Method Article

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

DOI:

10.3791/54277

⸱

July 25th, 2016

 , 
1Department of Developmental Pathology, Institute of Pathology, University of Bonn Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמרה ישירה של פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסטים מתפקדים ויציבים לחלוטין על ידי ביטוי יתר של Tfap2c, Gata3, Eomes ו-Ets2.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע Trophoblast (TSCs) העולות אגב החלטת גורל התא הראשונה בפיתוח יונק. הם יכולים להיות מתורבת במבחנה, שמירה על היכולת העצמית לחדש להתמיין בכל תתי הסוגים של השושלת trophoblast, שווה ערך ל vivo ב גזע עלייה נותן אוכלוסיית תאים לחלק העוברי של השליה. לכן, TSCs מציע מודל ייחודי ללמוד פיתוח שליה עוברי לעומת החלטת גורל תא חוץ עוברית במבחנה. משלב הבלסטוציסט ואילך, מחסום אפיגנטיים מובחן המורכב שינויים מתילציה דנ"א היסטון בחוזקה מפריד הוא שושלות. כאן אנו מתארים פרוטוקול להתגבר על זה המכשול השושלת באופן מלא על ידי חולף ביטוי יתר של רגולטורים מרכזיים trophoblast Tfap2c, Gata3, Eomes ו Ets2 ב פיברובלסטים עובריים בעכברים. תאי גזע trophoblast המושרה מסוגלים עצמי לחדש והם כמעט זהים הבלסטוציסט תא גזע trophoblast נגזר iבמונחי n של מורפולוגיה, ביטוי גנים סמנו דפוס מתילציה. תפקודי במבחנת מבחני vivo לאשר כי התאים האלה מסוגלים להבחין לאורך שושלת trophoblast יוצרת תאים ענקים trophoblast polyploid ו chimerizing השליה כאשר מזריקה blastocysts. האינדוקציה של תאי גזע trophoblast מרקמות סומטיים פותחת אפיקים חדשים ללמוד את מאפיינים גנטיים אפיגנטיים של שושלת חוץ עוברית זה, ומציעה את האפשרות ליצור שורות תאי גזע trophoblast מבלי להרוס את העובר בהתאמה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחרונה, במחקר שהשווה כמה גישות של תאי גזע עוברי בעכבר כדי Trophoblast המר גזע תאים גילה כי בכל המערכות המנותחות, מרת שושלת נשארת שלמה. במקום תאי גזע trophoblast המושרה (iTSCs) שנקראים גזע trophoblast תאים דמויי תאים נוצרו שמירה על זיכרון של תא גורל ממוצא 1. כאן פעלנו ע"פ גישה שונה של דור iTSC. בדומה האינדוקציה הישירה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מ פיברובלסטים עובריים בעכברים (MEFs) 2, iTSCs הומר ישירות מרקמת סומטיים מובחנת. ראשית, זיהינו 12 גורמי מועמד התרמת גורל TSC כאשר ביתר MEFs. בהמשך, הגורמים Tfap2c, Gata3, Eomes ו Ets2 זוהו להיות הכרחי ומספיק אינדוקציה iTSC 3. במקביל, קבוצה נוספת באופן עצמאי ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ניסויי העכבר נערכו על פי החוק הגרמני של הגנה על בעלי חיים וזאת בהסכמה ובאישור ועדות הטיפול המקומיות מוסדיים בעלי החיים (Landesamt fuer נאטור, Umwelt und Verbraucherschutz, נורדריין וסטפליה [המספר מזהה אישור: AZ 84-02.04.2013 .A428]).

