הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

6.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54372

⸱

16 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השראת תוכנית המוגנית בפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות ביטוי יתר של קבוצה מינימלית של גורמי שעתוק. טכנולוגיה זו עשויה להיות מתורגמת למערכת האנושית כדי לספק פלטפורמות למחקר עתידי של המטופואיזה, מחלות המטולוגיות והשתלת תאי גזע המטופויאטיים.

תקציר

פרוטוקול זה מפרט את השראת תוכנית המוגנית בפיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) באמצעות ביטוי יתר של גורמי שעתוק (TFs). תחילה עיצבנו מסך מדווח באמצעות MEFs מעכברים טרנסגניים כפולים CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP). תאי CD34+ מעכברים אלה מסמנים היסטונים H2B ב-GFP, ומפסיקים את התיוג עם הוספת דוקסיציקלין (DOX). MEFS הומרו עם TFs מועמדים ולאחר מכן נצפו להופעתם של תאי GFP+ שיצביעו על רכישת גורל של תאים המטופויאטיים או אנדותליים. החל מ-18 TFs מועמדים, ודרך תהליך של חיסול קומבינטורי, השגנו קבוצה מינימלית של גורמים שיגרמו לאחוז הגבוה ביותר של תאי GFP+. מצאנו ש-Gata2, Gfi1b ו-cFos היו נחוצים והתוספת של Etv6 סיפקה את האינדוקציה האופטימלית. סדרה של ניתוחי ביטוי גנים שנעשו בנקודות זמן שונות במהלך תהליך התכנות מחדש גילתה כי נראה כי תאים אלה עוברים דרך תא מבשר שעבר מעבר אנדותל להמטופויאטי (EHT). ככזה, תהליך תכנות מחדש זה מחקה המטופואיזיס התפתחותי "בצלחת", ומאפשר מחקר של המטופואיזיס במבחנה ופלטפורמה לזיהוי המנגנונים העומדים בבסיס מפרט זה. מתודולוגיה זו מספקת גם מסגרת לתרגום עבודה זו למערכת האנושית בתקווה ליצור מקור חלופי של תאי גזע המטופויאטיים ספציפיים לחולה (HSCs) למספר יישומים בטיפול ומחקר של מחלות המטולוגיות.

מבוא

Hematopoiesis היא תהליך התפתחותי מורכב שבו בתאי גזע hematopoietic (HSCs) יוצאים מגוף האנדותל hemogenic קיים במגוון רחב של אתרי hematopoietic עובריים כגון האאורטה-בלוטת המין-כלה ואת 1,2 השליה. חוסר יכולת התרבות HSCs במבחנה מונעת עומק בניתוח של התהליך הזה, כמו גם את היישום הקליני של מחקרים אלה. כדי לעקוף מגבלה זו, מחקרים קודמים ניסו לגזור HSCs דה נובו או דרך בידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs) 3, או פלסטיות מושרה בתאים הסומטיים בידול מכוון באמצעות מדיה תכנות מחדש 4,5. מחקרים אלה, לעומת זאת, לא לייצר תאי engraftable בטוחים קליני או לאפשר מחקר של hematopoiesis התפתחותי הסופי "בצלחת".

עבודת הרומן שהקימה יאמאנאקה ועמיתיו ליצור מושרה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) מ- p פיברובלסטים סומטייםrovides מסגרת גורם שעתוק (TF) אסטרטגיות ביטוי יתר מבוססות גורל תא תכנות מחדש 6,7. עבודה זו הביאה חוקרים בתחומים שונים כדי ליצור סוגי תאים של בחירה באמצעות תכנות מחדש TF של תאים סומטיים להשגה בקלות. מטרת אסטרטגית תכנות מחדש המתוארת כאן היא להשפיע על תהליך hemogenic מן תאי הסומטיים עכבר באמצעות גישת תכנות מחדש מבוסס TF במטרת תרגום ממצאים אלה למערכת האנושית לתכנת מחדש fibroblasts מטופל ספציפי כדי ללמוד hematopoiesis האנושי במבחנה ליצור מוצרי דם מטופל ספציפי עבור מודלי מחלה, בדיקות סמים, גזע השתלה תאית.

