מאמר שיטה

השוואת שיטות להסרת Cell חלבון מארח טבק ידי לבנת צמחים שלמים או על ידי טיפול בחום של תמציות

8.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54343

⸱

8 באוגוסט 2016

 ,  , 
1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Department of Biomolecular Separation Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

במאמר זה

סיכום

שלושה חום שיטות ממטרים מוצגות ביעילות להסיר יותר מ -90% של חלבוני תא מארח (HCPs) מטבק תמציות לפני כל צעד טיהור אחר. המפעל HCPs לצבור באופן בלתי הפיך בטמפרטורות מעל 60 מעלות צלזיוס.

תקציר

צמחים לא רק לספק מזון, מזון וחומר גלם עבור בני אדם, אלא גם פותחו כמערכת ייצור חסכונית עבור חלבונים הביו-פרמצבטיקה, כגון נוגדנים, מועמדי חיסון ואנזימים. חייבים להיות מטוהרים אלה מן ביומסה במפעל אבל צעדים כרומטוגרפיה הם הפריעו ידי הריכוזים הגבוהים של חלבוני תא מארח (HCPs) תמציות צמחים. עם זאת, רוב HCPs לצבור באופן בלתי הפיך בטמפרטורות מעל 60 מעלות צלזיוס הקלת הטיהור הבאה של חלבון המטרה. הנה, שלוש שיטות מוצגות כדי להשיג את המשקעים בלהט HCPs טבק או שלמי עלים או תמציות. מבצע לבנת עלים שלמים ניתן לשלב בקלות לתוך תהליכים קיימים אך עשויה להיות השפעה שלילית על צעדי סינון הבאים. ההפך הוא נכון עבור משקעים חומים של תמציות עלו בתוך כלי בחש, אשר יכול לשפר את הביצועים של פעולות במורד זרם אמנם עם שינויים משמעותיים בעיצוב מכשור הטכנולוגי, כגוןגיאומטרית homogenizer. לבסוף, התקנה מחליפה חום מאופיין גם מבחינת תנאי העברת חום קל מידה, אבל ניקוי יכול להיות קשה ולא תיתכן השפעה שלילית על יכולת סינון. העיצוב-של-ניסויי הגישה יכולה לשמש כדי לזהות את הפרמטרים של תהליך הרלוונטיים ביותר משפיעי הסרת HCP והתאוששות מוצר. זה מקל על היישום של כל שיטה בפלטפורמות ביטוי אחרות וזיהוי של השיטה המתאימה ביותר עבור אסטרטגיה לטיהור נתונה.

מבוא

מערכות בריאות מודרניות תלויות יותר ויותר על חלבונים ביולוגיים 1. הפקת חלבונים אלה בצמחים יש יתרון בגלל הנטל הפתוגן נמוך מדרוג גבוה יותר בהשוואה למערכות ביטוי קונבנציונאלי 2-4. עם זאת, העיבוד במורד הזרם (DSP) של תרופות צמחיות יכול להיות מאתגר, מכיוון שתהליך החילוץ משבש לגרום לניטל חלקיקים גבוה, עם turbidities העולה על 5,000 יחידות עכירות nephelometric (NTUs), וחלבון תא מארח (HCP) ריכוזים לעתים קרובות עולים על 95 % [מ '/ מ'] 5,6.

נהלי הבהרה משוכללים נדרשים להסיר התפזרו חלקיקים 7-9, אבל ציוד כרומטוגרפיה הוא פחות יקר לפעול במצב לאגד-ו-elute במהלך ההתאוששות ראשונית של מוצר אם יש שלב מוקדם להסרת יעיל של HCPs 10,11. זו יכולה להיות מושגת גם על ידי מזרז חלבון המטרה באמצעות flocculנמלים 12 או pH נמוך 13,14, כמו גם על ידי גורם HCPs לצבור. ההצטברות סלקטיבית של ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase (RuBisCO), את HCP הנפוץ ביותר בצמחים ירוקים כגון טבק (טבק), ניתן לקדם באמצעות הוספת פוליאתילן גליקול 15, אבל זה יקר עולה בקנה אחד עם גדול ייצור -scale. עיבוד תרמי הוכח לפגל משקע יותר מ -95% של HCPs טבק, בעוד מועמדי חיסון חלבון מלריה כגון Vax8 להישאר יציבים בתמיסה 16-18.