1. הכנת Media

  1. כן בינוני 293T: בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) FBS, L- גלוטמין (2 מ"מ), פירובט נתרן (1 מ"מ), פניצילין / סטרפטומיצין (1x).
  2. הכן בינוני MEF: DMEM, 10% (v / v)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על הצלחת שבו ביטוי transgene של 4F מופעל, תאים לשנות מורפולוגיה במהירות (השווה איור 2 א 'וב'). בסביבות יום 14 - 21 אזורים transdifferentiated ברורים לצוץ (שתי דוגמאות ניתנות באיור 2B ו- C). מושבות העיקריות אלה חסרי מורפולוגיה TSC טיפוסית; אולם ברגע שהם תת תרבות, מורפולוגיה אפיתל מאפיין עם קצוות הדוקים וגבולות בהירים מאוד מזכירים TSCs בתום לב עולה (איור 2 ד). 4F-iTSCs כתם חיובי עבור שעתוק trophoblas.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גורם 4 (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) פרוטוקול transdifferentiation המבוסס שהוצג כאן מציע שיטה אמינה לייצר המרת בנאמנות iTSCs מ פיברובלסטים עובריים בעכבר. יתר על כן, השיטה היא גם ישימה עבור פיברובלסטים זנב שלאחר לידה, אם כי עם ירידה יעילה לעומת פיברובלסטים עובריים 3. באופן כללי, איכות פיברובלסטים העיקרי היא גורם קריטי של תוצאת transdifferentiation וטיפול יש לנקוט כדי להשתמש בתאים מעבר מוקדם (מעבר שני כדי שלוש).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
דוקסיציקלין היקלאטסיגמא-אולדריץ'D9891-10Gממיסים ב-PBS סטרילי, מכינים תמיסת מלאי של 2 מ"ג/מ"ל. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C
מלח כלורוקווין דיפוספט Sigma-AldrichC6628-25Gהכן תמיסת מלאי של 25 מ"מ במים סטריליים בדרגת תרבית תאים. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C
פוליברן (Hexadimethrine bromide)Sigma-Aldrich107689-10Gהכן תמיסת מלאי של 8 מ"ג/מ"ל במים בדרגת תרבית תאים סטרילית. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C
גורם גדילה פיברובלסטים רקומביננטי אנושי 4ReliaTech300-131Lמתמוסס בסטרילי 0.1% BSA ב-PBS, הכן 25 ומיקרו; פתרון מלאי g/ml. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -80 מעלות; C
מלח נתרן הפריןSigma-AldrichH3149-10KUהכן תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל על ידי המסה ב-PBS סטרילי. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -80° C
ProFection מערכת טרנספיקציה של יונקיםPromegaE1200
PBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםThermoFisher Scientific1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAXThermoFisher Scientific31966-021
RPMI 1640, ללא גלוטמיןThermoFisher Scientific31870-025
Advanced DMEM (1x)ThermoFisher Scientific12491-015
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדוםThermoFisher Scientific25300-054
פולי-ליזיןסיגמא-אולדריץ'P4707
סרום בקר עובריHycloneSH30071.03IR
מסנן תאית אצטט ללא פעילי שטחקורנינג431220
חומצותאמינו לא חיוניותThermoFisher Scientific11140-035
פניצילין סטרפטומיציןThermoFisher Scientific15140-122
נתרן פירובט ThermoFisher Scientific11360-039
L-גלוטמין ThermoFisher Scientific25030-24
2-MercaptoethanolThermoFisher Scientific31350-010
דימתיל סולפוקסיד (DMSO), כיתה תרבית תאיםPanreac AppliChem GmbHA3672,0100
pLV-tetO-Tfap2cAddgene70269
pLV-tetO-Gata3Addgene70270
pLV-tetO-EomesAddgene70271
pLV-tetO-Ets2Addgene70272
pLV-tetO-mCherryAddgene70273
psPAX2Addgene12260
pMD2.GAddgene12259
FUdeltaGW-rtTA Addgene19780
עכברים B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7JAX עכברים6965
129S2SVצ'ארלס ריבר129

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538(2014).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Trophoblast Stem CellsMurine Embryonic FibroblastsDirect Cell ConversionLentiviral Vector TransfectionTfap2c Gata3 Eomes Ets2Induced Trophoblast Stem CellsPoly L lysine Coating293 T Cell TransfectionVirus Harvesting ProtocolColony Picking Technique

Related Articles