מאמר שיטה

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

DOI:

10.3791/54265

⸱

13 באוגוסט 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences in Philadelphia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולים לתרבית תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC), טרנספקציה חולפת של סמנים פלואורסצנטיים של צמיחת מיקרו-צינוריות, הדמיית תאים חיים וניתוח אוטומטי של דינמיקת צמיחת מיקרו-צינורות בין-פאזיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התהליך הפיזיולוגי שבו נוצרים כלי דם חדשים מכלי דם קיימים דורש אירועי איתות ספציפיים המעוררים שינויים מורפולוגיים בתוך תאי אנדותל בודדים (ECs). תהליכים אלו קריטיים לתחזוקה הומאוסטטית כגון ריפוי פצעים, והם גם חיוניים בקידום צמיחת גידול וגרורות. מורפולוגיה של EC מוגדרת על ידי ארגון השלד הציטולוגי, מערכת מווסתת היטב של דינמיקת אקטין ומיקרו-צינורות (MT) הידועה כשולטת בהסתעפות EC, קוטביות והגירה כיוונית, מרכיבים חיוניים של אנגיוגנזה. כדי לחקור דינמיקת MT, השתמשנו במיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה יחד עם ניתוח תמונה חישובי של קצוות פלואורסצנטיים של MT כדי לחקור את דינמיקת הצמיחה של MT ואת הוויסות של מורפולוגיה של הסתעפות EC והגירה כיוונית. הדמיית זמן-lapse של תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים חיים (HUVECs) בוצעה לאחר טרנספקציה עם חלבון קושר קצה MT 3 (EB3) עם תווית פלואורסצנטית ומבני cDNA ספציפיים לצנטרומר מיטומר (MCAK) כדי להעריך את ההשפעות על דינמיקת MT. תוכנת PlusTipTracker שימשה למעקב אחר קצוות MT פלוס עם תווית EB3 על מנת למדוד את מהירויות הצמיחה של MT ואת אורך חיי הצמיחה של MT בתמונות זמן-lapse. מתודולוגיה זו מאפשרת לחקור את דינמיקת ה-MT ולזהות כיצד ויסות מקומי של דינמיקת MT באזורים תת-תאיים תורם לתהליכים האנגיוגניים של הסתעפות והגירה של EC.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנגיוגנזה מופעלת על ידי רמזי איתות תאיים המקדמים בתאי האנדותל (EC) לקטב, נודדים עם ייחוד כיוונית, ויוצרים כלי דם חדשים ברקמות הדורשים אספקת דם. גורמים תורמים חשבו לנהוג אנגיוגנזה הם אותות מן מטריקס (ECM). בתגובה רמזים פיזיים, ECS להאריך סניפים חדשים עם ייחוד כיוונית להנחות כיווני תנועה במבנה של 1,2 רשת כלי הדם. הארכיטקטורה של מורפולוגיה הסתעפות EC מוגדרת על ידי רגולציה מקומית של שלד תא microtubule (MT) בצורה מתואמת עם הסדרת contractility acto-שרירן 3. על מנת סניפים EC להיווצר, שרירן-II חייב להיות downregulated מקומית, וכתוצאה מכך בליטות קרום מקומי 4. באותו הזמן באותו המקום בתוך התא, דינמיקת צמיחת MT הופכת שונה וכתוצאה מכך צמיחת MT איטית ומתמשכת לקידום ענף אלוןgation ויציבות 5. תקנה cytoskeletal מתואמת זו מאפשרת ECS לקטב המורפולוגיה שלהם כדי להקל על ההגירה כיוונית.

ההתפתחות המינית של מורפולוגיה תא מקוטבת דורשת MT המקוטב הרכבה 6. בעת העברת לתאי האפיתל, MTS לגדול לאט במיוחד בהתמדה בחוד החנית של התא 7-9; בעוד בנוירונים, בייזום ההתארכות של אקסונים או דנדריטים דורשים כי MTS הם לא רק בהווה, אלא כי הם דינמיים עוברים תהליכי ההרכבה ופירוק 10-15. בדרך זו, שליטה מקומית של דינמיקת צמיחת MT מקובעת את הארכיטקטורה של התא ומאפשרת שיפוץ מהיר של מורפולוגיה תאים כמו ECS לנווט ECM שלהם.

דינמיקת צמיחת MT מוסדרת על ידי משפחות של חלבוני מנוע מולקולריים וחלבונים לא מנועים, כינת חלבונים הקשורים microtubule או microtubule מתנגש חלבונים (להלן Referred כדי כמפות). מפות ניתן להפעיל באופן מקומי או מומת, בדרך כלל באמצעות איתות מפלי יזם בממשק התא ECM 16,17. ברגע פעיל, מפות פונקציה על ידי קשירה של MT ושינוי קינטיקה של הרכבה ופירוק MT; ובכך תפקוד מקומי להסדיר דינמיקת MT כדי לקדם צורת תא קוטבי 18-20. Mitotic centromere Associated Kinesin (MCAK) היא מפה המשפחה Kinesin-13 הנקשרת הקצוות וזוגות MT הידרוליזה ATP כדי פירוק MT 21-23. תפקיד פונקציונלי זה של MCAK ידוע להיות קריטי בתוך 24-28 ציר mitotic, כמו גם במהלך שלבי 29,30. בתוך השלבים ECS, פירוק MT בתיווך MCAK מוסדר על ידי זרחון המושרה אורורה-A המקומי של MCAK בתגובה לפצוע קצה הפעלה מושרה של GTPase Rac1 הקטן. התוצאה של מפל איתות לכך היא עיכוב של MCAK בחוד החנית של ECS, כשהתוצאה היא צמיחה MT מקוטב כלפי leading קצה ופירוק MT-induced MCAK בקצה המאסף של נודדות 31 ECS.

מתודולוגיות מסורתית למדידת הדינמיקה צמיחה MT בדרך כלל השתמשו ביד מעקב של טובולין fluorescently שכותרתו או או, ולאחרונה, שכותרתו fluorescently חלבון מחייב MT סוף 1 או 3 (EB1 או EB3, בהתאמה). הגישה טובולין פלורסנט יש את היתרון של תיוג מערך MT כולו. עם זאת, משום שרוב סוגי תאי mitotic לשמור על מערך רדיאלי של MTS במהלך השלבים 8,32,33, MTS ליד centrosome מאוד צפוף, וכתוצאה מכך, מעקב צמיחת MT ופירוק עם טובולין ניאון בדרך כלל מוגבל לציוד ההיקפי אזורים של התא. המגבלות האלה, ניצול של חלבוני EB-שכותרתו fluorescently (EB1 או EB3) כבר הגישה הנפוצה יותר למדידת דינמיקת MT. בגלל EBS רק התווית הפלוס בסיום הגדילה של MTS, הם מופיעים כמו קטנים (1-3 מיקרומטר), ניאון בהיר לבואts, ובכך לספק סמן להבחין בקלות של פילמור MT עם קרינת רקע מוגבלת מאוד 34-37. בעוד העובדה תווית EBS רק קבוצת משנה של מערך MT מייצגת כוח עיקרי של גישת EB, הוא גם ממחיש מגבלה אחת חשובה, כי MTS שאינו צומח לא מסומן על ידי גישת EB3. עם זאת, היכולת למדוד ולעקוב אחר שביטי EB3 לאורך זמן וכדי להמחיש צמיחת MT בתוך האזורים הסלולר תת לעשות אידיאלי גישה זו עבור יישומים הדורשים ערכה אזורית של ארגון MT.

מגבלה קריטית נוספת של מתודולוגיות מסורתית דינמיקת צמיחת MT מדידה כבר ערכות נתונים גדולות מאוד והזמן הדרוש לניתוח נתונים. מגבלה זו נובעת מהצורך למעקב יד של מאה שביטי EB ברזולוציה גבוהה בזמן. יתר על כן, מדידות אלה צריכות להיעשות מספר משמעותי סטטיסטי של תאים וגם בצעו תחת מגוון מלא experimeתנאי פתיחות opening סגירות closures. לאחרונה, האילוצים הללו הוכרעו באמצעות טכניקות ניתוח חישובית מכוונת ספציפית שביטים מעקב EB3 באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות בתאים חיים 35. כאשר נעשה שימוש כראוי, גישה חישובית זה משמש הוא להגביל את הפוטנציאל לטעויות אנושות הקשורים מעקב יד מעבר למתן שיטת תפוקה גבוהה של מדידת פילמור MT. ניתוח חישובית של דינמיקת MT באמצעות חבילת תוכנה מבוססת Matlab, plusTipTracker, מאפשר למדידות של צמיחת MT על ידי מעקב אחר שביטי EB3 שכותרתו fluorescently 5,31,35,38. בנוסף, תוכנת plusTipTracker מאפשרת חישובים של אירועי אסון MT (פירוק aka) מבוסס על העלמות שביטי EB3 בתוך מסלול MT גדל, ומאפשרת משנה הסלולר (aka אזורי) ניתוח של דינמיקת צמיחת MT בתוך אזורים המוגדר על ידי משתמש של עניין . עבור המחקרים שלנו, דינמיקת צמיחת MT הושוותה בתוךאזורים מסועפים לעומת אזורים שאינם קנים, או בתוך מובילים לעומת נגרר קצות תא. פלט נתונים מתוכנת plusTipTracker יכול לשמש גם כדי ליצור שכבות מסלול בצבעים עבור תאים בודדים ואזורי משנה הסלולר.

כאן אנו מתארים את המתודולוגיה ששימשה לחקור את התפקיד של MCAK בויסות הדינמיקה צמיחה MT והתרומה של MT depolymerase זה להסדרת EC הסתעפות מורפולוגיה והגירה כיוונית. הגישה שלנו השתמשה שורת תאים ראשונית אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs), אשר בקלות תרבותית נוחים מאוד, transfection החולף נגרמת electroporation של cDNA פלסמיד. לאחר מכן השתמשו ברזולוציה גבוהה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות של HUVECs טרנספקציה עם סיום MT חלבון מחייב 3 (EB3) ו mitotic centromere Associated Kinesin (MCAK) cDNA -specific בונה כדי לבדוק את ההשפעות על הדינמיקה MT טרנספקציה HUVECs. PlusTipTracker מבוסס ניתוח תמונה חישובית של EB3MT בתוספת הקצוות -labeled היה למדוד מהירויות צמיחת MT ו גלגולי צמיחת MT בתמונות זמן לשגות, למדוד ולהשוות השפעות של מניפולציות ניסיון על דינמיקת צמיחת MT. מתודולוגיה זו מאפשרת לחקר דינמיקת MT וזיהוי כיצד רגולציה מקומית של דינמיקת MT בתוך אזורי משנה הסלולר תורמת לתהליכי angiogenic של הסתעפות והגירת EC. טכניקות אלו חלות על חקירות של כל MAP כי יכול להיות מתויג fluorescently והביע בתאים חיים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבות ותחזוקה HUVEC