שלוש גישות שונות שימשו כדי להשיג את המשקעים הנגרמת בלהט HCPs טבק: (i) הלבנה, כלומר, טבילה של עלים שלמים נוזל חם, (ii) בטמפרטורה מבוקרת עוררה כלי, וכן (iii) מחליף חום ( איור 1) 16. לקבלת עלים שלמים, לבנה השיג את המשקעים המהירים ויעילים של HCPs והיה גם קלבהיקף של עד ועומד בקנה אחד עם תהליכי ייצור בקנה מידה גדול הקיימים הכוללים צעד ראשון לשטוף את ביומסה במפעל 19. לעומת זאת, כלי בקרת טמפרטורה כבר זמין בתהליכים מסוימים וניתן להשתמש בו לטיפול התרמי של תמציות צמחים 20, אבל מדרגיות אנרגית קצב העברה שלהם מוגבלות בגלל היחס שטחו פן לנפח של הטנקים מצטמצם בהדרגה הופך מתאים בקנה מידה תהליך. מחליף חום הוא אלטרנטיבה מוגדרת היטב מבחינה טכנית מחוממת כלי עוררה אבל דורש שפע של חימום ומדיה קירור, למשל, קיטור ומים קרים, כמו גם ספיקה בחוזקה מבוקרת ומותאמת הגיאומטריה המחליפה חום נכסי מדיה, למשל., קיבולת החום הסגולית. מאמר זה מראה כיצד כל שלוש שיטות יכולות לשמש עבור הממטרים החומים הנגרמת של HCPs הטבק, HCPs צמח בכלל. הקמה והפעלה של EACשיטת h במעבדה הגדרה שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את מידת התאמתם תהליכים בקנה מידה גדול יותר. האתגר העיקרי הוא לזהות מודלים בקנה מידה למטה נאותים ותנאי פועל עבור כל פעולה דומה ההתקנים ותנאי שימוש במהלך תהליך ייצור בקנה מידה. הנתונים המוצגים כאן מתייחסים ניסויים שנערכו עם צמחי טבק מהונדסים מבטא מועמד חיסון למלריה Vax8 ו חלבון פלואורסצנטי DsRed 16, אבל השיטה גם יושמה בהצלחת נ צמחי benthamiana לבטא חלבונים ביולוגיים אחרים זמן 21.

עיצוב-של-ניסויים (DOE) להתקרב 22 יכול להקל על פיתוח תהליך, flocculants 23 יכול גם להיות מועיל בהקשר זה כפי שתואר לעיל 8. ההבדל העיקרי בין הלבנה, כלי מחומם מחליפי חום הוא הלבנה מוחלת על עלים שלמים מוקדם בתהליך ואילו otשלה מוחלים תמציות צמחים (איור 1).

figure-introduction-1
איור 1:. תהליך Scheme הזרימה הממחיש את היישום בשלוש שיטות שונות עבור משקעי חום הטבק HCP החומר הצמחי נשטף הומוגני לפני ההבהרה וטיהור. הציוד עבור השלב הלבן (אדום) ניתן להוסיף בקלות על המכונות הקיימות. לעומת זאת, מתוך כלי בחש (כתומה) ובמיוחד מחליף חום (כחול) דורש אחד או מספר התקנים נוספים צינורות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ולטפח את צמחי הטבק

  1. רוקן כל בלוק צמר סלעים עם 1 עד 2 ליטר מים ללא יונים, ובהמשך עם 1 ליטר של 0.1% [w / v] פתרון דשן. מניחים זרע טבק אחד בכל גוש צמר סלעים ולשטוף בעדינות עם 0.25 ליטר של תמיסת הדישון ללא שטיפת זרע 16.
  2. לטפח את צמחי טבק במשך 7 שבועות בחממה עם 70% לחות יחסית, photoperiod 16 שעות (180 μmol שניות - 1 מ '- 2; λ = 400 - 700 ננומטר) ומשטר טמפרטורה 25/22 ° C אור / חושך.
  3. לקצור את כל העלים מלבד ארבעה עלים טבורית, אשר ממוקמים בבסיס של גבעול.

2. אופציונאלי: רטיבות חומה על ידי לבן

הערה: בצע את השלבים מתוארים צעדים 2.1 ל 2.12 כדי לזרז HCPs טבק ידי לבן. דלג על סעיף 2 כולו, אם HCPs שישקעבתוך סיר מחומם (סעיף 4) או באמצעות מחליפי חום (סעיף 5).

