת כביסת הצלחת האוטומטית מחלק בו זמנית aspirates בינוני.
  7. עבור assay כניסה, לשטוף תאים בשנית עם DMEM / 10% FCS המכיל Gm 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 100 ng / ml ATC באמצעות מכונת כביסה צלחת אוטומטי (השתמש 200 μl / טוב לשטוף הצפת).
  8. חותם את הצלחת עם Parafilm ולהחזירו צלחת אלומיניום מחוממת מראש ב -37 החממה והלחה ° C עם 5% CO 2 עבור אחר40 שעות או 4 שעות, עבור assay הסיום ואת assay הכניסה, בהתאמה.
  9. עבור קיבעון, לשטוף את הבארות עם PBS באמצעות מכונת כביסת הצלחת האוטומטית (השתמש 200 μl / טוב לשטוף הצפה).
  10. המרת PBS עם 50 μl 3.7% paraformaldehyde ב 0.2 M HEPES ב- pH 7.4 (PFA) באמצעות מכונת כביסת הצלחת האוטומטית.
    הערה: שימו לב: PFA הוא רעיל על ידי שאיפה, במגע עם העור ואם נבלע.
  11. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. חילופי בינוני הקיבעון עם 50 PBS μl באמצעות מכונת כביסת הצלחת האוטומטית. הערה: הדגימות מוכנות כעת להילקח מתוך BSL3 במידת הצורך.
    זהירות: הסרת כל מדגם ממתקן BSL3 כפופה הערכת סיכונים ואימות של ההליך ותלוי והתקנות החלים על בטיחות ביולוגית.

4. מכתים

  1. שטפו תאים פעמיים עם 50 μl PBS.
  2. Permeabilize תאים 50 μl 0.1% Triton-X-100 ב PBS במשך 10 דקות.
  3. Wתאי אפר שלוש פעמים עם PBS. הוסף 20 μl של PBS המכיל DAPI 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​(4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. שטפו תאים שלוש פעמים PBS ולהגן על מכתים מן האור עם רדיד אלומיניום.

הדמיה 5.

  1. הגדרת מיקרוסקופ רחב בתחום האוטומטי לרכישת תמונה.
    הערה: ההגדרות עבור מיקרוסקופ מולקולרית תקן ImageXpress באמצעות תוכנת MetaXpress מתוארות להלן. התקני 2D רחב בתחום מיקרוסקופיה אלטרנטיביים עם מפרט חומרה מתאים ותוכנות הדמיה ניתן להשתמש (ראה טבלה של חומר / ציוד לפרטים נוספים).
    1. בחר מטרת 10X, binning מצלמה = 1, רווח = 1.
    2. בחר את תבנית הצלחת מתאימה צלחת 384 גם.
    3. רוכש 9 אתרים בכל טוב.
    4. השתמש "אפשר להתמקד מבוסס לייזר" ו "התמקדות צלחת היטב לתחתית".
    5. גדר "באר הראשונה" כבאר הראשוניתמציאת מדגם "כל האתרים" עבור פוקוס אוטומטי באתר.
    6. השתמשו בערוץ DAPI להגדיר באופן ידני-אופסט Z עבור להתמקד.
    7. בחר ידני Z-אופסט מ DAPI עבור כל הערוצים האחרים.
    8. ידנית לתקן את זמן חשיפה לכל הערוצים מנת להבטיח טווח דינמי רחב עם חשיפה נמוכה.
      1. לרכוש תמונה של אתר נציג באמצעות פונקצית החשיפה האוטומטית. לנצל את הזמן לחשיפה זו תמונה 3-5 אתרים ברחבי צלחת ולהתאים את זמן החשיפה באופן ידני עד פיקסלים המבריקים להגיע ~ 80% של בהירות מקסימלית על כל האתרים.
    9. תמונת הצלחת המלאה באמצעות ערוצי DAPI ו- GFP עבור assay נקודות הקצה. עבור assay כניסה בחרו בערוץ RFP בנוסף.