  1. כן מלא בינוני בסיס אנדותל על ידי הוספת את כל התוכן של חבילת תוספת מדיום גידול תא האנדותל ואת תערובת אנטיביוטיקת פניצילין 5% / סטרפטומיצין כדי פנול תקשורת בסיסית אדום ללא האנדותל (ראה חומרים / רשימת ציוד לפרטים נוספים). בינוני בסיס אנדותל מלא חמים 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  2. הסר אחד HUVEC cryovial אחסון חנקן נוזלי להפשיר במהירות באמבט מים C 37 מעלות במשך 2 דקות. כאשר ~ 80-90% מופשר, להוסיף 500 μl של מדיום הבסיס המלא חימם האנדותל אל cryovial, ומערבבים על ידי pipetting, ולחלק התאים באופן שווה לתוך צלחת פלסטיק תרבות רקמה 100 מ"מ המכיל 15 מ"ל של מדיום הבסיס המלא חימם האנדותל.
  3. המקום התאים לתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2. אפשר תאים לדבוק לילה. אין להסיר או לשנות את תרבית תאים בינוניים.
  4. כאשר המנה 100 מ"מ הוא> 90% ומחוברות, להעביר HUVECs in כדי בקבוקון מטופלים תרבות 75 ס"מ 2 רקמות ולקיים> מפגש 60% בכל עת (ראה שלב 1.5).
    הערה: כאשר שמרו על% צפיפות> 60, זמן הכפלת HUVEC הוא בעקביות 18-20 שעות.
    1. עבור מצבים שבהם passaging התאים אינו הכרחי (כלומר הצפיפות היא <90%), לשאוב את המדיום ולהחליף עם מדיום בסיס אנדותל שלם טרי כל 48 שעות.
  5. כאשר HUVECs להגיע> 90% המפגש, לשטוף 2 פעמים עם 10 מ"ל של PBS 1x, ולאחר מכן להסיר את התאים מצלחת בתרבית רקמה תוך התייחסות אליהם 1.5 מ"ל של טריפסין 0.25% למשך 1-2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: הכדאיות של HUVECs מופחת במידה ניכרת על ידי הארכת משך החשיפה טריפסין.
  6. הצלה התאים על ידי הוספת בינוני הבסיס אנדותל להשלים 8.5 מ"ל לתערובת טריפסין / HUVEC ביחס של 4: אנדותל 1 המלא התקשורת הבסיסי: טריפסין (יחס מינימלי), ולאסוף צינור חרוטי 15 מ"ל.
  7. צנטריפוגות ב 1,400 XG למשך 4 דקות. לשאובsupernatant.
  8. Resuspend גלולה ב 2 מ"ל של מדיום הבסיס אנדותל להשלים ולהוסיף את התאים בקבוק תרבות 225 ס"מ חדש 2 רקמה המכילה 25 מ"ל של מדיום הבסיס אנדותל מלאה.

2. הכנת Coverslip לפני HUVEC תרבות

  1. Coverslips ציפוי עם מצעי פיברונקטין.
    1. הכן צח ונקי 22 מ"מ מס '1.5 coverslips 39 ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT) באתנול 100%.
    2. השתמש מבער בונזן כדי להבת coverslip ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ באמצעות פינצטה.
    3. הכינו תערובת פיברונקטין / PBS על ידי ערבוב 10 μl של המניה פיברונקטין (1 מ"ג / מ"ל) עם 990 μl של PBS.
    4. פיפטה 250 μl של התערובת פיברונקטין / PBS על coverslip בצלחת 35 מ"מ. מורחים באופן שווה כדי לכסות את פני השטח של coverslip.
    5. דגירה צלחת למשך תקופה מינימלית של 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ולשטוף 3 פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS לפני השימוש.
  2. Coverslips ציפוי עם polyacrylamide (PA) מצעים.
    1. הפעלת coverslip
      1. מניחים coverslip מס '1.5 22 מ"מ ב -50% 3-aminopropyltrimethyloxysilane במשך 10 דקות על צלחת ומערבבים. לאחר דגירה, לשטוף 10 פעמים עבור 2 דקות כל אחד פעמיים מזוקקים H 2 O (DDH 2 O).
      2. דגירה coverslip ב glutaraldehyde 0.5% למשך 30 דקות על צלחת ומערבבים. לאחר דגירה, לשטוף 10 פעמים עבור 2 דקות ב DDH 2 O.
    2. הכנת polyacrylamide
      1. הכן ג'ל הרשות עם תאימות של 0.7 קילו פסקל (kPa) על ידי הוספת acrylamide 3.75 מ"ל של 40%, 0.3 מ"ל של 2% bis-acrylamide, ו 0.95 מ"ל של DDH 2 O.
      2. כן פתרון עובד 10% של persulfate אמוניום (APS) ולאחסן על קרח עד לשימוש.
      3. כדי להכין את הפתרון הרשות על 1 coverslip (הנפח הכולל = 166.7 μl), להוסיף 0.83 μl של DDH 2 O, 41.7 μl של פתרון bis-acrylamide (עשה צעד 2.2.2.1), 124 μl של APS 10%, ו 0.25 μl של TEMED.
      4. מיד pipet 15 μl של פתרון הרשות לשקופית זכוכית הידרופובי (ראה רשימה ריאגנטים) ומכסים עם coverslip מס מופעל 22 מ"מ 1.5. אפשר הרשות לפלמר במשך 20 דקות ב RT.
      5. הסר את coverslip ולהעביר לצלחת 35 מ"מ. לשטוף 3 פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS. אחסן עבור <2 שבועות 4 ° C.
      6. כדי לקשור פיברונקטין הג'ל polyacrylamide, לחשוף את coverslips מצופה polyacrylamide עד 2 מ"מ sulfo-SANPAH עם 7,500 J של אור UV (254nm). יש לשטוף מיד עם DDH 2 O.
      7. הכינו תערובת פיברונקטין / PBS על ידי ערבוב 10 μl של המניה פיברונקטין (1 מ"ג / מ"ל) עם 990 μl של PBS.
      8. פיפטה 250 μl של התערובת פיברונקטין / PBS על coverslip (ים) בצלחת פטרי 35 מ"מ. מורחים באופן שווה כדי לכסות את פני השטח של coverslip.
      9. דגירה צלחת למשך תקופה מינימלית של 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ולשטוף 3 פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS לפני השימוש.

class = "jove_title"> 3. Transfection cDNA ו HUVEC תרבות על Coverslip

  1. פעולות מלאות 1.5-1.6.
  2. באמצעות hemocytometer, לספור את מספר הסלולרי ולאסוף נפח המכיל 100,000 תאים / coverslip (לניסויים שאינם הגירה) או 500,000 תאים / coverslip (לניסויים הגירה). גלולת התאים באמצעות צנטריפוגה ב 1,400 XG למשך 4 דקות.
    הערה: פרוטוקול הגירה מתואר בסעיף 9 להלן.
  3. תאים Resuspend להיות transfected עם 100 חיץ electroporation μl. מערבבים עם 1 מיקרוגרם cDNA ומקום לתוך קובט electroporation. תאים electroporate: תערובת DNA באמצעות תוכנית המיועדת electroporation HUVEC (# תוכנית לדוגמה: A-034).
  4. הצלת transfected תאים עם 500 μl מלא תאים בינוני צלחת בסיס אנדותל על coverslip פיברונקטין מצופה 22 מ"מ מס '1.5 (ראה 2.1 פרוטוקול, לעיל). לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 שעות, כדי לאפשר זמן ביטוי של מבני cDNA.
le "> 4. הכנת הדגימה הדמיה

  1. חותכים נייר דו צדדית לתוך 2.5 ס"מ x 0.65 רצועות ס"מ.
  2. השג שקופית זכוכית נקייה. קח שתי רצועות דבק דו-צדדי ומאובטח בצורה אופקית לאורך הקצה העליון והתחתון של השקופית. הערה: חשוב לאפשר כמות קטנה של שטח בין הסרט לבין קצה השקופיות לאיטום התא כמתואר בשלב 4.5).
  3. coverslip הר (מ שלב 3.4; תא בצד למטה) כך 2 הקצוות של שאר coverslip בקלטת. שימוש במלקחיים ומהדקים בעדינות כדי לאבטח את coverslip.
  4. שימוש micropipette, להוסיף 40 μl של מדיום הדמיה (בינוני בסיס אנדותל מלא בתוספת 25 מיקרומטר HEPES) בין coverslip והחלק. ודא כי השטח בין coverslip והחלק מלא לחלוטין עם מדיום הדמיה. מדיום הדמיה עודף לשאוב (במידת צורך).
  5. חותם את כל הקצוות עם VALAP חם (1: 1: וזלין 1: לנולין: פרפין). בדוק דליפות ידי דחיפת gently על coverslip הזכוכית.
  6. המקום רכוב וחתום coverslip על מחומם מראש (37 ° C) הבמה מיקרוסקופ.

מיקרוסקופי 5.

  1. באמצעות מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב מצויד 60X, 1.40 נומרית הצמצם (NA) התערבות הפרש לעומת זאת (DIC) עדשה אובייקטיבית טבילה שמנה, מערכת ניטור פוקוס אוטומטי (PFS), תריס אלקטרוני לתאורה משודרת, X-ו-Y motored הבמה, מסננים לעבור הלהקה שוכן גלגל לסנן אלקטרוניים, ואת מודול combiner לייזר מונוליטי, למקד את המיקרוסקופ על הממשק של התא / coverslip ולהשתמש ג'ויסטיק מיקרוסקופ הבמה לאתר תא בודד.
  2. הקש על לוח "הגדרות מצלמה" בתוכנת תמונה. בתוך חלון "זמן החשיפה" הנפתח של לוח הגדרות מצלמה, בחר 400 msec.
    הערה: פעמי חשיפה עשויות להשתנות וצריכות להיקבע באופן אמפירי.
  3. הקישו על לוח "רכישת ND" בתוכנת תמונה. בכרטיסייה למבדה (λ) של לוח רכישת ND, לחץ על תיבות הסימון כדי לבחור את 488 ו 561 nm לייזרים. בכרטיסיית "הזמן" של לוח רכישת ND, להגדיר את זמן הרכישה עד 2 שניות ואת הזמן הכולל עד 2 דקות.
  4. לחץ על כפתור "הפעל כעת" בתוך לוח רכישת ND לרכוש רצף תמונה 2 דקות הזמן לשגות ב 2 מרווחי הרכישה השנייה באמצעות זמן חשיפת 400 msec היא עבור תאורת 488- ו 561 ננומטר.
  5. בחלונית "Config האופטי" של תכנית תמונת התוכנה ושימוש בהגדרות המצלמה כמתוארת בשלב 5.2, לחץ על כפתור ליזר 405 ננומטר ולאחר מכן לחץ על "רוכש" ללכוד תמונה אחת של חלבון פלואורסצנטי כחול (BFP) חלבוני -labeled .
    הערה: מומלץ בדרך כלל כדי להגביל את החשיפה התא (תדירות לכידת תמונה ו / או זמן החשיפה) כדי תאורת לייזר 405 ננומטר כמו אורך הגל הזה יכול לגרום נזק לתאים לאורך זמן.
    1. עבור מחקרים MCAK-shRNA,cquire תמונה 405 ננומטר יחיד כדי לאמת את הביטוי של shRNA שכותרתו BFP.
  6. בחלונית "Config האופטי" של תוכנת תמונה תוך שימוש בהגדרות המצלמה כמתוארת בשלב 5.2, לחץ על כפתור דסק"ש ולאחר מכן לחץ על "רוכש" כדי ללכוד את תמונת DIC ותכונה של התא עבור הסתעפות ניתוח מורפולוגיה (ראה סעיף 10 , להלן).
  7. בעקבות רכישת התמונה, השתמש בפונקציה "בהירות / ניגודיות" בתוכנה התמונה כדי להגדיל את האות תמונה דיגיטלית.
  8. יצא את הבהירות ותמונות עם התאמת ניגודיות. לחץ על "קובץ" ולאחר מכן לחץ על "שמירה בשם" ולאחר מכן לחץ כדי לבחור "טיף" עבור סוג קובץ תמונה.
    הערה: בדרך כלל זה מפיק 61 .tif קבצי תמונה מתוך רכישת יחיד 2 דקות זמן לשגות כאשר כבשו כמתואר שלב 5.4.