  1. מניחים בצד 50 גרם של חומר צמחי ולבצע מיצוי ללא הלבנה (סעיף 3). לקחת דגימה של תמצית זו כמנהל בקרה פנימית במהלך לניתוח שלאחר מכן (סעיף 7).
  2. הגדרת באמבט מים בנפח 8-L הפועלים, למשל, 50 x 40 x 40 ס"מ, בתוך דלי קצף פוליסטירן תרמית בידוד או דומה. הר תרמוסטט מתכוונן על אמבט המים עבור בקרת הטמפרטורה הבאה (שלב 2.7).
  3. מעביר את ההרכבה כולו לצלחת ומערבבים מגנטית ומניחים ברי ומערבבים מגנטיים באמבט המים. ודא שהשדה המגנטי הוא חזק מספיק כדי לסובב את הבר והמערבב.
  4. הקף את הבר ומערבב עם אריחי תמיכה ארבעה לפחות שעליו סל פוליפרופילן (שלב 2.6) יוצב מאוחר יותר במהלך ההליך הלבן. ודא כי האריחים תמיכה עשויים מחומר שאינו מגנטי (למשל, נירוסטה מסגסוגת ניקל המכיל) ושהםגבוהים יותר מאשר בר ומערבבים (איור 2).
  5. הוסף 8 ליטר מים ללא יונים אל באמבט מים.
    הערה:. שימוש חיץ, למשל, 50 מ"מ פוספט נתרן (pH 7.5), יכול לשפר את התשואות חלבון המטרה אם ממטרים pH נמוך הוא בעיה.
  6. מניחים סל פוליפרופילן ס"מ 23 x 23 x 23 על אריחי תמיכה ולוודא כי סל לא להפריע סיבוב בר ומערבבים וכי הוא שקוע לחלוטין בתוך נוזל. אם יש צורך, מוסיפים מים / חיץ נוסף עד שהסל הוא שקוע לחלוטין, ולאחר מכן להסיר את סל שוב.
    זהירות: כל הצעדים הבאים עד 2.12 לערב את הטיפול נוזל חם. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים לרבות כפפות מבודדות תרמית.
  7. השתמש תרמוסטט מתכוונן להביא באמבט מים עד 70 ° C (או את הטמפרטורה הנדרשת עבור הניסויים). חכו לפחות 15 דקות לאחר הטמפרטורה הרצויה היא הגיעה כדי להבטיח את ההרכבה כולה הגיעה THERMAשיווי משקל l.
  8. כן 150 aliquots גרם מעלי הטבק שנקטפו. מניח aliquot אחד בסל תוך הימנעות דחיסה בלתי הפיכה ופגיעת העלים, למשל, על ידי קריעה. הימנע שגדש את הסל עם חומר צמחי או אריזה צפופה של האחרון.
  9. בזהירות אך במהירות להטביע את הסל בנוזל החם ומניח אותו על אריחי התמיכה. מניח בלוק נירוסטה על גבי הסל למנוע הנפקה.
  10. דגירת העלים למשך 5 דקות בתוך הנוזל הלבן, או בחר זמן אריג תכנון הניסוי. צג הטמפרטורה הנוזלית במהלך תקופת הדגירה כולו.
  11. מוציא בזהירות את הסל מן הנוזל הלבן ולתת לטמיון נוזל שיורה מן העלים למשך 30 שניות. אז קח את עלי הצמח מתוך הסל, ולהעבירם הבלנדר ומיד להתחיל את החילוץ (סעיף 3).
    הערה: צמחים יכולים להישמר במשך פרקי זמן ארוכים לאחר הלבנה ולפני תחילת המיצוי דואר, למשל, יותר מ -30 דקות על קרח או קפוא ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות נבדק בהצלחה. עם זאת, יציבות המוצר עלולה לרדת עם הגדלת פעמי אחסון ובכך עיבוד מיידי מומלץ.
  12. חזור על שלבי 2.8 כדי 2.11 עם חומר עלה טרי עד ביומסה שנקטפה כולו מעובד.

3. הפקת חלבון מן עלי טבק

זהירות: השלבים הבאים לערב בבלנדר עם להבים. אל תעבוד בדלי בבלנדר בזמן שהוא רכוב על מנוע בלנדר.

