מדידה במבחנה פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

ATPases הם אנזימים אינטגרליים בתהליכים רבים בכל ממלכות החיים. ATPases פועלים כמנועים מולקולריים המשתמשים באנרגיה של הידרוליזה של ATP כדי להניע תגובות מגוונות כמו סחר בחלבונים, התפתחות והרכבה; שכפול ושעתוק; חילוף חומרים תאי; תנועת שרירים; תנועתיות תאים; ושאיבת יונים^1-3. חלק מה-ATPases הם חלבונים טרנסממברניים המעורבים בהובלת מומסים על פני ממברנות, אחרים הם ציטופלזמיים ועשויים להיות קשורים לממברנה ביולוגית כגון קרום הפלזמה או אלה של אברונים.

AAA+ ATPases (ATPases הקשורים לפעילויות תאיות שונות) מהווים קבוצה גדולה של ATPases החולקים רצף ושימור מבני מסוים. חלבונים אלה מכילים מוטיבים משומרים של קשירת נוקלאוטידים כגון קופסאות Walker-A ו-B ויוצרים אוליגומרים (בדרך כלל הקסמרים) במצבם^{הפעיל 1}. שינויים קונפורמטיביים גדולים בחלבונים אלה בעת קשירת נוקלאוטידים אופיינו בקרב חברים מגוונים במשפחת AAA+. EpsE הוא AAA+ ATPase וחבר בתת-משפחת הפרשת החיידקים מסוג II/IV של NTPases^4-6. EpsE מפעיל הפרשה מסוג II (T2S) ב-Vibrio cholerae, הגורם לכולרה. מערכת T2S אחראית להפרשת מגוון רחב של חלבונים, כגון רעלן כולרה גורם האלימות הגורם לשלשול מימי רב כאשר V. cholerae מתיישב במעי הדק האנושי⁷.

טכניקות לכימות פעילות ATPase במבחנה מגוונות, אך בדרך כלל מודדים שחרור פוספט באמצעות מצעים קולורימטריים, פלואורסצנטיים או רדיואקטיביים^8-11. אנו מתארים שיטה בסיסית לקביעת פעילות ATPase במבחנה של חלבונים מטוהרים באמצעות בדיקה קולורימטרית המבוססת על מצע ירוק מלכיט זמין מסחרית המודד פוספט אנאורגני משוחרר (Pi). ב-pH נמוך, מוליבדט ירוק מלכיט יוצר קומפלקס עם Pi וניתן למדוד את רמת היווצרות הקומפלקס ב-650 ננומטר. בדיקה פשוטה ורגישה זו עשויה לשמש לאפיון פונקציונלי של ATPases חדשים ולהערכת התפקידים של מפעילים או מעכבים פוטנציאליים, כדי לקבוע את החשיבות של תחומים ו/או שאריות ספציפיות, או כדי להעריך את ההשפעה של טיפולים מסוימים על פעילות אנזימטית.

1. בצע תגובת ATP הידרוליזה עם חלבונים מטוהרים

1. הכן מניות של כל ריאגנטים נדרשים דגירה עם חלבונים מטוהרים.
   1. הכן 5x HEPES / NaCl / גליצרול (HNG) מאגר המכיל 100 מ"מ HEPES pH 8.5, 65 mM NaCl, ו -5% גליצרול (או חיץ assay אחרים על פי הצורך).
   2. כן 100 מ"מ MgCl ₂ (או מתכת אחרת, אם ATPase הוא תלוי מתכת) במים.
   3. הכן טרי 100 מ"מ ATP ב 200 מ"מ טריס הבסיס (לא להתאים את pH נוספת) באמצעות ATP טוהר גבוהה. Aliquot ולאחסן את המניה ATP ב -20 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מכמה שבועות, כמו ATP יהיה לשבור לאורך זמן, ולהימנע הקפאה להפשרה מניית ATP.
   4. Premix MgCl ₂ ו- ATP ביחס של 1: 1 רק לפני הגדרת התגובה הידרוליזה ATP.
2. להכין תווית 1.5 מ"ל צינורות לאיסוף דגימות במרווחים קבועים לאורך התגובה. הכן צינורות לאיסוף דגימות בשלב 0 ו בשלב 15, 30,45, ו 60 דקות.
   הערה: כחלופה, לאסוף דגימות רק בזמן 0 ואת נקודת הסיום.
   1. הוסף חוצץ HNG 1x 245 μl על צינור אחד כדי לדלל דגימות שנאספו התגובות הידרוליזה ATP 1:50.
3. כן אמבט קרח אתנול יבשים להקפאת דגימות במהירות כדי לעצור את התגובה. בתוך דלי קרח גומי או בטוחים אחרים (לא פלסטיק) מיכל, להוסיף כמה חתיכות של קרח יבש ובזהירות לשפוך מספיק 70-100% אתנול לכיסוי קרח יבש.
4. לדלל חלבונים מטוהרים במאגר HNG 1x, על פי הצורך (בדרך כלל 5-10 מיקרומטר), ולשמור על הקרח.
5. הגדר את התגובות הידרוליזה ATP.
   1. ב 0.5 מ"ל צינורות נפרדים עבור כל דגימה, מוסיפים את ריאגנטים הבאים (לפי הסדר): H ₂ O (עד לנפח סופי של 30 μl), 6 μl 5x HNG או חיץ אחר, 3 μl 100 מ"מ MgCl ₂ תערובת -ATP, ו 0.25-5 חלבון מיקרומטר.
   2. כלול תנאי בקרה שלילי חיץ-היחידה שבה אין חלבון הוא הוסיף.
6. הסר 5 μl מן התגובה בזמן 0, לדלל 01:50 בצינור 1.5 מ"ל מוכן המכיל חיץ 245 μl HNG, ומיד להקפיא את הדוגמה באמבט קרח / אתנול יבש.
7. דגירת תגובות ב 37 ° C כדי לאפשר הידרוליזה ATP להתרחש במשך שעה 1. בכל מרווח (15, 30, 45, ו -60 דק '), להסיר 5 aliquots μl מן התגובה ולהוסיף דוגמיות שכותרתו המכיל HNG חיץ כמו בשלב 1.6.
8. בסוף תגובת הידרוליזה ATP, להעביר בדילול דגימות במקפיא -80 מעלות צלזיוס לאחסון. כדי להבטיח את כל דגימות קפואות לחלוטין, להמתין לפחות 10 דקות לפני שתמשיך.