6. ניתוח Dynamics MT

  1. למעקב EB3, השתמש plusTipTracker התוכנה 35, קוד פתוח,MatLab מבוסס חבילת תוכנת חישובית מיועדת זיהוי אוטומטי, מעקב, ניתוח ויזואליזציה של EBS שכותרתו fluorescently.
  2. ממשק משתמש plusTipGetTracks הגרפי (GUI)
    1. כדי לגשת GUI plusTipGetTracks, סוג plusTipGetTracks.
    2. לגילוי שביט EB3, השתמש GUI לגלוש ובחר בספריית האב המכיל את תמונות tif.
    3. בתוך לוח פרמטרי מעקב של ה- GUI plusTipGetTracks, הזן את הערכים הבאים: חיפוש טווח רדיוס = 5 - 10; אורך תת-Track מינימום = 3; מקס גאפ אורך (מסגרות) = 12; מקס התכווצות פקטור = 1.0; זווית קדימה מרבי = 25; זווית מקסימלית אחורה = 10; תנודות רדיוס (פיקסלים) = 2; מסגרת שיעור (sec) = 2; גודל פיקסל (מיקרומטר) = 110.
      הערה: ראשית לבדוק את הפרמטרים למעקב אופטימלי באמצעות plusTipParamSweepGUI על סט נציג .tif קבצי תמונה. הערך שהוזן עבור גודל פיקסל הוא ספציפית העדשה האובייקטיבית נהגה לרכוש את תמונת הזמן לשגותs (ראה שלבים 5.1-5.2, לעיל).
    4. עבור אזור בחירת העניין (ROI), ליצור מסכות בינארי של התא כולו על ידי התחקות קצה התא באופן ידני באמצעות תמונת DIC של התא כדי ליצור פוליגון.
    5. עבור תת-מחוז עניין הבחירה (תת-ROI), ליצור מוביל ונגרר מסכות קצה על ידי ציור ידני קו 2 נקודות עבה על פני קצה תא פצע של עניין באמצעות כלי בחירה תת-ROI plusTipTracker שונה.
      הערה: הקו צריך להיגרר במקביל לקצה הפצע במיקום שבו תא העניין חורג תאי שכני קצה פצע 31.
  3. GUI plusTipSeeTracks
    1. ודא ובדוק אם שכבות המסלול של התמונות .tif מאוחסן בתיקייה "ROI" על ידי לחיצה על "מגרש Tracks" כפתור בעמודה שכבות מסלול. חזור על הפעולה עבור כל שכבות המסלול.
    2. בצע קיבוץ נתונים על ידי לחיצה על כפתור "יצירת הקבוצות" בעמודת ההגדרות האופציונליות. בחר את experimנתוני ental ששייך לאותו בסיס הנתונים על ידי לחיצה על קובצי הנתונים. שמור את הבחירה על ידי מתן "הקבוצה" שם כי ניתן לזהות בקלות (למשל, "קבוצת ביקורת").
    3. עבור מדידות דינמיקת צמיחה תת-ROI MT, הזן את המספר המזערי של תמונת מסגרות אותו מסלול שביט EB3 אחד חייב להתגלות בתוך-ROI משנה על מנת להגיע לרמה כמו "מסלול" ולחלץ טיולי צמיחת MT בתוך ROI הקצה המוביל ונגרר על ידי לחיצה על "בחירה ידנית" בתוך הפאנל "תת-ROIs" של ה- GUI.
      הערה: לדוגמה, השתמש 3 מסגרות (6 שניות) כמו אורך זיהוי המינימום להיעקר כמו "מסלול". מסלולים מופקים-ROIs תת מאוחסנים בתוך תיקייה תת-פרויקט בתוך תיקיית ROI המקורית עבור כל תא.
    4. צמיחת MT תת-מסלול וניתוח subpopulation
      1. חשבת את מהירות צמיחת MT הממוצעת ולהתכוון לכל חי צמיחת MT עבור מערכי נתונים "קבוצה" (ראה שלב 6.3.2), עבור כל ROI (ראה STEp 6.2.4), ועבור כל-ROI משנה (ראה שלב 6.2.5).
    5. בתוך הטור מגרש פיזור Quadrant של GUI plusTipSeeTracks, לחץ על "קבוצות בחרו" ולחץ על הקבוצות (שיצרו בשלב 6.3.2) כדי להשוות.
      1. בחר "מהירות צמיחה" עבור אפשרות ציר x ו הקלד את הערך הממוצע עבור מהירות צמיחה (משלב 6.3.4) לתוך הקופסה. בחר "חי צמיחה" עבור אפשרות ציר y ו הקלד את הערך הממוצע לכל חי צמיחה (משלב 6.3.4) לתוך הקופסה.
    6. סמן את התיבה שליד "סר מסלולים בתחילה / סיום" וליד "תהליך תצווה על קבוצות." לחץ על "הפוכים מגרשים" כדי ליצור פרופיל הפצת מסלולי צמיחת MT עבור התא כולו, קצוות מובילים, ונגררים קצוות-ROIs משנה.
      הערה: מחקרים המתואר כאן, פסי צמיחת MT מופצים לארבע תת-אוכלוסיות: איטי קצר מועד, איטי קבוע לטווח ארוך, מהיר קצר מועד, ומהר וארוך ימים.
    7. העתק את הערכים הממוצעים משלב 6.3.4 לתכנית גיליון אלקטרוני תוכנה ולשמור את הקובץ עם סיומת xls.
      1. לחץ על "נתונים" ולאחר מכן לחץ על "ניתוח נתונים" מהחלון הנפתח נתונים. "מבחן t: שני מדגם בהנחת סטיות שווות" בחר כדי להשוות אומר מירויות צמיחת MT ו גלגולי צמיחת MT. דגש תאי נתונים בתוך הגיליון האלקטרוני שבו השוואות מבחן t לגרום ערך-p <0.001.

7. ניתוח colocalization

  1. לקבלת רקע חיסור, באמצעות "כלי השורה" של תכנית תוכנת הדמיה, לצייר אזור של העניין (ROI) על ידי לחיצה על המסך כדי ליצור צורת ריבוע כי הוא 10 מיקרומטר 2 על תמונת מסלול הירוקה (488 העירור ננומטר) בשעה במצב שבו אין קרינת תא (ברקע). חזור על פעולה זו עבור תמונת המסלול האדומה (561 עירור ננומטר) באמצעות התמונות משלבות 5.8.
  2. באמצעות יחסי ציבור תוכנת הדמיהogram, לחץ לחיצה ימנית על ROI משלב 7.1 ונבחר "סידרה כמו ROI רקע." לחץ על "תמונה", ואז ללחוץ על "רקע הפחת" מהחלון הנפתח כדי להפחית את ערכי רקע הממוצע (מ שלב 7.1) מן כולו תמונה. בצע רקע חיסור עבור תאים שיתוף להביע Em-אורורה A ו- או mCherry-MCAK, Mapple-EB3, או Mapple טובולין.
  3. בתמונת המסלול האדומה מופחת רקע בלבד, לחץ על סרט בינארי ובחר "גדר סף" ולאחר מכן לבחור את הפונקציה "לכל ערוץ" להוציא את בסמן פלורסנטי המיועד.
    הערה: השלב thresholding בוצע על גם את mCherry-MCAK, Mapple-EB3, או Mapple טובולין תמונה כדי לאפשר ציור קווים שסימן את האובייקט thresholded במיוחד עבור ניתוח שיתוף לוקליזציה (ראה שלב 7.4).
  4. באמצעות כלי קו תוכנת ההדמיה, למתוח קו עבה 2 נקודות מעל האובייקטים נשללו בתוך התמונה thresholded.
  5. בחר את האובייקטים למתוח קו בשלב 7.4. העתק והדבק את אובייקטי קו מהערוץ האדום על המסלול ירוק המתאימה לו (Em-אורורה א) תמונה.
  6. מדוד את הערך עוצם פיקסל בגווני אפור מתחת לקו מתנגד לחשב את ערכי שיתוף הלוקליזציה ומוחלטים Em-אורורה-A עבור כל תא יחיד על ידי בחירה "מדוד" ואז "פרופיל אינטנסיביות" מהחלון הנפתח בתוכנה עוצמה הדמיה.
    1. ארגן את הנתונים על ידי טיפול ניסיוני ואזור משנה הסלולר ידי יצוא לתוכנת גיליון אלקטרוני ושמירת הקובץ כסוג .xls (למשל, "control_grayscale_intensity.xls").
      הערה: הנתונים מוצגים בדרך זו מייצגת את החלק היחסי לוקליזציה שיתוף-A Em-אורורה הכולל הנמדד לפי אזור המשנה הסלולר.
  7. באמצעות הערכים הנמדדים משלב 7.6, חזור על שלב 6.3.7 לחשב את המובהקות הסטטיסטית באמצעות p <0.05 כמו הסף משמעות.
8. immunofluorescence

  1. תקן תאים (ראה שלב 3.4) עם paraformaldehyde / glutaraldehyde שאיבת שיתוף / חיץ קיבעון (PGF-PHEM; 4% paraformaldehyde, glutaraldehyde 0.15%, 0.2% חומר ניקוי ב 60 צינורות מ"מ, 27.3 מ"מ HEPES, 10 מ"מ EGTA, ו -8.2 מ"מ MgSO 4, pH 7.0) במשך 10 דקות ב RT.
  2. לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות עם 2 מ"ל של 1x PBS.
  3. פנקו 2 פעמים במשך 15 דקות עם 0.01 גר '/ מ"ל NaBH 4 ב 1x PBS להרוות אלדהידים תגובתי.
    הערה: צורות NaBH 4 בועות שיכולים לגרום coverslips לצוף. זה קריטי, כי את coverslips להישאר תחת המים במהלך incubations אלה. אם coverslips מתחיל לצוף, להשתמש במלקחיים כדי לרומם קצה אחד של coverslip כדי לאפשר הבועות להימלט.
  4. לשטוף 2 פעמים עם 1x PBS לפני החסימה עם 5% שומן חלב ב 1x PBS על פלטפורמת נדנדה עבור שעה 1 ב RT.
  5. דגירה תאים נוגדנים ראשוניים (ארנב אנטי pT288-אורורה (1: 1,000)) ואנטי-α-טובולין חולדה (1: 500) שהוכנו פתרון 1x PBS. דגירה על 4 מעלות צלזיוס על לילה פלטפורמת נדנדה.
  6. הסר נוגדנים ראשוניים לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות 1x PBS לפני דוגרים עם נוגדנים משני (חמור ארנבת אנטי (1: 1,000) ואנטי-עכברוש עיזים (1: 1,000)) שהוכנו 5% חלב ללא שומן עבור שעה 2 על 37 מעלות צלזיוס.
  7. coverslip ההר בשקופית זכוכית במדיום הרכבת אופטימיזציה קרינה. לאטום את הקצוות coverslip לשקופית באמצעות לק ברור, ולאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס.