  1. מניחים 150 גרם (מסה רטוב) של שנקטפו (שלב 1.3) או החוויר (שלב 2.11) עוזבת בבלנדר ומוסיפים 450 מ"ל של מיצוי חיץ (פוספט נתרן 50 מ"מ, 500 נתרן כלורי מ"מ, 10 מ"מ נתרן disulfite, pH 8.0).
    הערה: הרכב חיץ החילוץ תלוי החלבון להיעקר ולכן יכולה לחייב התאמה, למשל, שימוש אחר pH או חיץ רכיב כגון Trהוא.
  2. Homogenize העלים עבור 3 x 30 פולסים שניים עם 30 שניות וביניהם הפסקות. ודא כי העלים הומוגני לא סותמים את הדלי בבלנדר. עצור את הבלנדר והרם את העלים כדי למנוע סתימת במידת הצורך, ולאחר מכן להמשיך את המגון.
  3. לקחת דגימה 1 מ"ל של כל קטע כי הוא מיוצר לניתוח שלאחר מכן (סעיף 7). אם חומר המפעל החוויר, המשך לסעיף 6. אם אין להמשיך עם ממטרים חומים בתוך סיר (סעיף 4) או מחליף חום (סעיף 5), תלוי הגישה הניסויית שנבחרה.

4. אופציונלי: רטיבות מחממים כלי נסער

הערה: ניהול על פי השלבים המתוארים סעיפים 4.2 עד 4.11 כדי לזרז HCPs טבק בתוך כלי זז. דלג על סעיף 4, אם HCPs כולו כבר זירז ידי הלבנה (סעיף 2) או שישקע באמצעות מחליפי חום (סעיף 5).

  1. הגדרת שני מי נפח עבודה 8-Lאמבטיות, למשל, 50 x 40 x 40 ס"מ, ב מוקצף מבודד תרמית או דומה. באמבטיה הראשונה, הר התרמוסטט מתכווננת של בקרת הטמפרטורה הבאה (שלב 4.6). במקרה השני, להוסיף 5 ליטר של מים ללא יונים ו -2 קילו של קרח לקירור הבא (שלב 4.9).
  2. מעבירים את באמבט מים הראשון לצלחת ומערבבים מגנטי, ומניחים את כלי נירוסטה 2-L לאמבטיה מים כך מרכז הכלי מיושר במרכז הצלחת ומערבבים.
  3. מניחים בר ומערבבים מגנטי בתוך כלי נירוסטה. ודא שהשדה המגנטי הוא חזק מספיק כדי לסובב את הבר והמערבב.
  4. מלאו את האמבטיה במים עם מים ללא יונים עד 5 ס"מ מתחת לקצה העליון של כלי נירוסטה. ואז למלא את הכלי עם חיץ חילוץ. מניחים מכסה מוקצף על כלי השיט.
    זהירות: כל הצעדים הבאים עד 4.9 לערב את הטיפול נוזל חם. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים לרבות תוספות תרמיתכפפות ulated.
  5. הכנס במד חום לתוך כלי נירוסטה דרך חור אריג במכסה המוקצפת. הגדר את טמפרטורת המים באמבטיה ל -78 מעלות צלזיוס, דגירה ההרכבה כולה במשך 15 דקות כדי להגיע לשיווי משקל תרמי. ודא כי הטמפרטורה בתוך הכלי הוא 70 מעלות צלזיוס, כ 8 מעלות צלזיוס מתחת לנקודת הסט של באמבט המים.
  6. אם הטמפרטורה בחלל הפנימי של כלי נירוסטה נבדל 70 ° C, להתאים את הטמפרטורה של המים באמבטיה בהתאם ולתת למערכת לאזן במשך 15 דקות אחר. חזור על שלב זה עד לטמפרטורה של הכלי הוא 70 מעלות צלזיוס או כנדרש לצורך הניסוי, ולרוקן את כלי נירוסטה.
  7. יוצקים 300 מ"ל של תמצית (שלב 3.2) לתוך כלי נירוסטה בזמן שהוא עדיין באמבט מים ולהתחיל טיימר. מערבבים את תמצית ב 150 סל"ד ו דגירה של 5 דקות. ודא כי התמצית מגיעה לטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס במשך דקות לפחות 2 במהלך תקופת דגירה זה.
  8. הסר את האמבטיה במים החמה מן הבוחש המגנטי, להוציא את כלי נירוסטה ולמקם אותו בדלי קרים כקרח. מניח את האחרון על הבוחש המגנטי ולהסיר את המכסה המוקצף.
  9. ודא כי homogenate הצמח נסער גם ב 150 סל"ד, למקם את המדחום בקטע הדגירה עד שהוא מגיע לטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס או הטמפרטורה שצוינה על ידי עיצוב ניסיוני.
  10. חזור על שלבים 4.7 כדי 4.9 לכל aliquots. לקחת דגימה 1 מ"ל של כל חום זירז לחלץ ברגע שהוא הגיע לטמפרטורה הסופית, ולאחר מכן להמשיך עם סעיף 6.