הצעד הראשון כדי להבטיח תכנות מחדש נאה במערכת העכבר הזה היה לפתח קו כתב ששמש מחוץ קריאה לביטוי CD34, סמן ידוע ובתאי אנדותל HSCs. כדי לעשות זאת, קווי huCD34-TTA ו TETO-H2BGFP העכבר המהונדסים שמשו gפיברובלסטים עובריים בעכבר כפול enerate מהונדס (MEFs), עכשיו מסומן 34 / H2BGFP, כי לזרוח ירוק באקטיבציה של האמרגן CD34 8. זה איפשר הקרנת מגוון של TFS ידוע להידרש בנקודות שונות במהלך מפרט hematopoietic ופיתוח. החל 18 TFS וקטורים retrovial PMX (נקבע באמצעות כריית ספרות פרופיל של תווית GFP שמירה HSCs מן שתואר לעיל 34 / H2BGFP עכברים), 34 / H2BGFP MEFs היו transduced עם כל הגורמים ותרבותי על AFT024 HSC-תאים תומכים סטרומה. לאחר זיהוי של הפעלת 34 / H2BGFP, TFS שהועבר בפועל מקוקטייל תכנות מחדש עד ששקעה האופטימלי של TFS להפעלת כתב זוהה. לאחר מסך ראשוני זה, הגורמים הועברו מערכת וקטור DOX מושרה pFUW לאפשר ביטוי לשליטה של ​​TFS. מאז שתי אלה מערכות לשליטת DOX אינן עולים בקנה אחד (תאי 34 / H2BGFP ואת וקטורי pFUW המושרים), MEFs מwild-type C57BL / 6 עכברים נדרשו. זה היה גם צורך לספק microenvironment שראוי לאפשר hemogenesis כדי להמשיך וליצור אבות clonogenic multilineage.

מחקרים עכשוויים המנסים לתכנת מחדש תאי סומטיים לתאי גזע אבות היווצרות דם (HSPCs) נפגשו רמות מגוונות של הצלחה 9-11. נכון להיום, דור שני עכבר HSPCs להשתלת אדם עם לטווח ארוך ויכולת repopulating עצמית חידוש שלא הושג באמצעות אותה הקבוצה של TFS. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור מפורט של האסטרטגיה הוקמה בעבר לגרום hemogenesis reproducibly ב MEFs. אנו מדגימים הקדמה של מספר מינימאלי של TFS (Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, ואת Etv6) מסוגל ייזום תכנית התפתחותית מורכבת במבחנה המספקת פלטפורמה שבאמצעותה hematopoiesis התפתחותיים יישום קליני של תכנות מחדש hematopoietic ניתן ללמוד עוד 12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה: שורות תאי עכבר נגזרות בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי החיים של אייקן הספר לרפואת הר הסיני, וצריכות לעשות תואם לכל מוסד מארח.

1. פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) בידוד של עכברים C57BL / 6