9. Cell Assay הגירה

  1. בצע תרבות HUVEC עבור מבחני הגירה כמתואר לעיל (פרוטוקול 3: Transfection cDNA ו HUVEC תרבות על Coverslip, שלבים 3.2-3.3).
  2. בעקבות transfection התא, תאים transfected הצלה עם 80 μl שלם בינוני הבסיס אנדותל. פיפטה מדגם 80 μl כמו טיפה אחת על במרכז coverslip מס '1.5 עגולה פיברונקטין מצופה מיובש 22 מ"מ. אין להפיץ את dro 80 μlp. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 שעות, כדי לאפשר זמן לדבקות תא לתוך monolayer ומחוברת.
    הערה: ייבוש coverslip נחוצה כדי למנוע את הירידה 80 μl מלהתפשט במגע של coverslip. גישה זו מאפשרת HUVECs להיות מרוכז בתוך שטח קטן של coverslip ובכך מקדמת את הקמתה המהירה של monolayer ומחוברות של תאים.
  3. לשטוף 2 פעמים בינוניות בסיס אנדותל מלא כדי להסיר תאים בלתי-מצורפים.
  4. כדי ליצור "קצה פצעים," לגרד את coverslip עם סכין גילוח מעוקרים ידי גרירת סכין גילוח נקי בעדינות על פני בשכבה HUVEC (מ שלב 9.2). החזק את coverslip בעדינות במקום עם מלקחיים כדי למנוע זליגה של סכין גילוח במהלך גירוד.
  5. אפשר התאים להתאושש בתוך 37 ° C חממה עבור 3 שעות. להתקהל הר coverslip (ות) עבור הדמיה (ראה פרוטוקול 4).
  6. רוכש שלב בניגוד ו 488 תמונות ננומטר ב 10 מרווחי דקות במשך 12 שעות על המיקרוסקופ באמצעות10x 0.45 NA שלב אובייקטיבי מעבה 0.52 NA lwd באמצעות לוח "רכישת ND" של התוכנה רכישת התמונה (המתואר בשלב 5.3).

כימות 10. של מסעף וההגירה HUVEC

  1. עבור הסתעפות ניתוח כדי לאפשר אפילו תאורת תא וכימות משוחדת, לרכוש תמונה מיקרוסקופית של HUVEC transfected (ראה שלב 3.3) ומבטא את cDNA Mapple-C1 לבנות, סמן נפח תא.
  2. באמצעות תכנית תוכנת ההדמיה, פתח את תמונת Mapple-C1 ולתייג את העמדה משני הצדדים של הסניף שבו הממברנה מציג את הזווית הגדולה של עקמומיות. חבר שתי נקודות אלה עם קו ישר. קו זה הוא "מוצא הסניף."
  3. באמצעות כלי הקו של תוכנת ההדמיה, לזהות באופן ויזואלי סניפים מודדים> 10 מיקרומטר באורך מן "מקור הסניף" שנקבע שלב 10.2. חשב את אורך הענף על ידי מדידת המרחק בין הe "ממוצא סניף" עד לנקודה המרוחקת ביותר של הקצה הענף (עיין איור 4).
  4. ספירת בליטות מסועפות המודדים> 10 מיקרומטר באורך להשיג "מספר סניף תא."
  5. לניתוח הגירה, באמצעות התמונות שנאספו שלב 9.6, חזותי לזהות HUVEC פצע-קצה מבוסס על מיקום פיזי (תאים כלומר פיזי בקצה של הפצע) ופרופיל ביטוי (כלומר, בחר תא קצה פצע ירוק אם הניסוי כרוך ביטוי של GFP).
  6. שימוש בתמונות של שלב בניגוד של התא, לזהות באופן ויזואלי את הגרעין (המבנה הכדורי חצי השקוף סמוך למרכז התא), ולאחר מכן חזותי לזהות את nucleolus (מבנה קטן, כהה, כדורי בתוך הגרעין) ב נקודת הזמן הראשונה של זמן לשגות תמונות. הקישו על עמדת nucleolus לתייג את הקואורדינטות x ו- y של הגרעינון.
  7. באמצעות תוכנת הדמיה, יד-לעקוב אחרnucleolus בתמונות זמן לשגות רצופים על ידי לחיצה על עמדת nucleolus לתייג את הקואורדינטות x ו- y של nucleolus בכל מסגרת של הסרט זמן לשגות (איור 4).
  8. באמצעות תוכנת ההדמיה, לחץ על "קובץ" ולאחר מכן לחץ על שמירה בשם "ולאחר מכן לחץ כדי לבחור את סוג קובץ תמונה" .xls ".
  9. פתח את קובץ נתוני מעקב יד (משלב 10.8) באמצעות תוכנת גיליון אלקטרונית. חשבתי את מהירות ההגירה מתכוון כלומר מרחק הגירה מוצא.
  10. באמצעות תוכנת גיליון אלקטרונית, לחץ על "נתונים" ולאחר מכן לחץ על "ניתוח נתונים" מהחלון הנפתח הנתונים. Bonferroni תקן בחר, ניתוח חד סטרית של מבחן מנוגד> 95% ביטחון כמו הפסקת מובהקות סטטיסטיות.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבות HUVEC עבור מיקרוסקופיה לחיות תאים
Live- תא הדמיה של HUVECs להביע חלבוני ניאון מחייב HUVECs נשמרת בסביבה מתאימה צמיחת תאים נורמלית ותחזוקה, כמו גם ביטוי חלבון נורמלי ותפקוד. איור 1 מציג תיאור סכמטי של הפרוטוקול המשמש להכין בופר מערכת סגורה המקיימת אופטימיזציה מאפיינים אופטיים לאיסוף זמן לשגות תמונות של תאים חיים. רצועות דקות של סרט דו צדדי ממוקמות על גבי (איור 1 א) שקופיות זכוכית ולאחר מכן את coverslip המכיל את HUVECs התרבותי הוא הפוך על גבי הקלטת כך התאים מול השקופיות (האיור 1B). בדרך זו, את הקלטת מספקת פער קטן בין שני משטחי הזכוכית, ויוצרת מרחב שבו התאים ניתן שטוף תקשורת ותרבות תאים המתאימה (איור 1 ג; ראו 4 לפרוטוקול, לעיל). אניהשלב האחרון נה, coverslip הזכוכית אטומה לשקופית זכוכית באמצעות וזלין: לנולין: שעוות פרפין (1: 1: 1 תערובת, VALAP; איור 1D) להקים מערכת סגורה. הגישה תרבית תאים זו שימשה הן עבור הדמיה רצף זמן קצר של שביטים EB3 ולמען רצף זמן רב יותר הסתעפות וניסויים הגירה. בנוסף, עקביות השעווה הדמוית של VALAP מאפשרת הסרה קלה משקופית הזכוכית coverslip בסוף של הדמיה להתנסות כך גישות משלימות כולל קיבעון immunolabelling (ראו פרוטוקול 8), יכול להתבצע על אותו coverslip מדגם תא כי היה דמיינו בגישת דימות תאים חיים.

figure-results-1
איור 1:. המתודולוגיה של תרבות HUVEC הדמיה מיקרוסקופית-תא חי (א) חותכים 2 חתיכות של נייר דו-צדדית לתוך 0.65 ס"מ X 2.50 ס"מ רצועות מלבני ומאובטח חתיכה אחת של דבק דו צדדית אופקית לאורך הקצה העליון של המגלשה, והקטע השני, לאורך הקצה התחתון של השקופית. חשוב לאפשר כמות קטנה של שטח בין הסרט לבין קצה שקופיות לאיטום תא כמתואר (ד '). (ב) בעזרת מלקחיים להסיר את coverslip המכיל HUVECs ו להפוך את coverslip (בצד התא למטה) על גבי חתיכות של נייר. (ג) שימוש micropipette, להוסיף 40 μl של תקשורת הדמיה (בינוני בסיס אנדותל מלא בתוספת 25 מיקרומטר HEPES) בין coverslip לבין שקופיות הזכוכית. ודא כי השטח בין coverslip והחלק מלא לחלוטין עם תקשורת הדמיה ולהימנע בועות. השתמש aspirator לאורך הקצה של coverslip להסיר תקשורת עודפת, במידת צורך. (ד) השתמש VALAP חם (1: 1: 1 ואזלין: לנולין: פרפין) כדי לאטום מסביב לקצוות של coverslip. בדקו דליפת תקשורת הדמיהים על ידי דחיפה סביב בעדינות על coverslip. השתמש VALAP נוסף כדי לתקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מעקב אוטומטי של EB3 fluorescently שכותרתו מאפשר ניתוח מקיף של תא כולו ואת דינמיקת צמיחת MT האזורית. אוסף ברור, מובהק, ו מאוד זמן תמונות מיקרוסקופיות נפתרה שטח של החלבון EB3 חיוני בניתוח תנועות EB3 בתוך התא. ביטוי HUVEC של EB3 fluorescently שכותרתו משתנה מאוד מתא לתא ועוצמת הקרינה בדרך כלל מגביר בתוך אותו תא פני תקופה של שעות. לכן, חשוב לשקול ולנטר שינויים אלה בפרופיל ביטוי כדי לזהות השפעות אפשריות של ביטוי EB גדל על דינמיקת צמיחת MT. מטרה זו מושגת על ידי מיטב intensit הקרינה בגווני אפור הערכתפרופילי y עבור כל תא צלם, ולאחר מכן הגבלת ניתוח נתונים לתאים אלה המציגים תחום מוגדר של פרופילי ביטוי בגוונים אפורים. הערכה ראשונית של ערכות נתוני פרופיל ביטוי היא קריטית, יש להשוות עם נתוני דינמיקת צמיחת MT כי מתקבל על ידי תוכנת plusTipTracker עבור כל תא. פרופילי ביטוי ניתן להתוות נגד מהירות צמיחת MT ואורך חי צמיחת MT עבור כל תא בתוך קבוצת ניסוי, על מנת לקבוע את הטווח הרצוי ביטוי בגווני אפור ולזהות חריגות פוטנציאליות.

איור 2 מדגיש HUVEC בתרבית על מצע פיברונקטין (ראה 2.1 פרוטוקול, לעיל) ומביע ליד רמות אופטימליות של EB3 Mapple שכותרתו. שביטים EB3 פלורסנט מוצגים בסדרה זמן לשגות של תמונות על פני תקופה של 12 שניות (איור 2 א). ניתוח של שביטי EB3 באמצעות תוכנת plusTipTracker כרוך Dete שביט אוטומטי, מסגרת לפי מסגרת EB3ction (נקודות ירוקות וצהובות, איור 2B). שביטים זוהו בתוך כל מסגרת מקושרים מכן, תלוי שינוי עמדה מן המסגרת אל מסגרת, ליצור מסלולי EB3 ואת שכבת מסלול EB3 חזותית (איור 2C-F). שכבות מסלול מסומנים בצבעים והבחנות צבע יכול להיקבע על ידי פרמטרים שהזין המשתמש. בדרך כלל, ההבחנות האלה להשתמש לממוצע העולמי, מהירות צמיחת MT ואורך חי צמיחת MT 5,31 ובכך לפצל את הנתונים לארבע קבוצות: איטי קצר מועד (אדום), איטיות וארוכות ימים (צהובות), מהירות קצרות חי (ירוק), וצמיחת MT מהירה חיים ארוכים (כחול; איור 2G). PlusTipTracker בתיווך מעקב של הדינמיקה צמיחה MT שכותרתו EB3 גם מאפשר אזורים המוגדרים על ידי המשתמש של עניין (ROIs). PlusTipTracker מחלץ את הנתונים למסלול של צמיחה MT מתוך ROI המוגדרים על ידי המשתמש (איור 2 א ', ב' ו-ו '), ובכך לאפשר להשוואות של dynam צמיחה MTics בתוך אזורים שונים של אותו תא.