5. אופציונלי: רטיבות מחממים מחליף חום

הערה: ניהול על פי השלבים המתוארים בסעיפים 5.2 עד 5.12 כדי לזרז HCPs טבק באמצעות מחליפי חום. דלג על סעיף 5, אם HCPs כולו כבר זירז ידי הלבנה (סעיף 2) או בתוך סיר מחומם (סעיף 4).

  1. הגדרת שתי נפח העבודה 8-Lאמבטיות מים, למשל, 50 x 40 x 40 ס"מ, בדליים קצף פוליסטירן תרמית בידוד או דומה. באמבטיה הראשונה, הר התרמוסטט מתכווננת של בקרת הטמפרטורה הבאה (שלב 5.3). במקרה השני, להוסיף 5 ליטר של מים ללא יונים ו -2 קילו של קרח לקירור הבא (שלב 5.10).
    זהירות: כל הצעדים הבאים עד 5.9 לערב את הטיפול נוזל חם. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים לרבות כפפות מבודדות תרמית.
  2. מלאו את האמבטיה במים הראשון עם 8 L מים ללא יונים. כוונו את הטמפרטורה ל -74.5 מעלות צלזיוס באמצעות התרמוסטט. דגירת ההרכבה במשך 15 דקות כדי להגיע לשיווי משקל תרמי.
  3. כן מיכלים מבודדים על ידי צבת בכוס פלסטיק 0.5-L לתוך מבחנת פלסטיק 1-L ולמלא את הפערים עם צמר גפן. לחלופין, השתמש בכלי מבודד תרמית מוקדשת עם נפח עבודת 0.5-L.
  4. חבר את מחליפי חום למשאבת peristaltic בקצה אחד אל צינור יציאה על והטיהורr לסיים באמצעות L / S 24 צינורות. מניח שני הצינורות מסתיימים יחד עם מדחום בתוך כלי האחסון המבודדים ולמלא אותו עם חיץ חילוץ 300 מיליליטר (איור 2).
  5. מניחים את מחליפי חום לאמבטיה מים חמים להתחיל את המשאבה peristaltic בשיעור של -1 300 מ"ל דקות. ודא כי הטמפרטורה וכתוצאה מכך שכלי השיט שוהה 70 ° C, כ 4.5 מעלות צלזיוס מתחת לנקודת הסט של האמבטיה במים, לאחר 3 דקות.
  6. אם הטמפרטורה בחלל הפנימי של כלי הדם המבודדים נבדלת 70 ° C, להתאים את הטמפרטורה של המים באמבטיה בהתאם ולתת למערכת לאזן במשך 15 דקות אחרות. חזור על שלב זה עד לטמפרטורה של עליות מיצוי חיץ מן הסביבה כדי 70 ° C תוך פחות מ -3 דקות, או שווה לזה הנדרש לצורך הניסוי, ולרוקן את כלי הנירוסטה.
  7. מחק את חיץ החילוץ מהספינה המבודדת ולהכין aliquots 300 מיליליטר של תמצית הצמח. מלאו את כלי מבודדים עם aliquot אחד.
  8. לשאוב את תמצית צמח (סעיף 3.3) דרך מחליף חום ב 300 מ"ל דקות -1 למשך 5 דקות. ודא שהטמפרטורה לחלץ היא 70 מעלות צלזיוס לאחר 3 דקות, או שווה הטמפרטורה שהוגדרה בתכנון הניסוי.
  9. לאחר 5 דקות, מניחים את מחליפי חום לאמבטיה מים קרים כקרח בעוד תמצית עדיין הוא נשאב. מדגירים את ההגדרה הזו עד הטמפרטורה מגיעה בדיוק 20 ° C, או הטמפרטורה שהוגדרו בתכנון הניסוי.
  10. הסר את צינור כניסת מחוברת משאבת peristaltic מהספינה המבודדת ולהמשיך שאיבה לאסוף תמצית צמח שיורית זרז חום מתוך מחליף החום. ואז להפסיק את המשאבה.
  11. חזור על שלבים 5.7 כדי 5.10 עבור כל aliquots. לקחת דגימת 1 מיליליטר של כל תמצית חום-זרז פעם היא הגיעה הטמפרטורה הסופית, ולאחר מכן לעבור על התמציות כדי סינון שקית (סעיף 6).
    הערה: לאחר מחזור ראשון באמצעות צעדי 5.7 עד 5.10 לא יהיה חיץ חילוץלהשליך בשלב 5.7.