6. ניתוח תמונה אוטומטי

הערה: CellProfiler 2 15 מועסק כמו תוכנת ניתוח תמונה למגזר הסלולר וחפץ חיידקים ולבצע אוטומטיות measurements בתוך אובייקטים מזוהים. התוכנה מספקת ניתוח אלגוריתמי תמונת מודולים בודדים, אשר ניתן לשלב לתוך צינור כי יבצע את המודולים ברצף על כל התמונות, כדי לבצע משימת ניתוח תמונה ספציפית באופן אוטומטי. כדי לעקוב אחר הפרוטוקול, להתקין CellProfiler 2.1.1 או גרסה חדשה יותר. ואז, טען את הצינור המצורף ופעל על פי ההוראות הבאות כדי להתאים את הפרמטרים הנדרשים בתוך מודולים. תיאור של מודולים הבודדים של כל הצינורות ניתן למצוא הקבצים המשלימים.

הערה: שני צינורות נפרדים משמשים עבור כל assay. הצינור הראשון מחשבת מודל הצללה, אשר משמש את צינור השני לתקן תמונות לפני ניתוח. תיקון הצללה מוחל על התמונות כדי להפחית את ההשפעות של נתיב אור הומוגניות מן מיקרוסקופ. מחשוב במודל ההצללה בצנרת הראשונה הוא תהליך ממושך, אך התוצאות תהיינה של דיוק גבוה יותר.

  1. Assay Endpoint
    1. חשבתי את מודל ההצללה
      1. עבור אל תפריט "קובץ", בחר "יבוא" → "צינור מקובץ ...", ובחר את צינור סיפק "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". כשנשאל אם להמיר בצנרת מורשת, לענות "אין להמיר".
      2. יש להקליק על "פלט" → "הגדרות פלט תצוגה" ובחר תיקייה קלט עם תמונות ספריית פלט עבור דגמי הצללה שהתקבל.
      3. במודול (1) "LoadImages", לשנות את השם של "טקסט שיש תמונות אלה במשותף" כדי להתאים את שמות התמונה.
      4. ודא שאף אחד המודולים להראות התצוגה שלהם לפני הפעלת הניתוח המלא על ידי ביטול סימון כל סמלי העין ליד מודולים. הערה: באופן משמעותי זה מקטין משאבים החישוביים דרושים בעת עיבוד הצינור.
      5. לחץ על "נתח תמונות" כדי להתחיל את החישוב של מודל ההצללה.
    2. ניתוח תמונה הפעל
      1. עבור אל תפריט "קובץ", בחר "יבוא" → "צינור מקובץ ...", ובחר את צינור סיפק "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". כשנשאל אם להמיר בצנרת מורשת, לענות "אין להמיר".
      2. יש להקליק על "פלט" → "הגדרות פלט תצוגה" ובחר תיקייה קלט עם תמונות ספריית פלט עבור גיליון אלקטרוני שהתקבל.
      3. במודול (1) "LoadImages", לשנות את השם של "טקסט שיש תמונות אלה במשותף" כדי להתאים את שמות התמונה.
      4. במודול (2) "LoadSingleImage", טען את דגמי ההצללה שמחושבים לפי 6.1.1 על ידי בחירת המיקום שמות הקבצים של שני מודלי ההצללה.
      5. מודולים (4) - (5) "ImageMath", להתאים את הפרמטר "הכפל את התמונה הראשונה על ידי" התאמת העומק הסיבי של מצלמת מיקרוסקופ. במשך 8 ו 16 ביטתמונות להגדיר את הפרמטר "1.0", עבור 12 bit תמונות להגדיר את הפרמטר "16.0".
      6. במודול (9) "ImageMath" להתאים את הפרמטר "הכפל את התמונה השנייה על ידי" לערך (להתחיל עם 0.25) כי ימנע את האות Brucella ב מכתים DAPI מבלי לדכא את הגרעינים.
        1. לחץ על "התחל בדיקת מצב", ואז הפעל את סמל ההשהיה ופונקצית התצוגה עבור מודול (9) על ידי לחיצה על הסמלים המקבילים מודול.
          הערה: סמל ההשהיה יופיע בצהוב, בעוד סמל העין נראה עין פקוחה אם מופעל.
        2. לחץ על "הפעל" כדי להפעיל את הניתוח עד מודול (9) עם סמל ההשהיה הפעיל. כדי לבדוק את הערכים של מודול, לחצו על "שלב".
        3. לחץ לחיצה ימנית על התמונה שזה עתה נפתח ולהגדיר "בניגוד תמונה" כדי "התחבר מנורמל". שוב ושוב צעד אחורה כדי מודול (9), להתאים את הפרמטר "הכפל את התמונה השנייה על ידי", וצעד על tהוא מודול שוב, עד אות Brucella מדוכאת לחלוטין בעוד באותו האזורים השחורים הזמן מציין יתר החיסור הם מזעריים בתמונת התוצאה.
      7. במודול (10) "IdentifyPrimaryObjects", להגדיר את הפרמטר "חסם תחתון על הסף" מספיק גבוה (להתחיל עם אפס) כך גרעינים מפולחים והרקע הוא התעלם.