figure-results-2
איור 2: זיהוי שביט EB3, מעקב, ופלט נתונים plusTipTracker (א) זמן לשגות הסרט של EB3 Mapple להביע HUVEC.. לוח שמאלי מציג תצוגת תא כולו ומסיכת תא כולו (קו לבן) demarking לגבולות התא. תיבת האדום מייצג את האזור בטיסה המוצגים זמן לשגות תמונות (לוחות מימין). לוחות מימין להראות זמן לשגות תמונות בגווני אפור גלם של שביטי EB3 במסגרות הדמיה רצופות (t = 0 שניות - t = 12 sec). (ב) זיהוי plusTipTracker של שביטים EB3 מהתמונות המוצגות ב (א). לוח שמאלי מציג תצוגת תא כולו של שביטים זוהו (נקודות צהובות). תיבת האדום מייצג את האזור בטיסה המוצגים זמן לשגות תמונות (לוחות מימין). לוחות מימין לסמן חמישה שביטים EB3 זוהה (חצים אדומים) ואת עקבות אותם חמישה כוכבי שביט על פני תקופת הדמיה 12 שניות. ירוק נקודות מייצגות זוהו שביטי EB3 שלא היה קיים (או לא זוהו) בפרק הזמן הקודם. (C) הקרנת עצמה מרבית של 61 מסגרות (2 סרט דק ') של שביטי EB3 שמוצגים (א). (ד) כיסוי המסלול plusTipTracker MT מאותו 61 מסגרות (סרט 2 דקות) שמוצג (C). (E) זום של הקרנת העוצמה המקסימלית (תיבה אדומה ב- C). (F) זום של כיסוי המסלול plusTipTracker MT של הקרנת העוצמה המקסימלית (התיבה האדומה D). (G) מקודד בצבע אגדה עבור שכבות מסלול מוצגות (ד) ו- (ו). ייעוד כמו איטי, מהיר, קצר מועד או ארוך חי מבוסס על הערך הממוצע עבור כל רצועות הצמיחה נמדדות קבוצה של עשר HUVECs להביע Mapple-EB3. להדמיה קלה, שכבות מסלול (ד) ו- (ו) נוצרות באמצעות עוצמות פיקסל הפוכות של תמונת התא שמוצגת (א). ברי סולם = 20 מיקרומטר./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

HUVEC הסתעפות דפוסי הנדידה רגישים Mechano-פיזי אותות מן ECM.

HUVECs ידוע להגיב סוגים שונים של רמזי איתות, ותוך כדי כך, לעבור שינויים מורפולוגיים מכתיבי תגובת הסלולר הולמת קיו איתות המסוים (הים) 36,40-42. HUVECs מתורבת על מצעי זכוכית מצופה פיברונקטין (איור 3 א), או על ECMS polyacrylamide הנוקשה 2-ממדים (55 kPa) מציג בדרך כלל עגול או מורפולוגיה מוארכת עם כמה בליטות קנים נפרדות (איור 3 ב). עם זאת, כאשר בתרבית על ECMS polyacrylamide מאוד רך 2 ממדים (0.7 kPa), HUVECs להציג מורפולוגיה מסועפת מאוד אשר ידועה לגרום מקיום מושרה למטההסדרת contractility שרירן-II 4,5,31 (איור 3 ג). לפיכך, HUVECs להסדיר מורפולוגיה הסלולר שלהם באמצעות ECM mechanosensing, וזה נעשה באמצעות אפנון מקומי של הדינמיקה MT ו התכווצות acto-מיוזין.

בגלל HUVECs להציג מגוון רחב של תכונות מורפולוגיות, על מנת למדוד HUVEC הסתעפות זה קריטי ראשון להגדיר מהו בליטת קנים היא, ולאחר מכן להגדיר כיצד בליטת קנים תימדד באופן אובייקטיבי. טכניקה אחת משתמשת בגישה בת ארבעה שלבים שבאמצעותו גבול תא או "מסכה" מופקת על ידי יד התחקות את הקצוות של התא באמצעות תמונה של תא להביע סמן נפח ניאון כדי להגדיר את קצות התא (איור 3D). בעקבות הדור מסכה, מקורותיה סניף מוגדרים על ידי איתור זווית גדולה של עקמומיות בין בליטת קני גוף התא. קו מופנה DemaRK "מקור הסניף" (קווי זוויתי סגולים; איור 3E). מספר סניף פשוט נמדדת על ידי ספירת מספר סניפים עם ממוצא סניף מוגדר (איור 3F). אורך סניף נמדד כמרחק מראשית סניף טיפ סניף דיסטלי (האיור 3G). כדי למנוע הכללת תחזיות lamellipodial קטנות מניתוח נתונים, קריטריון נוסף מחייב סניפים חייבים להיות ארוך יותר ( "אורך סניף") מאשר הם רחבים (על "מוצאים סניף"), וכי סניפים חייבים להיות לפחות עשרה מיקרון באורך 5 , 31.

figure-results-3
. איור 3: ניתוח של מורפולוגיה הסתעפות HUVEC (A - C) תמונה DIC דוגמאות HUVECs בתרבית על ECMS זכוכית מצופה פיברונקטין (א) נוקשה (55 kPa) ECMS polyacrylamide (B) ורך (0.7kPa) ECMS polyacrylamide (C). מסעף הוא גדל באופן דרמטי ב HUVECs בתרבית על ECMS polyacrylamide 0.7 kPa (C) לעומת ECMS נוקשה (A, B). (D). תמונה מיקרוסקופית DIC (בתמונה משמאל) של HUVEC transfected להביע cDNA Mapple-C1 לבנות (סמן נפח תא; בתמונה מימין). (E) הגדר את מקור הסניף ידי איתור הזווית הגדולה של עקמומיות (כלומר במצב שבו הממברנה מציג את העקמומיות הגדולה; קווים סגולים בצבע) משני צדי הסניף ולאחר מכן חבר את הזוויות עם קו ישר (קווים כחולים) . (F) זהה ובחירת בליטות קנים שמרחיבות> 10 מיקרומטר מן "מקור הסניף" (כהגדרתו E). ספירת בליטות מסועפות כדי להשיג את "מספר הסניף." (G) יש למדוד את המרחק מהמרכז של "מקור הסניף" אל מונקודת דיסטלי st של הענפים בעזרת כלי השורה ביישום ההסברים ומדידות של תוכנת אלמנטי ש"ח להשיג את "אורך הסניף." ברי סולם = 20 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בנוסף לעמידת ECM חישה, HUVECs גם לחוש ולהגיב חיסול קשר הסלולר סמוך כמו המושרה על ידי פציעה מאפסת. ב assay ההגירה, HUVECs מתורבת בשכבה חשופה פצע שריטה ומאפייני הגירה נמדדים (ראו 9 לפרוטוקול, לעיל). לאחר האינדוקציה של הפצע על ידי גירוד בשכבה, HUVECs קצה הפצע לקטב על ידי פיתוח חדשני ובולטת המשתרע לתוך הפצע (איור 4 א, ​​t = 0 שעות). במהלך קורס זמן של 10-12 שעות, HUVECs פצע הקצה מקוטב נודד לאזור הפצע ולמלא אתפצע, הקמה בשכבה ומחוברות חדשה (איור 4 א, ​​T = 11 שעות). כמו HUVEC הסתעפות, ראיות נוכחיות עולות כי קיטוב וההגירה תלוי באופן קריטי על הארגון מחדש המתואם של MT ו cytoskeletons יקטין 43-49. זו מושגת, בין השאר, באמצעות עיכוב מקומי של פירוק MT-induced MCAK בחוד החנית, אבל לא נגרר לקצה של קצה הפצע HUVECs 31. הרגישות של דינמיקת MT לפצוע מושרה הקיטוב הוא ביוזמת GTPase Rac1, אשר מטרות חלבוני רגולטור במורד רבים, כוללים אורורה-קינאז כי phosphorylates ומעכב MCAK בחוד החנית, ו קינאזות אחרות המסוגלים עיכוב או הפעלת מפות כדי מקומית לווסת צמיחה MT ו הצטמקות 18,31,36,48,50-53. ראיה נסיונית נרחבת תומכת ברעיון כי תיאום של בליטה בקצה מובילה ונגררת התכווצות קצה נשלט באמצעות מחזורי הפעלת Rac1MT לקדם הרכבה בקצה המוביל RhoA הפעלת התכווצות acto-שרירן בקצה הנגרר, ומכך מכוונים תנועתיות 9,41,51,52,54-58.

נכון להיום, אין מתודולוגיה הוקמה לביצוע מעקב אוטומטי של נדידת תאים. זוהי תוצאה של קושי בניתוח מחשוב גבולות תא ECM משנות בעקביויות כתאי קצה פצע לקטב ולנדוד. בעוד תוכנות רבות מסוגלות מעקב תאים שכותרתו fluorescently 59-64, האוכלוסייה של שכותרתו fluorescently HUVECs בניסויי גירת פצע קצה היא כ 30-40% מאוכלוסיית HUVEC הכולל, ולכן רוב תאי קצה פציעה דמיינו ידי הדמיה שלב בניגוד או DIC. בנוסף, חשוב בעת מדידת הגירה הפצע קצה להעריך פלורסנט ולא פלורסנט תאים בתוך אותו הפצע כדי לזהות ספציפיתהשפעות של ביטוי הוא בבנייה בתוך קבוצות מחקר הניסיון ובין קבוצות מחקר ניסיוני. כיום, הגישה הטובה ביותר למדוד גירת HUVEC היא להשתמש בגישת מעקב היד בה תא פצע קצה מזוהה ראשונה ולאחר מכן בגרעין nucleolus מזוהה (האיור 4B). לגרעין משמש הקובע עמדו למעקב תא עקב צפיפות פיזור האור הגבוה שלה וגודל קטן יחסית. שתי תכונות אלה של nucleolus להקל לזהות ולהפחית טעות מדידה על ידי הגבלת השטח שבו המשתמש יכול למקם עמדות ספציפיות למסלול. מסלולי הגירת HUVEC אז מופקים על ידי לחיצה על nucleolus במסגרות תמונה רצופות זמן לשגות. לבסוף, מהירות הגירה ומרחק הגירה מהמוצא נמדדת ונותחו לבקרת קבוצות תאי ניסוי (איור 4B).

figure-results-4
איור 4: ניתוח של HUVECs הפצע קצה ומעקב הגירה (א) תמונות שלב בניגוד 20X של סדרה הדמיה 11 שעות זמן לשגות של הפצע קצה שריטה HUVECs (aka "Assay הגירה").. הפצע ואת הכיוון של הגירה מסומן בלוח t = 0 hr. HUVECs מוצגים לחצות את קצה הפצע מראש לתוך הפצע עד בשכבה של תאים נוצרת (t = 3.5 שעות - t = 11 שעות). (ב) ניתוח של לשגות הדמית הגירה assay זמן (כפי שמוצג א) דורש ראשון לזיהוי של HUVEC פצע קצה trackable מבוסס על מיקום תא (תאים כלומר פיזי בקצה של הפצע) ופרופיל ביטוי (כלומר על. , בחר תא קצה ירוק פצע אם הניסוי כרוך ביטוי GFP). שימוש בתמונה בניגוד שלב, לזהות את הגרעין ואת nucleolus. יד לעקוב אחר nucleolus בתמונות רצופות זמן לשגות באמצעותיישום סימונים ומדידות בתוכנת ש"ח אלמנטים כדי לקבוע מהירות הגירה ומרחק למוצאם. ברי סולם = 100 מיקרומטר (א), 20 מיקרומטר (B). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש HUVECs בניסויי מורפולוגיה והגירה.
Live- תא הדמיה של דינמיקת צמיחת MT שכותרתו EB3 בתוך HUVECs דורשת תנאי תרבית תאים מתאימים לשחזור כדי למדוד ולהעריך שינויים בצמיחת MT ומורפולוגיה HUVEC, כך שהם יכולים להיות מוקצים אז אל קיו איתות ECM. HUVECs מייצגים מודל מצוין לחקר צורת התא ואת תנועתיות. הם מאוד מקובלים transfection עם cDNAs fluorescently שכותרתו, הם מפגינים מורפולוגיות דרמטיות בתגובה הוא רמזי איתות מסיסים ופיסיים, והם שומרים על היכולת לארגן את עצמם לתוך צינורות כלי דם כאשר ספקו תנאי תרבית תאים מתאימים 65-70. בתרביות תאים ראשוניים, כגון HUVECs, מצריכה טיפול וניטור קפדני של מספר מעבר התא על מנת להבטיח את התאים בריאים וכי הם יתנהגו באופן רגיל בזמן ניסויים. לדוגמא, בעת ביצוע ניסויים חוקרים את cytoskeleטון ו / או מורפולוגיה תא, HUVECs לא אמור לשמש לניסויים מעבר למעבר תרבית תאים עשירית, כפי HUVECs בדרך כלל מתחילה להציג מורפולוגיות לא אחידות סביב המעבר כשנים-עשר עד חמישה-עשר.

צפיפות תאים גם רגולטור חשוב לבריאות ושגשוגם HUVEC. חקירות הסתעפות HUVEC (ראה פרוטוקול 10.1-10.4, לעיל) להשתמש תרבויות צפיפות תאים נמוכות יחסית על מנת לספק את תאי מרחב פיזי כדי אינטראקציה עם ECM שלהם להאריך בליטות קנים. לעומת זאת, במחקרי גירת פצע קצה (ראה פרוטוקול 10.5-10.8), HUVECs הוא תרבות בשכבה לפני הפציעה. כפי HUVECs כזה, פצע קצה להציג מורפולוגיה יחסית un קנים, להאריך המובילים בליטות בקצה, ולהציג אינטראקציות תאי תאים עם השכנים המיידיים שלהם כפי שהם נודדים לתוך הפצע.

אזהרות ואת היתרונות של Dynamics מעקב MT In Living HUVECs.
ספינינג מיקרוסקופיה דיסק היא גישה מצוינתלבחון השערות ניסיוניות הדורשים בהירות התמונה confocal עם הזמן ברזולוציה גבוהה. עם מודול מצלמת הליזר המתאים, גישה מיקרוסקופיה זו רגישה קרינת פליטה נמוכה והוא יכול לסייע photobleaching מופחת לעומת סוגים אחרים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חשוב לציין, גישה זו גם מתאימה גם עבור בינוני עד הדמית זמן ברזולוציה גבוהה כפי שנדרש להפקה מדידות מקיפות של דינמיקת צמיחת MT בגישת תיוג EB3, במגוון סוגי תאים שונים.

בעוד המתודולוגיה EB3 של תיוג גדל MT פלוס קצוות יש יתרונות ברורים על פני שיטות אחרות של MTS תיוג פלורסנטי, יש לה גם חסרונות ייחודיים. לדוגמא, קיים יחס של מערך MT שאינו צומח באופן פעיל בכל זמן נתון, כולל הוא את האוכלוסייה של MTS פירוק ואוכלוסיית סטאבילה, MTS הלא דינמי 71-74. EB3 לא לתייג שני אלה אוכלוסיות של MTS וולכן התרומה של שתי אוכלוסיות אלה לא יכללו בניתוח נתוני הניסוי. מתודולוגיות אלטרנטיבי לבחינת מערך MT כולו התמקד ביטוי טובולין שכותרתו פלורסנטי, אשר משלב לתוך כל האוכלוסיות של MTS ומאפשר זיהוי של גדל, מתכווץ, ואת סטאבילה MTS. עם זאת, בגלל צפיפות גבוהה יחסית של המערך MT סמוך למרכז התא צמוד למרכז בארגון microtubule (MTOC), תיוג מערך MT כולו יוצר חיסרון בביצוע ניתוח התמונה של הקצוות MT שאינם ליד התא בפריפריה 75-77. ניסויים באמצעות שיתוף תיוג שני צבעים של MTS עם טובולין פלורסנט EB3 פלורסנט בתאים חיים חשפו, איכותית, כי הרוב המכריע של MTS שכותרתו טובולין הם גם שכותרתו EB3 78. בנוסף, לא היתה שיטה יעילה של מעקב אוטומטי של MTS שכותרתו עם טובולין ניאון. משמעות הדבר היא כי אוסף נתוניםtion ומדידות של דינמיקת MT בתאים המבטאים טובולין פלורסנט דורשים מעקב ביד של MTS פרט, תהליך שהוא לשגיאה ומייגעת. כתוצאה מכך, ניתוח חישובית אוטומטי של MTS EB3 שכותרתו הפך המתודולוגיה המועדף למדידת דינמיקת MT כפי שהוא יכול להיות מיושם על ניסויי דינמיקת MT פני סוגי תאים רבים בתוך מגוון רחב של משטרים הניסיונות 35,79.

קישור Dynamics צמיחה MT כדי HUVEC מורפולוגיה וההגירה.
מנקודת המבט של חוקר cytoskeletal, אחד הסתגלות שימושית מאוד של ניתוח המעקב אוטומטי plusTipTracker היא היכולת למדוד ולהעריך הוא שינויי תא ואזוריים בדינמיקת צמיחת MT. דרישת תא להפוך מקוטב היא תנאי מוקדם הכרחי נדידת תאים כיוונית. כרמזי איתות כזה, מקוטב כבר ידועים עוד גורמי נהיגת מפתח עבור נדידת תאים כיוונית 30,31,51,54,56,80,81 . לדוגמא, מולקולות מסיסות איתות כגון VEGF לגרום פילמור יקטין וצמיחת MT כלפי קיו VEGF בסוגי תאי אנדותל 2,82-87. בנוסף, בתגובה אינטראקציות פיזי עם ECM (למשל, ציות ממדיות mechanosensing), HUVECs לווסת הדינמיקה MT שלהם על ידי מקומי ויסות מפות כדי לקדם צמיחה MT בתוך מתארך בליטות הקנים, וזה משמש כדי להנחות הגירה HUVEC בכיוון של קיו 5,31,88. לפיכך, קיטוב בתגובה לאותות איתות תאיים מדגיש את הצורך בהערכה ניסיונית של שינויי נקודות בדינמיקת cytoskeletal.

Live- תא הדמיה סימולטני של דינמיקת צמיחת MT (בגישת EB3) ואת נדידת תאי HUVEC קשה מאוד לבצע בגלל MTs לגדול על ציר זמן של שניות, תוך שינויים במורפולוגיה תא והגירה כיוונית להתרחש בקנה מידת זמן של שעות. עם זאת הוא לגבי התהליכים הם אינטימי לינקהד. יתר על כן, רציפה, הדמיה מהירה של EB3 שכותרתו fluorescently על ציר הזמן השני מוביל photobleaching של האות EB3. ניסיונות להתגבר על בעיה זו על ידי ביצוע סדרת הדמיה קצרה EB3 (סדרת רכישה 1-2 דקות) כל 30 דקות הצליחו, אבל יכול להיות מושלם רק במספר קטן של ECS כי היה ביטוי אופטימלי של EB3 וכי לא להציג לרעה אפקטים תאורת לייזר חזר 5.

גישה חלופית המאפשרת פרשנויות של איך דינמיקת צמיחת MT לתרום שינויים במורפולוגיה תא והגירה היא אזור plusTipTracker של העניין (ROI) כלי 35 (ראה פרוטוקול 6.6). מתודולוגיה זו מאפשרת לצמיחת MT התא כולו עוקבת להיות תת-מחולק לאזורים המוגדרים על ידי משתמש, שממנו מסלולי צמיחת MT אז יכולים להיות מופקים ונותחו. לדוגמה, השוואות של "מסועפת" לעומת אזורים "הלא-קנים" של התא חשפו כי MTS לגדול יותר שלנחות ועוד בהתמדה בתוך אזורים מסועפים לעומת הפריפריה של התאים הלא-קני 5. בשנת HUVECs פצע קצה מקוטב, השוואות של קצה המובילה ונגררת דינמיקת צמיחת MT הקצה גילו כי פירוק MT-induced MCAK מעוכב במיוחד בתוך הקצה המוביל, אבל לא נגרר לקצה. ערכה אזורית מובילים ונגרר דינמיקת צמיחת MT יתרון HUVECs להביע Rac1 ו / או מוטציות זירחון של MCAK עוד עולה כי הפעלת נגרמת Rac1 של אורורה-קינאז ספציפי מקומי מעכב פעילות MCAK בתוך הקצה המוביל לנהוג קיטוב HUVEC והגירה כיוונית 31. לכן, השילוב של מעקב אוטומטי של דינמיקת צמיחת MT וערכה האזורית של דינמיקת צמיחת MT בתוך בליטות קנים ו / או את הקצה המוביל של פצע קצה HUVECs אפשר לנו לקשר דינמיקת צמיחת MT מורפולוגיה וגירת HUVEC.

הפרוטוקולים המתוארים הם designeד לספק מתודולוגיה פשוטה מאוד דיר בדרך כלל לתרבות HUVEC וחקירת ניסיוני. עם זאת, חלק ניכר מן פרטי הפרוטוקול הם מורכבים זמן רב, אשר, בתורו, מספק הזדמנות עבור שגיאות או קשיים בניהול המתודולוגיה הניסיון. למרות שזה היה ניסיון לטפל בבעיות פוטנציאליות ברחבי הפרוטוקול, כאן מסופק ולפתור בעיות נוספות, מפורטות של בעיות פוטנציאליות שניתנות פחות נפוצים או מקוצר אחרת כפי שמציין בתוך פרוטוקול המתודולוגיה.

הקשורים coverslips ציפוי עם מצעים polyacrylamide (פרוטוקול 2.2), בעיה נפוצה הנשאלת היא האופי המורכב של הפעלת coverslips זכוכית, צימוד polyacrylamide אל הזכוכית, הפעלת polyacrylamide, ולאחר מכן צימוד ECM אל polyacrylamide. אחת במיוחד צעד קשה ובעייתי פוטנציאלי הוא culturing HUVECs על ג'ל פיברונקטין / polyacrylamide הבא חשיפה של פוליהcoverslips מצופה crylamide עד 2 מ"מ sulfo-SANPAH (שלב 2.2.2.6, לעיל). זה קריטי להצלחת culturing HUVECs על מצעים אלה כי sulfo-SANPAH יוסר לחלוטין ממערכת ניסיוני הבאה נטיית ECM. זה יכול להיות מושג בצורה הטובה ביותר על ידי שטיפה עם DDH 2 O ו דוגרים coverslips DDH 2 O על שייקר לילה. אם תאים בתרבית על ECMS polyacrylamide אינם שורדים, או אם הכדאיות הוא פחות מהצפוי, עלה וחזר לשטיפת sulfo-SANPAH לאחר נטיה כדי פיברונקטין (שלב 2.2.2.9) מומלץ פוטנציאל להקל על בעיה זו.

קשור לפרוטוקול 3 (transfection cDNA ותרבות HUVEC על coverslip), השפעה גדולה על ההצלחה של הליך electroporation היא הטיפול של HUVECs היא במהלך trypsinization של התאים כדי להסיר אותם מבקבוק הפלסטיק, ובעקבות הסיום את electroporation (שלבים 3.3-3.4, לעיל). זה קריטי כדי אכפתמלא לפקח על HUVECs בעוד טריפסין, ולא יעלה את הזמן הדרוש עבור התאים "עיגול לטובה" על פני השטח של הבקבוק (בדרך כלל 1-2 דקות). זמן מופרז טריפסין הוא הגורם העיקרי למוות HUVEC, אשר בדרך כלל אינה ממומשת עד תאים מצופה על coverslips מצופה פיברונקטין (שלב 3.4) ולאחר מכן מצליחים לצרף המצע.

חשיבות דומה, HUVECs (ורוב סוגי תאים ראשוניים) לא מסתדרים היטב כאשר מושעה • לפרקי זמן ממושכים למאגר electroporation. במהלך ניסויים בקנה מידה גדול יותר, למשל, כאשר המשתמש הינו חמש או יותר תנאים המחייבים electroporation, עדיף לשמור על התאים pelleted ב צינורות בודדים (1 צינור לכל transfection) כדי לערבב אותם, אחד-על-א-זמן , למאגר electroporation מיד לפני electroporation. גישה זו מקטינה זמן הדגירה חיץ electroporation והישרדות HUVEC מוגדל. בנוסף, הצלה מיידית בתקשורת התרבות השלמה היא גם crelectroporation הבא itical. עיכובי הצלת דקה אחת או יותר electroporation הבא יכולים לגרום סף המוות מוחלט HUVEC ובכך יש להימנע.

assay נדידת תאים קשור (פרוטוקול 9), הטכניקה של culturing HUVECs בצפיפות גבוהה מאוד תלויה שינוי קריטי (כמתואר בשלב 9.2) של המתודולוגיה תרבית תאים המסורתית HUVEC (המתואר פרוטוקול 3) הדורש ייבוש של coverslip מצופה פיברונקטין על מנת לאפשר תרבות HUVEC לתוך שטח קטן מאוד של coverslip. פעמים רבות, אם coverslip לא יבש לחלוטין או אם ציפוי מראש של coverslip עם פיברונקטין (שלבים 2.1 או 2.2) היה לא יעיל, התאים המכילים התקשורת כי מושם על coverslip תאבד מתח הפנים שלה ולהרחיב את הקצוות של coverslip, ובכך להפחית את הצפיפות של תאים על coverslip. שיטה אחת כדי לפתור בעיה זו פוטנציאל היא לשאוב את התקשורת מן coverslip ולאחר מכןמקום coverslip (עדיין בצלחת 35mm שלה) לחלק האחורי של ארון הבטיחות הביולוגי למשך 5-10 דקות. הסתגלות זו יכולה לסייע כדי לאפשר את זרימת האוויר בתוך ארון לסייע בייבוש המנה. אם כל נוזל גלוי נשאר על coverslip לאחר ייבוש באוויר, לשאוב כתמים נוזליים ושוב ולאפשר לאוויר יבש למשך 5-10 דקות נוספות בקבינט בטיחות ביולוגית. חשוב לציין כי אין דרך למנוע זאת בעיה פוטנציאלית לחלוטין, אבל זה הופך להיות פחות בעיה עם תרגול חוזר של הפרוטוקול. זהו גם המלצה לפתרון בעיות אשר בעת הכנת coverslips עבור assay נדידת תאים (או כל assay, בכלל), כדי להכין coverslips נוסף ויש HUVECs נוסף מוכן ללכת במקרה של בעיות לאורך הדרך.

עם שיקולים אלה לפתרון בעיות בחשבון, זה חשוב גם להדגיש את התועלת של פרוטוקולים דנו והשלכותיהם במחקר ביולוגיה של התא בעתיד. תחולת אל polyacrהגישה ylamide הוא רחב יריעה, וכוללת לא רק מחקרים דו מימדי ההתקשרות התא ECM (כמתואר לעיל), אלא גם חקירות תלת מימדי 5. יישום זה הוא קריטי להגדלת הבנתנו כיצד HUVECs להסדיר צורת תא והגירה בסביבות פיסיולוגיות אמורים לספק לחוקרי הבנה בסיסית של איך מורפולוגיים שינויים מתואמים עם שינויי cytoskeletal. בעוד הפרוטוקולים המתואר כאן מתמקדים מדידות של דינמיקת צמיחת MT, רוב הפרוטוקולים יכול וצריך להיות מותאם למדידה מספר רב של היבטים למדידה מיקרוסקופית אחרים של אינטראקציות התא-ECM. עם כל כבוד דינמיקת MT, ישנם רבים מפות, כולל לפחות 14 משפחות של kinesins 89, כל אחד עם תפקיד פוטנציאלי בתרומה הקוטבית HUVEC והגירה מכוונת, וכל אחד מהם יכולים להיחקר באמצעות הפרוטוקולים שהוצגו.

חקירות עתידיות במקרה בוסימפוני יכוון אירוסי תא ECM ב רגיל לעומת מדינות חולות. פרוטוקולים HUVEC המוצגים כאן הם החלים על חקירות של תהליכים ההומיאוסטטית וסקולרית נורמלי, כמו גם מדינות מחלה כולל מחלות לב, רטינופתיה, גידולים סרטניים וגרורות, עד כמה שם. Conjugating בעליל מצעי ECMS ו polyacrylamide שקופים ציות נוח עם מחקרים מיקרוסקופים יאפשר ללימודי אירוסי התא ECM כך אנגיוגנזה וסקולרית תא האנדותל יכולה להיות במעקב עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. אלו סוגים של גישות ניסיוניות כבר החלו לחשוף הבדלים חשובים בכושר תא האנדותל, קוטביות, הגירה, ואת ההשפעות של פרוטאינים המווסתים תהליכים אלה 5,31,90. מאמצי עתיד צריכים לשאוף לזהות כיצד השילוב של ציות ECM ו- ממדי mechanosensing עשוי לשמש לחלבונים שליטים מקומית כי למקד ולהסדיר דינמיקת cytoskeletal.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תודה מיוחדת לד"ר קלייר מ ווטרמן עבור חונכות ודיונים, מישל ביירד ומייק דוידסון למתן רבים של מבנים cDNA פלורסנט המשמש במחקרים אלה, ועם קתרין אפלגייט Gaudenz Danuser לפיתוח תוכנת ניתוח MT plusTipTracker. עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי מענק קא"מ מן הריאות הלאומי ללב ודם (NHLBI) לבין המכון הלאומי לבריאות (NIH). (גרנט: 4K22HL113069).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Aurora A Inhibitor ISelleck ChemicalsS1451
תמיסת 2% BisBio-Rad1610142
3-aminopropyltrimethyloxysilaneSigma-AldrichA3648
40% אקרילאמידBio-Rad1610140
405, 488, 561, 640 ננומטר מודול קומבינר לייזר MLC400 בעוצמה גבוההAgilent Technologies99462
אמוניום פרסולפטSigma-AldrichA3678
anti– חרוזי משקעים חיסוניים IgG של עכבריםריאגנטים TrueBlot; רוקלנד בע"מ88-1688-31
אנטי– ארנב IgG חרוזי משקעים חיסונייםTrueBlot ריאגנטים; רוקלנד בע"מ88-7788-31
ET455/50m, מסנן פליטה DAPI-ETChroma Technology Corp.ET455/50m
מסנן פליטה ET525/36mChroma Technology Corp.ET525/36m
מסנן פליטה ET605/70mChroma Technology Corp.ET605/70m
מסנן פליטה ET700/75mChroma Technology Corp.ET700 / 75m
בקר סרום אלבומין שבר VRPI מוצריםA30075-100.0
קלרה מקורר מטען מצמד מכשירמצלמה Andor Technology77026010
Cy3 חמור נגד ארנבג'קסון ImmunoResearch711-165-152
DPBSתרמו פישר מדעי14190250
Dyelight 649 עז נגד חולדותJackson ImmunoResearch112-496-068
EGM-MV SingleQuot אספקה & גורמי גדילה (התוכן מוצג להלן)LonzaCC-4143
סרום בקר עוברי 25 מ"ל
תמצית מוח בקר 2.0 מ"ל
גנטמיצין סולפט 0.5 מ"ל
גורם גדילה אפידרמיס 0.5 מ"ל
הידרוקורטיזון 0.5 מ"ל
פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יחב"ל עט/מ"ל, 10,000 µ גרם סטרפטוק/מ"ל)  10.0 מ"ל
EGTASigma-AldrichE3884-100G
תריס אלקטרונימכשיר סאטר77016099
פיברונקטיןEMD MilliporeFC010
GlutaraldehydeThermo Fisher ScientificS80026
מעכב פרוטאז HALTThermo Fisher ScientificPI-78425
HEPESSigma-AldrichH4034
HRP עז אנטי עכברג'קסון ImmunoResearch115-036-062
HRP עז נגד ארנבג'קסון ImmunoResearch111-036-045
Immuno-Blot PVDF ממברנהBio-Rad162-0174
לנוליןתרמו פישר סיינטיפיק8006-54-0
מגנזיום סולפטסיגמא-אולדריץ'M2643-500G
מיקרוסקופניקון TiEMEA53100
שלב ממונעASI טכנולוגיותMS-2000
הרכבה בינוניתDakoCS70330-2
עכבר אנטי-אורורה AAbcamab130156
עכבר אנטי-GAPDHAbcamab9484
עכבר anti-MCAKAbcamab50778
עכבר אנטי טובולין (DM1A)טכנולוגיית איתות תאים3873S
לקאלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה72180
NIS תוכנת אלמנטיםNikonMQS310000
ערכת נוקלאופקטור VLonzaVACA-1003מכיל את מאגר האלקטרופורציה
פרפיןThermo Fisher ScientificP31-500
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יחב"ל Pen/ml, 10,000 µ g Strep/ml)MP Biomedicals91670249
ג'לי נפטDow Corning2021854-1113
צינורותSigma-AldrichP6757-100G
plusTipTracker
ארנב אנטי-GFPAbcamab290
ארנב אנטי– pT288– Aurora AAbcamab18318
Rat anti– α-tubulinAbD SerotecMCA78G
נתרן בורוהידרידתרמו פישר מדעי678-10
דיסק מסתובב Andor Technologyיוקאגאווה CSU-X1
Sulfo-SANPAHThermo Fisher ScientificPI-22589
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstrateThermo Fisher Scientific34080
Triton X-100Thermo Fisher ScientificBP151-500
TrypsinCorningMT25053CI
Tween-20Thermo פישר סיינטיפיקBP337