6. סינון תיק של הצמח חלץ

  1. הר מסנן שקית לתוך סל התמיכה המקביל אשר מצויד לתוך בית המסנן מספק תמיכה מכאנית עבור החומר המסנן הגמיש. מניחים כלי 1-L מתחת לסל ולהחיל את aliquots תמצית (סעיף 3.3, 4.10 או 5.11 תלוי טיפול בחום שנבחרו) על התיק בשיעור של 150 מ"ל דקות -1.
  2. לאחר סינון, למדוד את העכירות של 1:10 דילול של תסנין במאגר החילוץ באמצעות turbidimeter.
  3. לקחת דגימה 1 מ"ל ולעבד את תסנין שקית כהגדרתו תכנון הניסוי, למשל, סינון עומק 7,10 כרומטוגרפיה.

ניתוח מדגם 7.

  1. מדוד את הכמות (TSP) חלבון מסיס הכולל בשיטה ברדפורד 24,25.
    1. בשלושת עותקים, פיפטה 2.5 μl של כל דגימה לתוך הבארות היחידות שלצלחת 96-היטב. כלול שמונה אלבומין בסרום שור (BSA) סטנדרטים בשלושה עותקים כיסוי טווח 0 - 2,000 מיקרוגרם מ"ל -1.
    2. הוסף 200 μl ברדפורד מגיב היטב כל ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה אבל בעדינות מספיק כדי למנוע טביעה בועות.
    3. דגירה במשך 10 דקות ב 22 מעלות צלזיוס, למדוד את הספיגה ב 595 ננומטר ב ספקטרופוטומטר. חשבתי את ריכוז TSP בדגימות המבוססות על עקומת סטנדרט דרך נקודות התייחסות BSA.
  2. לכמת Vax8 ידי ספקטרוסקופיה בתהודה plasmon משטח 26.
    1. הגדרת המכשיר תהודה plasmon משטח עם 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) הפעלת המאגר (10 HEPES מ"מ, 3 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 1,500 מ"מ נתרן כלורי, 0.05% v / v polysorbate 20, pH 7.4) ו הר שבב משטח dextran carboxymethylated לתוך המכשיר. השתמש בפונקצית הממשלה לרוקן את המערכת ולהתחיל לרוץ ידני עם קצב זרימה של 30μl דקות -1 על תאי זרימת 1 ו -2 מימן כלורי להזריק 30 מ"מימ פעמים במשך 60 שניות עם הזרקת 60 שניות שלובות של נתרן הידרוקסידי 25 מ"מ.
    2. הכן 200 μl של 500 מיקרוגרם מ"ל -1 מב 5.2 פתרון נתרן אצטט 10 מ"מ (pH 4.0). ההפשרה 1-אתיל-3- (3-dimethylaminopropyl) hydrochloride carbodiimide (EDC) ו- N -hydroxysuccinimide (NHS) צלוחיות צנטריפוגות אותם XG 16,000 דקות 1. מערבבים 70 μl של EDC עם 70 μl של NHS ולהעביר בקבוקון פלסטיק 7 מ"מ.
    3. הפעל את פני שבב שטח dextran carboxymethylated ידי הזרקת תערובת EDC / NHS מעל תאי זרימה 1 ו -2 במשך 10 דקות עם קצב זרימה של 10 דקות μl -1.