        1. כדי לזהות טוב מודול (10), צעד מעל למסוף ולהציג תמונת הקלט כמוסבר בצעדים 6.1.2.6.1 ו 6.1.2.6.2.
        2. לחץ לחיצה ימנית על תמונת הקלט להציג את ההיסטוגרמה.
          הערה: השיא של ההיסטוגרמה מציין בדרך כלל ברקע.
        3. החל מ עוצם רקע להגדיל את הפרמטר עד פילוח הגרעינים טוב מושגת כמובאת בתמונת הפלט.
          הערה: קביעת הסף הגבוה יותר מאשר עוצם רקע חשוב במיוחד עבור אתרים ריקים.
      8. במודול (15)4; FilterObjects ", להתאים את הפרמטר" ערך מינימלי "כך התאים עם Brucella נראה בבירור בגרעין נשמרים, וכל האחרים מסוננים משם בשלב זה, להתעלם Brucella שמחוץ לגרעין..
        1. כדי לזהות ערך מדלג מעל מודול ולהציג את התמונה פלט כמוסבר בצעדים 6.1.2.6.1 ו 6.1.2.6.2. מתחיל מאפס, אשר מזהה את כל התאים נגועים, ולהגדיל את הערך על ידי צעדים קטנים עד תאים רק עם Brucella הבולט למראה הגרעין נשמרים.
      9. במודול (16) "FilterObjects", להתאים את הפרמטר "ערך מינימלי" כך התאים עם Brucella בולט למראה perinucleus נשמרים, וכל שאר התאים מסוננים משם. השתמש בגישה דומה כמו במודול הקודם.
      10. במודול (17) "FilterObjects", להתאים את "ערך מינימלי" פרמטר כך התאים עם Brucella בולט למראה וורגוף תא onoi נשמר, וכל שאר התאים מסוננים משם. השתמש בגישה דומה כמו במודול הקודם.
        הערה: גוף התא Voronoi הינו תוסף רדיאלי של הגרעין על ידי 25 פיקסלים ללא חפיפה עם השכנה גופי התא Voronoi.
      11. לצאת ממצב מבחן ולוודא שאף אחד המודולים להראות התצוגה שלהם לפני הפעלת ניתוח מלא על ידי ביטול הסימון כל הסמלים העין ליד מודולים.
        הערה: באופן משמעותי זה מקטין משאבים החישוביים דרושים בעת עיבוד הצינור.
      12. לחצו על "נתח תמונות" כדי להתחיל את הניתוח.
      13. כאשר הניתוח סיים, לבדוק את תמונות PNG וכתוצאה מכך, כמו גם את גיליון CSV כדי להבטיח כי הניתוח עבד בצורה אמינה לאורך כל הצלחת.
  2. Assay כניסה
    1. חשבתי את מודל ההצללה
      1. עבור אל תפריט "קובץ", בחר "יבוא" → "צינור מקובץ ...", ובחר את לספקצינור ד "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". כשנשאל אם להמיר בצנרת מורשת, לענות "אין להמיר".
      2. יש להקליק על "פלט" → "הגדרות פלט תצוגה" ובחר תיקייה קלט עם תמונות ספריית פלט עבור דגמי הצללה שהתקבל.
      3. במודול (1) "LoadImages", לשנות את השם של "טקסט שיש תמונות אלה במשותף" כדי להתאים את שמות התמונה.
      4. ודא שאף אחד המודולים להראות התצוגה שלהם לפני הפעלת הניתוח המלא על ידי ביטול סימון כל סמלי העין ליד מודולים.
        הערה: באופן משמעותי זה מקטין משאבים החישוביים דרושים בעת עיבוד הצינור.
      5. לחץ על "נתח תמונות" כדי להתחיל את החישוב של מודל ההצללה.
    2. ניתוח תמונה הפעל
      1. עבור אל תפריט "קובץ", בחר "יבוא" → "צינור מקובץ ...", ובחר את providצינור ed "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". כשנשאל אם להמיר בצנרת מורשת, לענות "אין להמיר".
      2. יש להקליק על "פלט" → "הגדרות פלט תצוגה" ובחר תיקייה קלט עם תמונות ספריית פלט עבור גיליון אלקטרוני שהתקבל.
      3. במודול (1) "LoadImages", לשנות את השם של "טקסט שיש תמונות אלה במשותף" כדי להתאים את שמות התמונה.
      4. במודול (2) "LoadSingleImage", טען את דגמי ההצללה שמחושבים לפי 6.2.1 על ידי בחירת המיקום שמות הקבצים של שני מודלי ההצללה.
      5. מודולים (4) - (5) "ImageMath", להתאים את הפרמטר "הכפל את התמונה הראשונה על ידי" התאמת העומק הסיבי של מצלמת מיקרוסקופ. במשך 8 ו -16 bit תמונות להגדיר את הפרמטר "1.0", במשך 12 bit תמונות להגדיר את הפרמטר "16.0".
      6. במודול (6) "IdentifyPrimaryObjects", להגדיר את הפרמטר "Lower כבול על הסף "גבוה מספיק כי גרעינים רק מפולחים והרקע הוא התעלם.
        1. כדי לזהות טוב מודול (6) מדלגים מעל מודול ולהציג תמונת הקלט כמוסבר בצעדים 6.1.2.6.1 ו 6.1.2.6.2.
        2. לחץ לחיצה ימנית על תמונת הקלט להציג את ההיסטוגרמה.
          הערה: השיא של ההיסטוגרמה מציין בדרך כלל ברקע.
        3. החל מ עוצם רקע להגדיל את הפרמטר עד פילוח הגרעינים טוב מושגת כמובאת בתמונת הפלט.
          הערה: הגדרת הסף מעל הרקע חשוב עבור אתרים ריקים.
      7. במודול (8) "IdentifyPrimaryObjects", להגדיר את הפרמטר "חסם תחתון על סף" מספיק גבוה שרק Brucella מפולח ורקע הוא התעלם.
        1. כדי לזהות טוב מודול (8), צעד מעל למסוף ולהציג תמונת הקלט כמוסבר בצעדים 6.1.2.6.1 ו 6.1.2.6.2.
        2. לחץ לחיצה ימנית על תמונת הקלט להציג את ההיסטוגרמה.
          הערה: השיא של ההיסטוגרמה מציין בדרך כלל ברקע.
        3. החל מ עוצם רקע להגדיל את הפרמטר עד פילוח טוב של Brucella כמובא בתמונת פלט מושגת.
          הערה: הגדרת הסף מעל הרקע חשוב עבור אתרים ריקים.
      8. במודול (11) "FilterObjects", להתאים את "הערך המינימאלי" הפרמטר כך רקע וכלים מסוננים משם, ורק מושבות Brucella נשמרות.
        1. כדי לזהות ערך מדלג מעל מודול ולהציג את התמונה פלט כמוסבר בצעדים 6.1.2.6.1 ו 6.1.2.6.2. התחל עם הערך שנבחר 6.2.2.7 ו בשלבים להגדילו עד אובייקטים Brucella רק נשמרים.
      9. לצאת ממצב מבחן ולוודא שאף אחד המודולים להראות התצוגה שלהם לפני הפעלת ניתוח מלא על ידי unchecking כל סמלי העין ליד מודולים.
        הערה: באופן משמעותי זה מקטין משאבים החישוביים דרושים בעת עיבוד הצינור.
      10. לחצו על "נתח תמונות" כדי להתחיל את הניתוח.
      11. כאשר הניתוח סיים, לבדוק את תמונות PNG וכתוצאה מכך, כמו גם את גיליון CSV כדי להבטיח כי הניתוח עבד היטב ברחבי הצלחת.

7. זיהום ניקוד

הערה: siRNAs אשר יש השפעה משמעותית על כדאיויות תא צריך להיחשב בזהירות, שכן זה יכול לקדם תגליות חיוביות כוזבות. מספר תאים שינה משפיע על משרד הפנים בפועל ומיקוד של גנים חיוניים יכול להיות השפעת pleiotropic על זיהום הפתוגן. בעוד הדלדול השלם ידי siRNAs מאפשר לחקר גנים חיוניים, צריכים שמישהו ינתנו תוקפות מטרות כאלה על ידי שיטות חלופיות (למשל, הפרעת תרופות) כדי לאשש את תפקידם כגורמים מארחיםבמהלך ההדבקה.

  1. Assay Endpoint
    1. פתח את גיליון CSV שנוצר בשלב 6.1.2.12 ולחשב לכל שיעור זיהום היטב על ידי חלוקת מספר תאים נגועים (ההודעה CellProfiler: "Count_InfectedCells") במספר הכולל של תאים (ההודעה CellProfiler: "CountNuclei"). אם מספר אתרים לכל טוב כבר צלמו, ראשון לסכם את כל האתרים עבור כל טוב, לבנות מספר שידורים הטוב של תאים נגועים ומספר הכולל שידורים גם של תאים.
    2. בצע נורמליזציה הניקוד Z לתת דין וחשבון על וריאציות צלחת אל צלחת אם צלחות המכילות-התאמה ללא מספיק siRNAs. תניח מספר מספיק של siRNAs הלא להיט לכל צלחת אם ספריות מלאות מוקרנים.
      figure-protocol-1
  2. Assay כניסה
    1. פתח את גיליון CSV שנוצר בשלב 6.2.2.10 ולחשב לכל שיעור זיהום היטב על ידי חלוקת מספר תאים נגועים (ההודעה CellProfiler: "Count_InfectedCeLLS ") במספר הכולל של תאים (הודעת CellProfiler:". CountNuclei ") אם מספר אתרים לכל טוב כבר צלם, ראשון לסכם את כל האתרים עבור כל טוב, לבנות מספר שידורים הטובים של תאים נגועים וכן שידורים היטב מספר כולל של תאים.
    2. כדי לכמת את עומס החיידקים של תאים נגועים, להעריך את השטח הממוצע שנכבש על ידי חיידקים תאיים לכל תא נגוע. לשם כך, מחלק את האזור המשולב של כל החיידקים התאיים חופפים עם תאים (הודעת CellProfiler: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") במספר התאים הנגועים באתר זה. כדי להסביר את חפצי אמנות, השתמש החציוני של כל האתרים של ההודעה הזו כמו את ההודעה גם.
      הערה: אם assay זה משמש assay מעקב המכיל מספר רב של גנים המעורבים זיהום Brucella, אינן חלות נורמליזציה ציון Z. במקום זאת, בצע נורמליזציה באמצעות בארות מדומה כהפניה לתת דין וחשבון על וריאציה צלחת אל צלחת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 א מציג דוגמה של ניתוח התמונה המשמש לזיהוי תאים נגועים באופן אוטומטי ב assay נקודות קצה. גרעינים של תאים הלה מגואלות DAPI זוהו, א-גרעין פרי של רוחב 8 פיקסלים סביב הגרעין, וגוף התא Voronoi ובהרחבה של הגרעין על ידי 25 פיקסלים חושבו. מאז חיידקים בעיקר להתרבות בחלל פרי-גרעינית, עוצמת GFP בתחום זה של התא היא מדידת החזקה ביותר להפלות בין תאים נגועים ולא נגועים. במקרים מסוימים, ניתן למצוא חיידקים להתרבות מחוץ פרי-גרעין או כיסוי במיד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתוגנים חיידקיים פיתחו אסטרטגיות רבות למניפולציה של תאים מארחים אוקריוטיים לטובתם. פתוגנים הגורמים לזיהומים חריפים מראים לעתים קרובות התפשטות מהירה המלווה בדאגה משמעותית של מערכת החיסון ואובדן כדאיות של תאים נגועים. לעומת זאת, ברוצלה ופתוגנים אחרים הגורמים לזיהומים כרוניים מצליחים ליצור אינטראקציות ארוכות טווח בתוך תאי המארח. לכן, חיידקים צריכים לכוונן את תפקודי התא המארח לטובתם מבלי לשבש את ההומאוסטזיס התאי. אסטרטגיה נפוצה לזיהוי גורמי התא המארח המעורבים בתהליך זיהום בקנה מידה גנומי היא השימוש בדלדול גנים שיטתי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים 51RT 0_126008 ו-51RTP0_151029 עבור פרויקט המחקר והפיתוח הטכנולוגי (RTD) InfectX ו-TargetInfectX, בהתאמה, במסגרת SystemsX.ch, היוזמה השוויצרית לביולוגיה מערכתית. אנו מכירים במענק 310030B_149886 מהקרן הלאומית למדע של שווייץ (SNSF). עבודתם של S.H.L ו-A.C. נתמכה על ידי תוכנית הדוקטורט הבינלאומית "מלגות למצוינות" של Biozentrum. סימון מונטווילר זוכה להכרה על הסיוע הטכני. ברצוננו להודות לדירק בומן על אספקת pNF106 ולז'אן צ'לי עבור pJC43 ו-pJC44.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגר סויה טריפטי (TSA)BD236950
מרק סויה טריפטי (TSB)Fluka22092
קנמיצין סולפטסיגמא-אולדריץ'60615
חלב
250 מ"ל בקבוק פקק בורגקורנינג8396
DMEMסיגמא-אולדריץ'D5796
עוברי סרום עגל (FCS)Gibco10270
Trypsin-EDTA מומת בחום (0.5%)Gibco15400-054תמיסת מלאי פי 10, לדלל 1:10 ב-PBS