2. דוגמאות דגירה המכילים Pi חינם עם איתור מגיב

1. הפשרה בדילול דגימות המכילות aliquots תגובת הידרוליזה ATP בכל נקודת זמן (המתקבלות צעדים 1.6 ו 1.7) בטמפרטורת חדר.
2. הגדרת צלחת 96-היטב המכילה דגימות וסטנדרטים פוספט.
   1. בתוך 0.5 מ"ל tuלהיות, לדלל את רמת פוספט (מסופק עם מגיב זיהוי Pi) מ 800 מיקרומטר עד 40 מיקרומטר על ידי הוספת 5.5 μl של למאגר HNG 800 מיקרומטר רגיל 104.5 μl. מערבבים היטב, ולהוסיף 100 μl של 40 מיקרומטר זה Pi סטנדרטי היטב A1 של צלחת 96-היטב.
   2. הוסף 50 μl HNG חיץ לבארות B1-H1 טוב 1: 1 דילולים סידוריים של תקן Pi.
   3. הסר 50 μl של 40 מיקרומטר Pi מבאר A1 ולהוסיף למאגר assay 50 μl ב B1 היטב, לערבב, ולהסיר 50 μl מבאר B1 ולהוסיף גם C1, דילולים ועד ל G1 היטב. מחק 50 μl מבאר G1 לאחר ערבוב כדי להבטיח היטב כל יש את אותו נפח. ובכן H1 צריך להכיל חיץ רק ליצור תקן Pi מן 40 עד 0 מיקרומטר.
      הערה: אם גורם נוסף (כגון מעכבים) נוסף הדגימות, ליצור עקומת סטנדרט המכילה גורמים לשלוט על שינויים במהדורה פוספט או ספיג בתנאים אלה.
   4. הוסף 50 μl של כל sample בשני עותקים לצלחת. להוסיף דוגמאות מאותה נקודת זמן בטורים אנכית (זמן מדגם 1 0 = A2, A3; מדגם 2 זמן 0 = B2, B3) ו בנקודות זמן שונות אופקית. זה מאפשר עד 8 דגימות ו -5 נקודות זמן לכל צלחת.
3. השתמש pipet סטרילי להסיר מספיק מלכיט מגיב זיהוי Pi ירוק / molybdate להוסיף 100 μl לכל אחד בארות המכיל דגימות ותקנים (מגיב הצורך (מ"ל) = 0.1 x מספר דוגמאות וסטנדרטים) ולהוסיף לצלחת עבור pipetting קל באמצעות pipet הרב ערוצית. אין לשפוך מגיב זיהוי ישירות לתוך התבשיל, כמו זיהום Pi צפוי להתרחש.
4. שימוש pipet רב ערוצית, להוסיף 100 μl של מגיב זיהוי Pi היטב כל ומערבבים ידי pipetting למעלה בזהירות למטה מספר עקבי של פעמים ללא בועות מציגות, רצוי בסדר עדיפות מהנקודות בפעם האחרונות לנקודות לראשונה.
5. דגירה הצלחת במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר, או על פי maכיוונים של nufacturer.