    4. הגדר את נתיב הזרימה לזרום תא 2 בלבד. זוג מב 5.2 ידי הזרקת אותו במשך 15 דקות בקצב של 10 דקות μl -1.
    5. החלף את נתיב הזרימה לזרום תאים 1 ו -2 ולהזריק ethanolamine עבור 7 דקות בקצב של 5 μl דקות -1 כדי לבטל את פני השטח. Tתרנגולת להזריק 30 מ"מ מימן כלורי פעמים במשך 60 שניות עם הזרקת 60 שניות שלובות של נתרן הידרוקסידי 25 מ"מ.
    6. להזריק את דגימות MSP1 - 19 תקנים בשיעור של 30 דקות μl -1 עבור 180 שניות. ודא כי ריכוז Vax8 הוא 50 - 1,000 ng מ"ל -1. הכן-דילולים טרום ב HEPES שנאגרו מלוחים המכיל EDTA ו polysorbate 20 (HBSEP) במידת הצורך.
    7. הפחת את אות השיא של תא זרימת 1 מזו של תא הזרימה 2 ולהשתמש ההבדל לחשב את ריכוז Vax8 בדגימות על פי האיתות של MSP 1 - ההזרקה 19 עם ריכוז חלבון ידוע של 500 ng מיליליטר -1.
    8. לחדש את פני השבב לאחר כל דגימה או 1 MSP - 19 הזרקה כתוצאה מחשיפת 30 מימן כלורי מ"מ עבור 60 שניות בקצב זרימה של 30 μl דקות -1.
  3. לכמת DsRed על ידי ספקטרומטריית פלואורסצנטי
    1. בשלושה עותקים, פיפטה 50 μl של כל דגימה לתוך הבארות היחידות של א-ar חצי שחורצלחת 96-היטב ea. כוללים שישה תקנים DsRed כיסוי בטווח 0 - 225 מיקרוגרם מ"ל -1.
    2. למדוד את הקרינה בשני עותקים באמצעות מסנן עירור ננומטר 530 ± 30 ומסנן פליטה ננומטר 590 ± 35 ב ספקטרופוטומטר. חשבתי את ריכוז DsRed בדגימות המבוססות על עקומת סטנדרט דרך נקודות התייחסות DsRed.
  4. קביעת הפצות גודל החלקיקים
    1. לשטוף קובט עם isopropanol 1 מ"ל ולאחר מכן עם 2 מ"ל מים ללא יונים להסיר חלקיקי אבק. פיפטה 850 μl של המדגם לתוך קובט.
    2. מניחים את קובט לתוך מנתח גודל הפוטנציאל ואת החלקיקים זטה. פתח את "התוכנה" ולהתחיל מדידה ידנית עם "חלבון" כחומר ו "PBS" כמו הפיזור. בחר טמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, זמן איזון של 180 שניות.
    3. בחר את התא "DTS0012" ולמדוד ב 173 backscatter °. בדוק את funct "האוטומטי"יון למשך המדידה ובחר שלוש מדידות ללא דיחוי שלוב.
    4. חקור את פרופיל שיא התפלגות גודל חלקיקים לאחר המדידה תושלם על ידי בחירת שלוש המדידות של המדגם בתצוגת הניסוי. בחר את הכרטיסייה "Volume PSD".