  1. הגדרת מתוזמן הזדווגות 13. ברגע תוסף הנרתיק הוא מדמיין, לשקול יום זה 0.5.
  2. הפרד את הנקבות הפקוקות במועד התקע ולבדוק עליהם בחג 10-11 כדי לאשר את ההריון.
  3. ביום 13.5-14.5 להרדים עכברות הרות באמצעות CO 2 משאיפת ואחריו נקע בצוואר הרחם.
  4. משרי בטן נקבה בהריון עם 70% אתנול, לנתח את חלל הבטן עם מספרי סטרילית מלקחיים לאורך קו האמצע, כירורגית להסיר את קרן הרחם המכילה את העוברים 14. להוציא את העוברים בעדינות תוך ניתוק רקמת בטן הנותרים.
    הערה: שחזור על 8 עובר עם 4 בכל צד.
  5. מניחים את h הרחםorns המכיל את העוברים בתוך צלחת 10 ס"מ עם 5-10 מ"ל של בופר פוספט צונן סטרילי (PBS).
  6. עם מספרי מלקחיים סטרילית, עושה חתך לאורך קרן הרחם כדי לבודד את הצ'קים נושאים את העוברים. מעבירים את שקי לצלחת 10 ס"מ חדש עם 5-10 מ"ל של סטרילית מקורר PBS ומניחים על קרח.
  7. מניחים כמה שקי לתוך צלחת 10 ס"מ חדש עם 5-10 מ"ל של PBS צונן סטרילי. בעזרת מספרי מלקחיים סטרילית בעדינות לבתק הצ'קים (בלי לחתוך עמוק מדי) כדי להימנע פירסינג עובר.
  8. הפרד את העוברים מן השליה על ידי חיתוך חבל הטבור.
  9. מעבירים את העוברים על צלחת חדשה 10 ס"מ המכיל 5-10 מ"ל של PBS מקורר ולהשאיר על הקרח בעת השלמת והניתוחים הנותרים.
  10. לערוף את העוברים באמצעות מלקחיים סטרילית. בזהירות לחתוך את קו האמצע של העובר באמצעות מספרי סטרילית מלקחיים, החלו מהאזור ערוף לפתוח את הבטן. תפקיד מלקחיים מתחת tהוא איברים קרביים (כולל הלב, הכבד וריאות) ומוציאים אותם 15.
  11. חותכים את הרקמה הנותרת לחתיכות קטנות באמצעות מספריים מלקחיים והעברת צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של טריפסין.
  12. Pipet מעלה ומטה עם pipet 10 מ"ל 20-30 פעמים כדי לערבב לנתק את הרקמה.
  13. דגירת רקמות תמהיל טריפסין באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות, מתערבלת מדי פעם.
  14. Pipet מעלה ומטה עם pipet 10 מ"ל במשך כ 5 דקות לערבב את תוכנו.
  15. הוספת תאים trypsinized פי 3 נפח בינוני הנשר שונה של תקן Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור העובר (FBS), 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פניצילין / סטרפטומיצין (P / S), ו 1 מ"מ L- גלוטמין (L-היצף) ב מנות 10 ס"מ (~ 10 מ"ל) ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס עד ומחוברות (כ 2-4 ימים). תרבות על 1-2 עוברים לכל צלחת 10 ס"מ.
    הערה: הקפאת תאים פעם צלחות הם ומחובר. תאים קפואים ניתן להפשיר ו passaged פי 2 יותר. תאים יכולים להיות לחילופיןלפצל 2 פעמים לפני ההקפאה, ולאחר מכן פעם נוספת לאחר מופשר.

2. הפקת ויראלי

  1. להרחיב תאים 293T ב 10 צלחות ס"מ עם DMEM 10 מ"ל עם 10% FBS, 1% P / S, ו -1% L-שפע עבור transfection.
    1. Trypsinize תאים 293T עם 2 מ"ל טריפסין, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לאסוף את התאים לתוך 15 מ"ל צינורות, ספין ב 300 XG, צלחת כראוי (10 מ"ל לכל 10 צלחת ס"מ).
  2. hr 24 לפני transfection, לפצל ס"מ צלחת ומחוברות 10 של תאים 293T 1: 6 ו זרע ג'לטין 10 ס"מ מצופה (ג'לטין 0.1% ב PBS) צלחות.
    הערה: 4 צלחות לכל וירוס תידרשנה.
    1. כדי צלחות מעיל ב ג'לטין, להוסיף לפחות 2 מ"ל של פתרון ג'לטין 0.1% ל מעיל התחתון של 10 צלחות ס"מ. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לפחות. לשאוב את הג'לטין לפני ההוספה לתאי הצלחות.
  3. בתוך צינור 15 מ"ל, להוסיף 84 מיקרוגרם פלסמיד (למשל Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, או Etv6 (תת-משובטים לתוך vect pFUW-TETOאו 16) או FUW-M2rtTA 17), 84 מיקרוגרם psPAX2, ו -42 מיקרוגרם pMD2.G. מוסיפים מים (H 2 O) כדי להפוך את עוצמת הקול עד 2 מ"ל. להכין צינור לכל גורם (למשל. Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, Etv6 ו FUW-M2rtTA).
  4. הוסף 250 μl של 2M CaCl 2 על צינור אחד המכיל את תערובת 2 מ"ל המורכב 84 מיקרוגרם של גן נבחר (Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, Etv6 או FUW-M2rtTA) + 84 מיקרוגרם psPAX2 + 42 מיקרוגרם pMD2.G + H 2 O .
  5. שימוש pipet פסטר מוכנס לתוך עזרת pipet, שחרור הבועות לתוך תערובת 2.25 מיליליטר DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2. כמו בועות שיופקו, הניחו את קצה של P1000 נגד זכוכית pipet ולאט לאט להוציא 2 מ"ל של 100 מ"מ N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethane חומצה sulfonic (BES) מלוחים במורד pipet פסטר 1 מ"ל בכל פעם.
  6. דגירה כל הצינורות בשכונת התרבות בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות לפחות.
    הערה: 4.25 מ"ל תערובת (כיום DNA + H 2 O + 2M CaCl 2 + BES מלוח) ייראה מעונן במקצת.
  7. ככל תערובת דוגר, התקשורת לשאוב מצלחות 293T ולהוסיף 10 מ"ל DMEM + 10% FBS + 1 מ"מ L- גלוטמין + 25 ננומטר chloroquine.
    הערה: התקשורת זה אינו מכיל P / S.
  8. לאחר לפחות 15 דקות של דגירה (או עד שינוי תקשורת על תאי 293T), מוסיף את 4.25 מיליליטר DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES תערובת מלוחה טיפה חכמה תאי 293T, הפצה באופן שווה על פני 4 צלחות תא לכל צינור (כלומר מעט יותר מ -1 מ"ל של תערובת לכל צלחת).
  9. דגירת צלחות הלילה (O / N) על 37 מעלות צלזיוס.
  10. הדגירה 24 שעות שלאחר, להחליף התקשורת על כל צלחות עם 4 מ"ל DMEM רגיל (ראה שלב 1.15).
  11. שמור את תאי C חממת 32 ° מעתה והלאה.
  12. 24 שעות לאחר שלב 2.10, לאסוף מדיה לתוך צינורות 50 מ"ל נפרד. החלף את המדיה שנאספו כל צלחת עם 4 מ"ל לסטנדרטים DMEM.
    הערה: 4 צלחות לכל תוצאות תערובת צינור ראשוניות ב -16 מיליליטר של תקשורת שנאספה.
    1. אחרה 12 שעות של דגירה, לאסוף תקשורת שוב לאותו 50 מ"ל צינורות ולהחליף עם 4 מיליליטר אחר לסטנדרטי DMEM.
    2. לאחר 12 שעות של דגירה, לאסוף את התקשורת להוסיף לאותו 50 מ"ל צינורות.
      הערה: כל צינור צריך עכשיו מכיל כ 48 מיליליטר של תקשורת המכילה וירוס.
  13. כדי לרכז את הווירוס שנאסף, המסנן ראשון בתקשורת שנאספה באמצעות 0.45 מיקרומטר מסנן מחייבים דלת חלבון.
  14. יוצק את התקשורת המסוננת המכילה וירוס לתוך צינורות צנטריפוגות ריכוז נגיפיים (כ -16 מ"ל בכל פעם).
  15. ספין ב 4000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות ולהסיר זרימה דרך.
    הערה: נפח קטן של תקשורת נגיף המרוכזות יהיה גלוי במסנן.
  16. להוסיף עוד 16 מיליליטר של תקשורת וירוס המכיל מסוננת נפח תקשורת המרוכז + הווירוס הנותר במסנן ומערבב על ידי צינור היפוך.
  17. ספין צינור שוב ב 4000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות ו וזורקים זרימה דרך.
  18. הוסף נותרים מסונניםאוסף לכרך וירוס + מדיה מרוכזת עזב במסנן ומערבבים על ידי צינור היפוך.
  19. ספין שוב ב 4000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10-20 דקות (תלוי בנפח במסנן) ולהבטיח כי נפח הנותרים של נגיף מרוכז מדיה + שמאל במסנן הוא בערך 1 מ"ל. אם יותר מ -1 מ"ל של התקשורת + נגיף מרוכז נשאר במסנן, ספין שוב ב 4000 XG דקות 1 וחזור עד 1 מ"ל נשאר המסנן.
  20. Aliquot 200 μl של נגיף מרוכז לתוך 1.5 מ"ל צינורות ולהקפיא ב -80 ° C או להשתמש מיד.

3. תכנות מחדש MEF

  1. טרום מעיל 6 היטב צלחות עם 0.5 מ"ל של ג'לטין 0.1% ב PBS לכל טוב, על מנת להבטיח כי ג'לטין מכסה את כל שטח הבאר. מניחים בתוך חממה 37 ° C ו דגירה במשך 20 דקות לפחות. לאחר דגירה, להסיר את הצלחות לשאוב את הג'לטין.
  2. MEFs צלחת עם DMEM רגיל בצפיפות של 25,000 תאים בכל טוב (150,000 תאיםלכל צלחת 6-היטב) על צלחת 6 באר gelatinized (ים) משלב 3.1 ולאפשר להתיישב O / N בתוך 37 ° C חממה.
  3. הכן קוקטייל וירוס 100 μl ידי ערבוב 50 μl M2rtTA ואת 50 μl הנותרים שילוב של Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, ואת Etv6 (12.5 μl כל אחד).
  4. לשאוב מדיה מן MEFs ולהוסיף 2 מ"ל תקן DMEM עם 8 מיקרוגרם / ברומיד hexadimethrine מ"ל.
  5. Transduce היטב בכל הצלחות MEF עם 15 μl של קוקטייל וירוס דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: זהו יום 0 של תהליך תכנות מחדש.
  6. ביום 1, לאחר 16-20 שעות של דגירה, להחליף תקשורת עם 2 מיליליטר DMEM תקן הטרי בתוספת 1 מיקרוגרם / מיליליטר DOX לכל טוב.
  7. כן תקשורת תרבות hematopoietic בתוספת הידרוקורטיזון (10 -6 M), 100 ng / ml גזע גורם תא (SCF), 100 טירוזין קינאז ng / ml הקשורות Fms ליגנד 3 (Flt3L), 20 ng / -3 interleukin מיליליטר (אִי- 3), 20 ng / ml interleukin-6 (IL-6), ו 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DOX.
  8. ביום 4 aspiratדואר התקשורת מכל טוב ולשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS לכל טוב.
  9. לשאוב PBS, לנתק תאים באמצעות 1 מ"ל של טריפסין 0.05% לכל טוב לאסוף את התאים.
  10. ספירת תאים עם hemocytometer, ספין ב XG 300 במשך 5 דקות, resuspend ב 12 מ"ל של התקשורת hematopoietic כמתואר בשלב 3.7 צלחת 60,000 תאים לכל צלחת 6-גם על צלחות מצופה ג'לטין 0.1% (2 מ"ל לכל טוב, 10,000 תאים לכל טוב ).
  11. חלף תקשורת עם תקשורת ותרבות hematopoietic בתוספת טריה מדי 6 ימים למשך התרבות (35 כדי 36 ימים).
  12. לנתח או תאי ביניים או תאי hematopoietic דמוי המתעוררים באמצעות מכתים חיסוני 12, ניתוח FACS 8,12, qRT-PCR 12, ו mRNA רצף 12 כדי לאשר את רכישת אנדותל hemogenic או HSC דמוי סמני ביטוי גנים.

4. Aggregation שלית מושבה יחידים פורמינג (CFU) מבחנים ב Methylcellulose

  1. לנתח השליות מן בהריון C5עכברי 7BL / 6 כפי שתוארו לעיל 18 ב E12.5 ולשמור רקמות על קרח.
  2. כדי להתחיל דיסוציאציה השליה 19, לשטוף רקמה השליה 2-5 מ"ל של 0.2% סוג collagenase אני PBS עם 20% FBS ו לנתק באופן מכני עם מחט 18G מצויד לתוך מזרק 5 מ"ל על ידי passaging השליה PBS דרך המחט לפחות 3 פעמים.
  3. לאחר ניתוק מכני, לשמור על התאים השליה 2-5 מ"ל של תמיסת collagenase ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.
  4. תאי מעבר דרך 20-25 מחטי G מצוידים על 5 מיליליטר מזרקים כמה פעמים עוד מכאני לנתק את תאי השליה.
  5. סנן השעיות תא בודדות דרך 70 מסננות מיקרומטר תא.
  6. ספירת תאים עם hemocytometer ו מקרינים על 2,000 cGy עבור איון mitotic 20.
  7. הוסף 10 מ"ל של התקשורת בתרבות hematopoietic בתוספת 100 SCF ng / ml, 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, ו -10 ng / thrombopoietin מ"ל (TPO) על 10 ס"מ צַלַחַת.
    הערה: DOX אינו נדרש בשלב זה.
  8. מקום מסנן 0.65 מיקרומטר ישירות על תקשורת ותרבות hematopoietic בצלחת, המאפשר לו לצוף ליצור ממשק נוזל-גז והניח את הצלחת הצידה.
  9. לנתק יום 25 MEFs transduced (נגזר צעד 3.11) כמתואר בשלבים 3.8-3.10 ומערבבים 33,000 של MEFs transduced עם 167,000 תאים של אגרגטים השליה משלב 4.6 (1: 6 יחס).
  10. כדי ליצור 18,21 המצרפי, ספין ראשון במורד MEF ותמהיל תא שליה משלב 4.9 במשך 5 דקות ב 300 x ז. לשאוב התקשורת resuspend התאים pelleted ב 30-50 μl של DMEM רגיל באמצעות פיפטה P200, ציור ההשעיה תא בודד אל קצה פיפטה 200 μl nonbevelled.
  11. לחסום את הקצה פיפטה עם סרט פרפין. הנח את הקצה חסם לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ומסובב במשך 5 דקות ב 300 XG כך נוצרה גלול בסוף המכוסה של הקצה.
  12. הסר את הקצה מהצינור 15 מ"ל בזהירות המקוםהקצה על סוף פיפטה P200. מחק את הסרט פרפין extrude התא גלולה על המסנן צף משלב 4.8.
    הערה: פלייט לכל היותר 3 אגרגטים לכל מסנן.
  13. תרבות מצרף על 0.65 מיקרומטר המסננים צפו במשך 4-5 ימים ב -37 ° C עם 5% CO 2.
  14. אסוף המצרפים (לכל היותר 3 לכל מסנן) עם מגרד תא, לשלב אותם, ולעכל עם collagenase 0.2%, בעקבות אותו הפרוטוקול כפי שנעשה עם השליות כולו לנתק את התאים (שלבי 4.2-4.5).
  15. לאחר ניתוק, לשטוף אגרגטים עם 2-5 מ"ל של PBS השלימו עם FBS 5% ומסובב תאים ב XG 300 במשך 5 דקות.
  16. Resuspend המצרפים ב 500 μl של DMEM ללא FBS, P / S, או-שפע L. קח 500 זה resuspension μl ולהוסיף אותו 3 מ"ל 1% מדיה methylcellulose בתוספת 10 ng / ml של TPO, למנוע את היווצרות של בועות בזהירות. כרכים פלייט שווה של תערובת זו ב 3 35 x 10 מנות תרבות שאינם מטופלים מ"מ עבורCFU מבחני 12.
  17. כביקורת, תרבות מוקרן אגרגטים השליה ללא ערבוב MEFs לתכנות מחדש 4-5 ימים ומניחים מבחני CFU כמתואר לעיל בצעדים 4.7-4.16.
    הערה: אלה אגרגטים לבד לא יוצרים מושבות.
  18. רוזן מושבות hematopoietic הידני תחת מיקרוסקופ לאחר 10-14 ימים של תרבות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  19. Cytospin 22 הרים מושבים להראות הפנוטיפ מורפולוגיים של תאים בודדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Hematopoiesis היא תהליך התפתחותי מורכב שמתחיל אתרים עובריים שונים. תאי אנדותל Hemogenic מתגוררים באתרים אלה להצמיח HSCs באמצעות תא ניצני 23. תהליך זה כרגע לא ניתן לשחזר על ידי הצבת HSCs או מבשרי hematopoietic בתרבות, דבר המחייב מתודולוגיה איכשהו להשיג תאים אלה במבחנה, בין אם על ידי הרחבת HSPC vivo לשעבר או דור דה נובו. פרוטוקול זה מדגים הטכנולוגיה החדשנית שלנו המנסה להשיג תאים אלה באמצעות ביטוי יתר TF ב MEFs. <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יצירת HSPCs דה נובו מן התאים הסומטיים להשגה בקלות מציעה שיטה ייחודית ללמוד hematopoiesis במבחנה, וההזדמנות פוטנציאל ליישם את הטכנולוגיה הזו על המערכת האנושית. התרגום הזו יעורר כלי חדש ללמוד מחל המטולוגית אדם בצלחת, כמו גם לספק פלטפורמות בבדיקת סמי גן מיקוד הזדמנויות לטיפול בהפרעות רבות עם הרפוי רומן או השתלות HSC. בתחום, מחקרים שנעשה לאחרונה הרחיבו על היכולת ליצור HSPCs דה נובו, הוכיחו את החשיבות של מספר תכונות של תהליך תכנות מחדש. אלה כוללים את הבחירה ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NHLBI לק.מ. ו-I.R.L. (1RO1HL119404). קרלוס-פיליפה פריירה זכה במלגה ביו-רפואית בכירה של רבסון. אנו מודים למתקן המשאבים המשותפים של הר סיני hESC/iPSC ול-S. D'Souza על הסיוע בחומרים ובפרוטוקולים. אנו מודים גם למתקני הציטומטריה, הגנומיקה והעכבר של הר סיני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMInvitrogen11965-092
0.45 μ מסנני MCorning430625
Amicon מסננים צנטריפוגליים אולטרהMilliporeUFC900324
פניצילין/סטרפטומיציןInvitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
FBSGemini's Benchmark100-106
PBSLife Technologies14190-144
18 גרם מחטיםBD305195
20 גרם מחטיםBD305175
25 גרם מחטיםBD305125
קולגנאז סוג IסיגמאC0130-100MG
TrypLE ExpressInvitrogen12605-010
מדיה Myelocultטכנולוגיות תאי גזעM5300
SCFמו"פ & D Systems455-MC
Flt3LR & D Systems427-FL
IL-3מו"פ D Systems403-ML
IL-6מו"פ D Systems406-ML
TPOR & D Systems488-TO
DoxycyclineSigmaD9891-1G
Polybrene (hexadimethrine bromide)SigmaAL-118
Durapore 0.65 μ מסנני ממברנה MMilliporeDVPP14250
מדיה מתיל צלולוזטכנולוגיות תאי גזעMethocult M3434
תאי גזעהידרוקורטיזון07904
C57BL/6 עכבריםמעבדת ג'קסון000664
ג'לטיןסיגמאG-1890 100 גרם
pFUW-tetOAddgeneפלסמיד #20321
Gata2OrigeneMR226728
Gfi1bOrigeneMR204861
cFos Addgeneפלסמיד #19259
Etv6OrigeneMR207053
psPAX2AddgenePlasmid #12260
pMD2.GAddgenePlasmid #12259
CaCl2SigmaC5670-100g
FUW-M2rtTAAddgenePlasmid #20342
35 מ"מ x 10 מ"מ תרבית כליםתרמו סיינטיפיק171099
טכנולוגיות

מקורות

  1. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  2. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  3. Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
  4. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  5. Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
  6. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  7. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  8. Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
  9. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
  10. Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
  11. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
  12. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  13. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
  14. Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
  15. Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
  16. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  18. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  19. Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
  20. Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
  21. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  22. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  23. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  24. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
  25. Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
  26. Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
  27. Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
  28. Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
  29. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  30. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. "Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  31. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372(2014).
  32. Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
  33. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Gata2 Gfi1b cFos Etv6CD34 tTA TetO H2BGFPCFUDOX
תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.