3. תוצאות לכמת באמצעות קורא microplate

1. קראו את הספיגה של הדגימות ב 650 ננומטר באמצעות קורא microplate ספיג.
2. הפוך עקומת סטנדרט Pi. באמצעות תוכנת גרפים, גרף את הערכים הספיגים עבור דגימות תקן Pi לעומת ריכוז כדי למצוא משוואה להשתמש כדי לפתור את כמות הפוספט מדגם זה.
3. חשב את פעילות ATPase עבור כל דגימה על ידי כיול עם תקן פוספט. פוספט שוחרר = (OD ₆₅₀ - ליירט Y) / המדרון.
   1. ממוצע לצרכן הכולל כפילויות של כל דגימה. הפחת את הקריאה הספיגה של שליטת החיץ בלבד ממספר זה. הכפל זאת על ידי גורם לדילול (50 בדוגמה שלנו).
   2. קבע את Pi nmol שוחרר לכל חלבון μmol. Graphing ערכים אלה עבור כל נקודת זמן ב assay הקינטית אמור להניב מתאים ליניארי של לפחות R = 0.99 (איור 1); אם not, assay יכול להיות מותאם עם יותר או פחות חלבון או זמן דגירה ארוך או קצר.
4. מייצגים את התוצאות כפי nmol Pi / μmol חלבון / min (איורים 2, 3), או כפי nmol Pi / מיקרוגרם חלבון / min אם תרצה בכך.

פעילות חוץ גופית של EpsE T2S ATPase יכול להיות מגורה על ידי copurification של EpsE עם תחום cytoplasmic של EpsL (EpsE-cytoEpsL) ותוספת של cardiolipin פוספוליפידים חומצי 12. כמו כן ניתן לקבוע את התפקיד של שאריות EpsE מסוימות הידרוליזה ATP על ידי השוואת פעילות של סוג בר (WT) כדי הגירסות שונות של החלבון באמצעות assay. הנה, את ההשפעה של החלפת שתי שאריות ליזין בתחום אבץ מחייב EpsE נמדדת על ידי השוואת פעילות ATPase של מטוהרים WT EpsE-cytoEpsL החלופה K417AK419A-cytoEpsL EpsE. באיור 1, שחרור פוספט ממשיך באופן ליניארי במהלך של assay הקינטית 1 hr, דרישת כימות מדויקת של פעילות ATPase קינטית. איור 2 מציג נתונים מאותו דגימות החלבון מטוהרות כמו איור 1 כי היו assayed שלוש פעמים כפולות ונרשמות במונחים שלשיעור ממוצע של שחרור פוספט. נתונים אלה מראים כי K417 ו K419 להיראות חשוב לפעילות EpsE ATPase. עם זאת, השוואה של unstimulated (לא cardiolipin) מחירים פעילות ATPase (איור 3) מראה כי K417 ו K419 לא תרמו לפעילות הבסיס של EpsE אלא ליכולת של החלבון להיות מגורה על ידי cardiolipin. Lysines בעלי מטען חשמלי חיובי בתחום אבץ מחייב EpsE יכול לתקשר ישירות עם פוספוליפידים טעונים שלילית, ובכך לתרום את הגירוי בתיווך פוספוליפידים הפעילות EpsE ATPase.

איור 1: פוספט הוא פורסם באופן ליניארי ב assay קינטי ATPase שעה אחת הקינטית מגורה cardiolipin assay ATPase השוואת שחרור פוספט של 0.5 מיקרומטר WT EpsE-cytoEpsL כדי EpsE K417AK419A-cytoEpsL עם אלבומין בסרום שור (BSA) assayed כפי.כביקורת שלילית. נתונים [כמות פוספט שוחרר (ציר y) לעומת הזמן (ציר x)] היו זממו ו נתון ניתוח רגרסיה ליניארית. השיפוע מייצג את שיעור הידרוליזה ATP. גרף נציג עם משוואות רגרסיה ליניארית במשך שלושת החלבונים מוצג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2:.. Double ליזין מוטציות EpsE אבץ-Binding Domain להפחית מאולצת ATPase פעילות תוצאות של assay ATPase הקינטית 1 hr מגורה cardiolipin עם אותו החלבונים ותנאים כמו באיור 1 מבחנים בוצעו שלוש פעמים נפרדות בשני עותקים טכניים שיעור הידרוליזה ATP חושב כמו פוספט nmol שנוצר לדקה לכל מיקרומטר pr otein באמצעות משוואות רגרסיה ליניארית. התוצאות הממוצעות עם סטיית התקן מוצגות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: Double ליזין מוטציות EpsE האבץ-Binding Domain אינו מפריע unstimulated ATPase פעילות הלילה (16 שעות) נקודת סיום unstimulated (לא cardiolipin) assay ATPase השוואת הפעילות של 5 מיקרומטר WT EpsE-cytoEpsL כדי EpsE K417AK419A-cytoEpsL עם BSA. כביקורת שלילית. מבחנים בוצעו שלוש פעמים נפרדות בשני עותקים טכניים ותוצאות ממוצעות עם סטיית התקן מוצגות. רמת הבסיס של פעילות unstimulated EpsE ATPase assayed על פני תקופה של 16 שעות הוא ~ 1,000 פי הנמוך מ -1 hr הקינטית פעילות מגורה cardiolipin.e.com/files/ftp_upload/54305/54305fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

למחברים אין מה לחשוף.