Scepte 2.0 Cell CounterMerck MiliporePHCC20060ניתן להשתמש בהתקני ספירת תאים חלופיים
Greiner CELLSTAR 384-well plateSigma-AldrichM2062
רדיד אלומיניום מתקלףCostar6570
מתקן ריאגנטים: "מתקן ריאגנטים Multidrop 384"ניתןלהשתמש במתקן ריאגנטים חלופיThermo Scientific5840150
מגיב טרנספקציה: "Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen13778-150
מכונת כביסה אוטומטית לצלחות: "מכונת כביסה צלחות ELx50-16"BioTekELX5016מכונת כביסה זו מכילה סעפת 16 ערוצים המתאימה לצלחות 384 בארות. הוא נכנס לארון בטיחות ביולוגית ויש לו מכסה המכסה את הצלחת במהלך הכביסה מה שמפחית את הסיכון לייצור אירוסול. ניתן להשתמש במכונות כביסה חלופיות עם תכונות דומות.
גנטמיציןסיגמא-אולדריץ'G1397
אנהידרוטטרציקלין הידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'37919100 & #956; תמיסת גרם/מ"ל ב-100% אתנול נשמרת ב-20 מעלות; C מוגן מפני אור בנייר אלומיניום
PBSGibco20012
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148מתמוסס במאגר HEPES של 0.2 M, pH 7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C ולהפשיר טרי יום לפני השימוש. אזהרה, PFA רעיל בשאיפה, במגע עם העור ובמקרה של בליעה.
HEPESSigma-AldrichH3375
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
DAPIRoche10236276001
Scrambled siRNADharmaconD-001810-10
Kif11 siRNADharmaconL-003317-00
ARPC3 siRNADharmaconL-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP)Celli et al.12
pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)בנייה: pJC44 4 עוכל עם EcoRI ואחריו יצירת קצוות קהים עם אנזים Klenov ועיכול לאחר מכן עם SalI. TetR-GFP הוגבר מ-pNF106 באמצעות פריימר prAC090 ו-prAC092. לאחר העיכול עם SalI, מוצר TetR-GFP נקשר לווקטור pJC44 המעוכל.
פריימר prAC090סיגמא-אולדריץ'TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092סיגמא-אולדריץ'TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT
TC HeLa CCL-2ATCCCCL-2
ImageXpress מיקרומכשירים מולקולריים IXM IMAGING MSCOPEמיקרוסקופ הדמיה סלולרי אוטומטי המצויד ב-Z-stage ממונע מדויק. ניתן להשתמש במערכות חלופיות למיקרוסקופיה אוטומטית ורכיבים חלופיים עבור קשיח ותוכנה המפורטים להלן.
לייזר מהיר מיקוד אוטומטיהתקנים מולקולריים 1-2300-1037
CFI סופר פלואור 10X אובייקטיביNikon MRF00100NA 0.50, W.D 1.20 מ"מ, פריזמת DIC: 10X, פוטומטריה טעונה קפיץ
CoolSNAP HQ מונוכרום CCD מצלמההתקנים מולקולריים 1-2300-10601,392 x 1,040 פיקסלים להדמיה, 6.45 x 6.45 ומיקרו; m פיקסלים, 12 ביטים דיגיטציה
תוכנת MetaXpressהתקנים מולקולריים 9500-0100
LUI-Spectra-X-7LumencorSPECTRA X V-XXX-YZמנוע אור. נעשה שימוש במקורות האור הבאים: סגול (DAPI), ציאן (GFP), ירוק/צהוב (RFP)
סינגל בנד אקסיטר ל-DAPIסמרוקFF01-377/50-25
פולט סינגלסינגל סמרוקFF02-447/60-25
סינגל בנד דיכרואיק ל-DAPIסמרוקFF409-DI03-25x36
סינגל בנד אקסיטר ל-GFPסמרוקFF02-472/30-25
פולט פס יחיד עבור GFPSemrockFF01-520/35-25
סינגל בנד דיכרואיק עבור GFPSemrockFF495-DI03-25x36
סינגל בנד אקסיטר ל-RFPSemrockFF01-562/40-25
פולט סינגל בנד ל-RFPSemrockFF01-624/40-25
סינגל בנד דיכרואיק ל-RFPSemrockFF593-Di03-25x36
רזה של .

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
  2. Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
  3. Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
  4. Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
  5. Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
  6. Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
  7. Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
  8. Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
  9. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110(2008).
  10. Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162(2014).
  11. Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043(2013).
  12. Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
  13. Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
  14. von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
  15. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA InterferenceAutomated MicroscopyImage AnalysisCellProfilerEndpoint AssayEntry Assay

מאמרים קשורים