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerhardt, H., Betsholtz, C. How do endothelial cells orientate? EXS. 94, 3-15 (2005).
  2. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. J Cell Biol. 161, 1163-1177 (2003).
  3. Bayless, K. J., Johnson, G. A. Role of the cytoskeleton in formation and maintenance of angiogenic sprouts. J Vasc Res. 48, 369-385 (2011).
  4. Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching. Curr Biol. 19, 260-265 (2009).
  5. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. J Cell Biol. 192, 321-334 (2011).
  6. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol. 5, 599-609 (2003).
  7. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Actomyosin-based retrograde flow of microtubules in the lamella of migrating epithelial cells influences microtubule dynamic instability and turnover and is associated with microtubule breakage and treadmilling. J Cell Biol. 139, 417-434 (1997).
  8. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Microtubule dynamics: treadmilling comes around again. Curr Biol. 7, R369-R372 (1997).
  9. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Rac1. J Cell Biol. 161, 845-851 (2003).
  10. Ahmad, F. J., Pienkowski, T. P., Baas, P. W. Regional differences in microtubule dynamics in the axon. J Neurosci. 13, 856-866 (1993).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
  12. Dent, E. W., Kalil, K. Axon branching requires interactions between dynamic microtubules and actin filaments. J Neurosci. 21, 9757-9769 (2001).
  13. Dehmelt, L., Nalbant, P., Steffen, W., Halpain, S. A microtubule-based, dynein-dependent force induces local cell protrusions: Implications for neurite initiation. Brain Cell Biol. 35, 39-56 (2006).
  14. van Veen, M. P., van Pelt, J. Dynamic mechanisms of neuronal outgrowth. Prog Brain Res. 102, 95-108 (1994).
  15. Myers, K. A., He, Y., Hasaka, T. P., Baas, P. W. Microtubule transport in the axon: Re-thinking a potential role for the actin cytoskeleton. Neuroscientist. 12, 107-118 (2006).
  16. Stehbens, S., Wittmann, T. Targeting and transport: how microtubules control focal adhesion dynamics. J Cell Biol. 198, 481-489 (2012).
  17. Stehbens, S. J., et al. CLASPs link focal-adhesion-associated microtubule capture to localized exocytosis and adhesion site turnover. Nat Cell Biol. 16, 561-573 (2014).
  18. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Spatial regulation of CLASP affinity for microtubules by Rac1 and GSK3beta in migrating epithelial cells. J Cell Biol. 169, 929-939 (2005).
  19. Kumar, P., et al. GSK3beta phosphorylation modulates CLASP-microtubule association and lamella microtubule attachment. J Cell Biol. 184, 895-908 (2009).
  20. Al-Bassam, J., Chang, F. Regulation of microtubule dynamics by TOG-domain proteins XMAP215/Dis1 and CLASP. Trends Cell Biol. 21, 604-614 (2011).
  21. Desai, A., Verma, S., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell. 96, 69-78 (1999).
  22. Hunter, A. W., et al. The kinesin-related protein MCAK is a microtubule depolymerase that forms an ATP-hydrolyzing complex at microtubule ends. Mol Cell. 11, 445-457 (2003).
  23. Lee, T., Langford, K. J., Askham, J. M., Bruning-Richardson, A., Morrison, E. E. MCAK associates with EB1. Oncogene. 27, 2494-2500 (2008).
  24. Walczak, C. E., Mitchison, T. J., Desai, A. XKCM1: a Xenopus kinesin-related protein that regulates microtubule dynamics during mitotic spindle assembly. Cell. 84, 37-47 (1996).
  25. Maney, T., Hunter, A. W., Wagenbach, M., Wordeman, L. Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J Cell Biol. 142, 787-801 (1998).
  26. Lan, W., et al. Aurora B phosphorylates centromeric MCAK and regulates its localization and microtubule depolymerization activity. Curr Biol. 14, 273-286 (2004).
  27. Ganem, N. J., Upton, K., Compton, D. A. Efficient mitosis in human cells lacking poleward microtubule flux. Curr Biol. 15, 1827-1832 (2005).
  28. Wordeman, L., Wagenbach, M., von Dassow, G. MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover. J Cell Biol. 179, 869-879 (2007).
  29. Kline-Smith, S. L., Walczak, C. E. The microtubule-destabilizing kinesin XKCM1 regulates microtubule dynamic instability in cells. Mol Biol Cell. 13, 2718-2731 (2002).
  30. Moore, A. T., et al. MCAK associates with the tips of polymerizing microtubules. J Cell Biol. 169, 391-397 (2005).
  31. Braun, A., et al. Rac1 and Aurora A regulate MCAK to polarize microtubule growth in migrating endothelial cells. J Cell Biol. 206, 97-112 (2014).
  32. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H., Akhmanova, A. Regulation of localization and activity of the microtubule depolymerase MCAK. Bioarchitecture. 1, 80-87 (2011).
  33. Kushner, E. J., et al. Excess centrosomes disrupt endothelial cell migration via centrosome scattering. J Cell Biol. 206, 257-272 (2014).
  34. Siekmann, A. F., Affolter, M., Belting, H. G. The tip cell concept 10 years after: new players tune in for a common theme. Exp Cell Res. 319, 1255-1263 (2013).
  35. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. J Struct Biol. 176, 168-184 (2011).
  36. Montenegro Gouveia, S., et al. In vitro reconstitution of the functional interplay between MCAK and EB3 at microtubule plus ends. Curr Biol. 20, 1717-1722 (2010).
  37. Honnappa, S., et al. An EB1-binding motif acts as a microtubule tip localization signal. Cell. 138, 366-376 (2009).
  38. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker software to measure microtubule dynamics in Xenopus laevis growth cones. J Vis Exp. , e52138(2014).
  39. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13(2001).
  40. Kutys, M. L., Yamada, K. M. An extracellular-matrix-specific GEF-GAP interaction regulates Rho GTPase crosstalk for 3D collagen migration. Nat Cell Biol. 16, 909-917 (2014).
  41. Friedl, P., Wolf, K., Zegers, M. M. Rho-directed forces in collective migration. Nat Cell Biol. 16, 208-210 (2014).
  42. Hellstrom, M., et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis. Nature. 445, 776-780 (2007).
  43. Semina, E. V., et al. T-cadherin activates Rac1 and Cdc42 and changes endothelial permeability. Biochemistry (Mosc). 74, 362-370 (2009).
  44. Liang, Z. W., et al. Nestin-mediated cytoskeletal remodeling in endothelial cells: novel mechanistic insight into VEGF-induced cell migration in angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 308, C349-C358 (2015).
  45. Kamath, K., Smiyun, G., Wilson, L., Jordan, M. A. Mechanisms of inhibition of endothelial cell migration by taxanes. Cytoskeleton (Hoboken). 71, 46-60 (2014).
  46. Pasquier, E., et al. Antiangiogenic concentrations of paclitaxel induce an increase in microtubule dynamics in endothelial cells but not in cancer cells. Cancer Res. 65, 2433-2440 (2005).
  47. Sun, X., et al. Regulation of tumor angiogenesis by the microtubule-binding protein CLIP-170. Protein Cell. 4, 266-276 (2013).
  48. Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis. Bioarchitecture. 2, 220-227 (2012).
  49. Ganguly, A., Yang, H., Zhang, H., Cabral, F., Patel, K. D. Microtubule dynamics control tail retraction in migrating vascular endothelial cells. Mol Cancer Ther. 12, 2837-2846 (2013).
  50. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18/stathmin downstream of Rac1. J Biol Chem. 279, 6196-6203 (2004).
  51. Waterman-Storer, C. M., Worthylake, R. A., Liu, B. P., Burridge, K., Salmon, E. D. Microtubule growth activates Rac1 to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts. Nat Cell Biol. 1, 45-50 (1999).
  52. Pasapera, A. M., et al. Rac1-dependent phosphorylation and focal adhesion recruitment of myosin IIA regulates migration and mechanosensing. Curr Biol. 25, 175-186 (2015).
  53. Cooper, J. R., Wagenbach, M., Asbury, C. L., Wordeman, L. Catalysis of the microtubule on-rate is the major parameter regulating the depolymerase activity of MCAK. Nat Struct Mol Biol. 17, 77-82 (2010).
  54. Hu, Y. L., et al. Roles of microtubule dynamics and small GTPase Rac in endothelial cell migration and lamellipodium formation under flow. J Vasc Res. 39, 465-476 (2002).
  55. Davis, G. E., Koh, W., Stratman, A. N. Mechanisms controlling human endothelial lumen formation and tube assembly in three-dimensional extracellular matrices. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 270-285 (2007).
  56. Spaargaren, M., Bos, J. L. Rab5 induces Rac-independent lamellipodia formation and cell migration. Mol Biol Cell. 10, 3239-3250 (1999).
  57. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125, 5917-5926 (2012).
  58. Westenskow, P. D., et al. Ras pathway inhibition prevents neovascularization by repressing endothelial cell sprouting. J Clin Invest. 123, 4900-4908 (2013).
  59. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2008).
  60. Tarnawski, W., et al. A robust algorithm for segmenting and tracking clustered cells in time-lapse fluorescent microscopy. IEEE J Biomed Health Inform. 17, 862-869 (2013).
  61. Rambaldi, D., Pece, S., Di Fiore, P. P. flowFit: a Bioconductor package to estimate proliferation in cell-tracking dye studies. Bioinformatics. 30, 2060-2065 (2014).
  62. Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, e81266(2013).
  63. Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB(R) package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PLoS One. 8, e72636(2013).
  64. Klein, J., et al. TLM-Tracker: software for cell segmentation, tracking and lineage analysis in time-lapse microscopy movies. Bioinformatics. 28, 2276-2277 (2012).
  65. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell Tissue Res. 314, 15-23 (2003).
  66. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  67. Davis, G. E., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Koh, W. Molecular basis for endothelial lumen formation and tubulogenesis during vasculogenesis and angiogenic sprouting. Int Rev Cell Mol Biol. 288, 101-165 (2011).
  68. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a006601(2012).
  69. Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods Mol Biol. 1066, 17-28 (2013).
  70. Kim, D. J., Martinez-Lemus, L. A., Davis, G. E. EB1, p150Glued, and Clasp1 control endothelial tubulogenesis through microtubule assembly, acetylation, and apical polarization. Blood. 121, 3521-3530 (2013).
  71. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  72. Drechsel, D. N., Kirschner, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4, 1053-1061 (1994).
  73. Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104, 277-288 (1987).
  74. Kirschner, M., Mitchison, T. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 45, 329-342 (1986).
  75. Malikov, V., Cytrynbaum, E. N., Kashina, A., Mogilner, A., Rodionov, V. Centering of a radial microtubule array by translocation along microtubules spontaneously nucleated in the cytoplasm. Nat Cell Biol. 7, 1213-1218 (2005).
  76. Wieczorek, M., Bechstedt, S., Chaaban, S., Brouhard, G. J. Microtubule-associated proteins control the kinetics of microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 17, 907-916 (2015).
  77. Wiese, C., Zheng, Y. Microtubule nucleation: gamma-tubulin and beyond. J Cell Sci. 119, 4143-4153 (2006).
  78. Shin, W. D., Fischer, R. S., Kanchawong, P., Kim, Y., Lim, J., Myers, K. A., Nishimura, Y., Plotnikov, S. V., Thievessen, I., Yarar, D., Sabass, B., Waterman, C. M. Live cell imaging: A laboratory. , 2nd, 119-138 (2010).
  79. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  80. Gundersen, G. G., Bulinski, J. C. Selective stabilization of microtubules oriented toward the direction of cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5946-5950 (1988).
  81. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? J Cell Sci. 114, 3795-3803 (2001).
  82. Jakobsson, L., Bentley, K., Gerhardt, H. VEGFRs and Notch: a dynamic collaboration in vascular patterning. Biochem Soc Trans. 37, 1233-1236 (2009).
  83. Blanco, R., Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a006569(2013).
  84. Gerhardt, H. VEGF and endothelial guidance in angiogenic sprouting. Organogenesis. 4, 241-246 (2008).
  85. Napione, L., et al. Unraveling the influence of endothelial cell density on VEGF-A signaling. Blood. 119, 5599-5607 (2012).
  86. Benedito, R., et al. Notch-dependent VEGFR3 upregulation allows angiogenesis without VEGF-VEGFR2 signalling. Nature. 484, 110-114 (2012).
  87. Czeisler, C., Mikawa, T. Microtubules coordinate VEGFR2 signaling and sorting. PLoS One. 8, e75833(2013).
  88. Howes, S. C., Alushin, G. M., Shida, T., Nachury, M. V., Nogales, E. Effects of tubulin acetylation and tubulin acetyltransferase binding on microtubule structure. Mol Biol Cell. 25, 257-266 (2014).
  89. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
  90. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nat Protoc. 7, 2056-2066 (2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HUVECEB3PlusTipTrackerbranching

מאמרים קשורים