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ממטרים חומים של חלבוני תא מארח טבק ידי לבן
ההליך הלבנה בסעיף 2. שימש בהצלחה כדי לזרז HCPs מטבק עלים עם 70 מעלות צלזיוס, דבר שיפחית את TSP ידי 96 ± 1% (n = 3) בעודו מחלים עד 51% של חלבון המטרה Vax8, ובכך להגדיל שלה טוהר מ -0.1% ל -1.2% לפני ההפרדה chromatographic 16. זה היה גם ניתן לשחזר 83 ± 1% (n = 3) של חלבון פלואורסצנטי DsRed, הגדלת הטוהר שלה מ -3.3% ל 64.1%. ההליך הלבן היה לשלב בקלות לתוך תכנית חילוץ והבהרה סטנדרטית מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלוש השיטות עבור משקעים חום המתואר לעיל ניתן להסיר ביעילות HCPs טבק לפני כל צעד טיהור chromatographic 16,17. הם משלימים אסטראטגי אחרים שמטרתן להגדיל טוהר מוצר ראשוני, למשל, guttation 29, rhizosecretion 30 או צנטריפוגלי חילוץ 31,32, שכולן מוגבלי חלבונים מופרשים. עם זאת, השיטות מבוססות החום ניתן להשתמש רק בצורה משמעותית אם חלבון המטרה להיטהר יכול לעמוד בטמפרטורת ממטרי המינימום של ~ 60 מעלות צלזיוס במשך יותר מ 1 דקות. לכן, הצעד הרא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לד"ר תומאס רדמאכר, אלכסנדר בואס וורוניק בייס על אספקת זרעי הטבק המהונדסים, ולאיברהים אל עמדי על טיפוח צמחי הטבק. המחברים מבקשים להודות לד"ר ריצ'רד מ. טווימן על הסיוע בעריכה וכן לגובן אדגו על מתן ההפניה ל-MSP1-19. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המענק המתקדם של מועצת המחקר האירופית "Future-Pharma", הצעה מספר 269110, Fraunhofer-Zukunftsstiftung (קרן העתיד של Fraunhofer) ותוכניות פנימיות של Fraunhofer-Gesellschaft במסגרת מענק מס. משוך 125-600164.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2100P נייד טורבידימטרHach46500000Turbidimeter
GEHealthcareBR100050 ערכת צימוד שבב SPR
סל חיטויNalgene6917-0230סל להלבנת עלים
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01מכשיר SPR
מנתח תאים ביו BCA 003 R& D עם 3D ORMSequipn.a.Particleגודל אנלייזר
בלנדרWaring800EGבלנדר
BP-410Furh2632410001שקית מסנן
צנטריפוגה 5415DEppendorf5424 000.410צנטריפוגה
צינור צנטריפוגה 15 מ"לLabomedic2017106צינור
תגובה צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עצמאישפופרת תגובה1110504
CM5 שבבGE HealthcareBR100012 שבב למדידות SPR
קובט 10 x 10 x 45Sarsted67.754קובט עבור Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.תוכנת n.a.DoE
דיסודיום פוספטCarl Roth GmbH  4984.3 רכיב מדיה
Ferty 2 MegaKammlott5.220072דשן
פורמה -86C מקפיא ULT מקפיאThermoFisher88400חממת מקפיא
צמחים
גרודן קוביות צמר סלעים 10 x 10 ס"מגרודן102446בלוק צמר סלעים
מחליף חום לולאת טוונטי (אורך 4.8 מ')n.a. (עיצוב מותאם אישית)n.a.Heat מחליף
HEPESCarl Roth GmbH9105.3רכיב מדיה
K200P 60Dשכבתמסנן עומק
5302303 KS50P 60DPallB12486שכבת מסנן עומק
Lauda E300Lauda Dr Wobser GmbHZ90010תרמוסטט אמבט מים
L/S 24MasterflexSN-06508-24צינורות
mAb 5.2סוג אמריקאי אוסף תרבותHB-9148Vax8 נוגדן ספציפי
Masterflex L/SMasterflexHV-77921-75משאבה פריסטלטית
MiraclothLabomedic475855-1Rבד סינון
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020מד pH / מד מוליכות
Osram לבן מגניב 36 WOsram4930440 מקור אור
PhytotronIlka Zelln.a.לגידול צמחים
נתרן דיסולפיטCarl Roth GmbH8554.1רכיב מדיה
נתרן כלוריCarl Roth GmbHP029.2רכיב מדיה
כלי נירוסטה; 0.7 ק"ג 2.0 ליטר; גובה 180 מ"מ; קוטר 120 מ"מ(עיצוב מותאם אישית)נ.א.מיכל למשקעי חום
Synergy HTBioTekSIAFRTפלואורסצנטי וקורא צלחות ספקטרומטרי
VelaPad 60PallVP60G03KNH4בית מסנן
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS מדידת התפלגות גודל חלקיקים
Zetasizer Software v7.11Malvernn.a.תוכנהלהפעלת מכשיר Zetasizer Nano ZS
ערכת צימוד אמין Labomedic n.a.n.a.לגידול

מקורות

  1. PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
  2. Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  3. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
  4. Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  9. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  11. Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
  12. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  13. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  14. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  15. Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
  16. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  17. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  18. Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
  19. Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
  20. Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
  21. Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
  22. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216(2014).
  23. Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940(2016).
  24. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
  25. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  26. Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
  27. Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
  28. Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
  29. Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
  30. Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
  31. Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
  32. Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
  33. Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
  34. Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
  35. Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
  36. Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
  37. Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
  38. Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
  39. Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
  40. Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336(2006).
  41. Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
  42. Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים