לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

Cytometry מאפשרת מדידה בו זמנית של הנוגדן מכוון מרובים ברמה תא בודד באוכלוסיות גדולות של תאים. בשנת cytometry זרימת קרינה המבוססת מסורתית, מספר הפרמטרים שניתן לכמת מוגבל על ידי חפיפה ספקטרלית בין ספקטרום הפליטה של ​​fluorophores המרובה, אשר דורש חישובי פיצוי מורכבים יותר ויותר ככל שגדל מספר פרמטרים. מגבלות אלה מטופלות על ידי המוני cytometry, שבו נוגדנים כבדים מצומדות מתכת מזוהות לכמת ידי זמן של ספקטרומטריית מסת טיסה (TOF) כדי להרחיב את מספר הפרמטרים מאוד שנאספו בו זמנית להניב פרופיל חלבון-שפע ממדי גבוה עבור כל תא יחיד.

הבנה בסיסית של פעולתו של המסה cytometry המכשיר מועילה המשתמש ועלולה להיות חיוני לפתרון בעיות. לקבלת תיאור מפורט יותר של כוונון והפעלה מכונית cytometry ההמונית,לראות את כתב יד ¹ קשור. בקצרה, מדגם התא מסומן עם פאנל של נוגדנים מצומדות מתכת מיקוד סמנים פני התא, חלבונים ציטופלסמית, חלבונים גרעיניים, חלבונים או אפיטופים אחרים הנכנס הכרומטין של עניין (איור 1i). תאי שכותרתו נטענים על גבי המכונה, או אחד בכל פעם על ידי הזרקה ידנית או באמצעות autosampler כי דגימות צלחת 96-היטב. תאי טעון מוזרקים דרך nebulizer, אשר מייצר נתזי טיפות נוזל בבועה התאים (איור 1ii). ספריי זה ממוקמים כך התאים מיוננים על ידי לפיד פלזמת ארגון. יינון זה יוצר ענן חלקיקים מורכבים מכל אטומי המרכיבים של כל תא (1iii איור). כמו ענן החלקיקים הזה נוסע הגלאי, אטומי מסה אטומיים נמוכים מופרדים מן יוני מסה הגבוהים על ידי מסנן מונית quadrupole. יוני המסה הגבוהים הנותרים ממשיכים הגלאי, שבו abund אהה של כל איזוטופ מכמתים (1iv איור). הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי הגלאי, מנותחים על ידי תוכנת מכשיר cytometry ההמונית לזהות אירועי תא. עבור כל אירוע התא מזוהה, האות זוהה בכל ערוץ כימות הציל לקובץ .fcs פלט. ערוצי המונית המשמשים לאיתור הנוגדנים כבד מתכת מצומדות להפגין חפיפה ספקטרלית מינימאלית, אשר נעה בין 0-4% עם רוב התרומות מתחת 1%. בגלל הצטלבות נמוכה זו בין ערוצים, זה בדרך כלל לא נחוץ להפוך את הנתונים עם מטריצת פיצויים לפני הניתוח ^2. עם זאת, יש להיזהר בעת העיצוב של לוח ניסיוני של נוגדנים כדי להבטיח כי נוגדן עם אפיטופ גבוה שפע אינו מוקצה ערוץ מסה שתורם אות לערוץ מוקצה נוגדנים נמוך שפע, הכיוון שהדבר עלול ליצור אוכלוסייה גבוהה באופן מלאכותי באפיק קבלת תרומת האות.

תחת = "jove_content"> ההכנה המדויקת של דגימות עבור המוני cytometry ניתוח התלות גבוהה סוגי דגימות נאספות ואת ההשערה הניסיונית נבדקת. אנו מספקים דוגמאות של שני פרוטוקולי ניקיון סוגים שונים של תאים (תאי גזע עובריים אנושיים) תאים ראשוניים (לבודד תאי האפיתל גידול עכבר שד). כאשר מתחיל מחקר cytometry ההמוני, מומלץ לבצע תחילה ניסוי פיילוט קטן כדי להבטיח כי כל הפרוטוקולים והנוגדנים להיות מנוצלים פועלים כראוי בידי החוקר. הדבר נכון במיוחד כאשר חיוני נוגדנים מצומדות מותאם אישית כדי לשמש, כמו תגובת ההפחתה החלקית במהלך נטיית הנוגדן בעל הפוטנציאל לשבש זיקת נוגדן; ולכן, כל נוגדן מותאם אישית צריך להיות תוקף אמפירי כדי להבטיח דיוק הנתונים. שיקולים נוספים כוללים קביעה אם נוגדנים פני תא כדי להיות בשימוש assay יכירו האפיטופים שלהם לאחר קיבוע או אם הם neאד להיות מיושם לחיות תאים. חלק הקיבעון יכול למנוע צביעה נכונה עם נוגדנים פני תא כידוע להתרחש עם פפטיד-MHC מכתים ^{3, 4.} Performing מכתים נוגדן תא השטח על תאים חיים עשוי להיות נחוץ עבור נוגדנים מסוימים, אבל זה מונע את האפשרות של barcoding לפני תיוג נוגדן כמו שיטות barcoding ביותר מבוצעות לאחר קיבוע ⁵ למרות barcoding מבוססי נוגדנים ^{6, 7} הוא חריג.

בעת קביעת מספר התאים להיות מוכן לניתוח, חשוב לדעת כי רק חלק קטן של התאים הועמסו על המכונית יאותר ולהפיק נתונים. הפסד זה נובע בעיקר מחוסר יעילות כאשר nebulizer תרסיסים מדגם בבית לפיד. הפסד האחוז המדויק תלוי המסה cytometry התקנת מכונית וסוג התא אבל יכול לנוע בין 50-85% וצריך להיותבחשבון בעת ​​תכנון הניסוי. פרוטוקול זה ממוטב עבור 2x10 ⁶ תאים לדגימה אך ניתן להתאים לעיבוד גודל מדגם קטן או גדול. פרוטוקול זה יכול לשמש עם שינויים מינימליים עבור גודל מדגם מ 1 x 10 ⁶ 4 x 10 ^6, אולם חשוב כי גודל המדגם להישמר עקבי במסגרת ניסוי. שינויים במספר תאים יכולים להשפיע על עוצמת מכתים barcoding נוגדנים צריך להישמר עקבי בערך ברחבי דגימות כדי להשוות ישירות.

כמה נהלים, כגון תיוג תא מת תיוג DNA, צריכות להתבצע הרוב המכריע, אם כל העיצובים הניסיונות לא. התיוג של תאים מתים בניסויי ניתוח רק סמני משטח יכול להיות מושג באמצעות Rh103, אבל Rh103 יש להימנע עבור ניסויים שבם permeabilization נדרש כפי שהיא גורמת להפסד מכתים. בניסויים מעורבים permeabilization, מומלץ לנצל cisplatin

דגימות ברקודים יכולות להפחית את צריכת נוגדן, להקטין זמן רכישה ולחסל מדגם ל-מדגם ⁹ השתנות. תהליך barcoding כרוך החלת דוגמת קוד ספציפי וייחודי לכל התאים, אשר משמש להקצות לכל התא מדגם של מקורו. לאחר barcoding דגימות עשוי להיות ונקווה לפני מכתים נוגדן, תהליך המבטיח את כל דגימות מגואלות באותה מידה. כדי למזער שגיאות ניסיון, זה נבון ברקוד ומכניס כל דגימות כי יש להשוות ישירות זה לזה. נכון לעכשיו קיימות מספר שיטות barcoding דגימות עבור המוני ניתוח cytometry ^{5, 6, 7,} שניים מהם מוצגים כאן (ראו להלן).

עם Reagen זמין כרגעTS אפשר לכמת את השפע של 38 הנוגדן מכוון, לזהות תאים S-שלב ^10, להבחין בין תאים חיים ומתים ⁸ ולמדוד רמות הסלולר של היפוקסיה ¹¹ בניסוי מרובב של דגימות מרובות. יכולת זו כדי לאסוף נתונים סלולריים גבוה פרמטר אחד עבור אוכלוסיות תאים גדולות מאפשרת פרופיל משופר של אוכלוסיות תאים הטרוגנית מאוד וכבר הפיקה מספר תובנה ביולוגיות רומן ^{12, 13, 14, 15, 16.} זיקוק הנתונים מורכבים והתוצאה למידע לפירוש דרש שימוש באלגוריתמים חישוביים כולל עץ פורש מהלך האירועים מנורמל צפיפות (ספייד) ¹⁷ ו viSNE ^18.

מאמר זה מציג נגישסקירה של איך לעצב ולבצע מסה cytometry הניסוי ומציג ניתוח בסיסי של המוני cytometry נתונים.

קציר Cell 1.

1. תאי קצירת רקמות עיקריות
   הערה: התהליך המתואר עבור תאי קציר מרקמות עיקריות הוא ישימה במיוחד רקמת גידול עכבר שד לא יכולה להיות רלוונטי כמו לרקמות עיקריות ממקורות אחרים.
   1. הכן חיץ העיכול על ידי המסת hyaluronidase 5 מ"ג ו 30 מ"ג collagenase ב 10 מ"ל התקשורת DMEM / F12 לגרם של הרקמה להיות מעובד. סנן לעקר חיץ העיכול.
   2. לבודד עיקרי בגידול בלוטת חלב מן משקל גידול עכבר ולהקליט.
   3. לרכך רקמות עם # 10 אזמל דקות לפחות 5.
   4. הוספת רקמת טחון נפח מתאים של חיץ העיכול (10 מ"ל חיץ לגרם של רקמות).
   5. Shake רקמות טחון ב חיץ העיכול בבית 100 סל"ד במשך 1-3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
   6. השג ההשעיה תא בודד על ידי העברת תאים באמצעות 0.4 מיקרומטר לסנן לתוך צינור 50 מ"ל.
   7. תאי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 °; ג. למזוג או בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה.
   8. גלולה גלולה ב 4 מ"ל DMEM / F12 ולהעביר 5 מ"ל עגול צינור התחתונה.
2. קציר תאים בתרבית רקמה
   1. צלחת או בקבוק Wash של תאים חסידים עם סידן פוספט ומגנזיום חינם בופר (PBS) בטמפרטורת חדר.
      הערה: הטכניקה המתוארת עבור תאי קציר היא ישימה במיוחד חסיד תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) תאי תרבות. עם זאת, עד סוף הפרוטוקול המתואר ישים באופן נרחב שורות תאים בתרבית אחרות, קווים שאינם חסידים תאים ראשוניים.
   2. להוסיף התחממתי (37 ° C) טריפסין או מגיבים עיכול אנזימטי אחר אופטימיזציה להשגת השעית תא בודדת מן התאים החסידים. עקוב פרוטוקול של היצרן.
      הערה: טריפסין ריאגנטים דיסוציאציה האנזימטית אחרים יש פוטנציאל להשפיע על סמנים תאיים.
   3. דגירה את הצלחת על 37° C במשך 2-5 דקות כדי לנתק תאים. עבור תרבויות confluency גבוהות, לטפוח בעדינות את הצלחת כדי לעזור לנתק את התאים.
   4. העבר תאים מנותקת לחלוטין מן הצלחת לתוך צינור תחתית עגולה 5 מ"ל בעדינות pipet באמצעות pipet 1 מ"ל לנתק תאים.
      הערה: לעיבוד כמויות גדולות של דגימות כל הצעדים שניתן לבצע לחלופין בתוך צלחת תחתית 96 גם עגולה. לעיבוד דגימות בפורמט 96 היטב כל השטיפות יכולות להתבצע בהיקף של 250 μL. הנפחים כמתוארים בשלבים אחרים יכולים להיות מותאמים כך הנפח הכולל אינו עולה על 300 μL.
   5. להרוות מגיב עיכול אנזימטי עם חיץ לשטוף נפח שווה (BSA 0.5% ו אזיד הנתרן 0.02% ב PBS).
      הערה: אזיד הנתרן הוא חומר כימי מסוכן. אמצעי בטיחות פרופר יש להקפיד על ההכנה והטיפול שלה.
   6. תאי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. למזוג או בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה.
   7. גלולתאים 1 מ"ל התקשורת בסרום חינם.
   8. ספירת תאים על ידי העברת 10 μL של ההשעיה התא צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. לדלל aliquot כדי יחס ידוע בכחול והעברת trypan על hemocytometer או מערכת ספירת תאים אוטומטיות.
3. תיוג של אוכלוסיית S-שלב
   הערה: אם תיוג S-שלב הוא לא להתבצע להמשיך לבלום 1.4.
   1. הכן 1 מ"ל של 10 מיקרומטר 5-Iodo-2'-deoxyuridine (IdU) ב F12 DMEM חופשי בסרום או מדיה מתאימה אחרת עבור כל 2 x 10 ⁶ תאים להיות מנותח.
   2. הוספת 500 μL של 10 מיקרומטר IdU תקשורת חופשית בסרום לכל 2 x 10 ⁶ תאים.
      הערה: בעוד תיוג IdU יכול להתבצע המדיה המכילה סרום, חלבון חינם יגיב עם ציספלטין, מניעת תיוג תקין של תאים מתים. אם המדיה המכילה סרום משמש במהלך IdU תיוג צעד לשטוף נוסף הוא תקשורת חופשית בסרום יש צורך להסיר חלבונים בסרום לפני חי cisplatin / מת STAining.
   3. בעדינות להשעות כדורי עם 1 מ"ל pipet.
   4. דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה.
4. תיוג Live / Dead
   1. עבור כל דגימה להכין 500 μL של 50 מיקרומטר cisplatin ב DMEM-F12 או המדיה המתאימה לסוג תא חופשי בסרום.
      הערה: אם תיוג של האוכלוסייה S-שלב ידי IdU אינו להתבצע, דגימות resuspend בריכוז של 4 x 10 ⁶ תאים / מ"ל. Resuspending התאים לפני הוספת cisplatin מאפשר ערבוב מהיר של פתרונות תיוג חי / מת אחיד.
   2. הוספת 500 μL של 50 cisplatin מיקרומטר לכל 2 x 10 ⁶ תאים ל דגימות.
   3. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 1 דקות על שייקר מסלולית עם ערבוב מתמיד.
   4. להרוות ציספלטין עם חיץ נפח לשטוף שווה.
   5. תאי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב RT. למזוג או בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה.
   6. Wash דגימות פעמייםעם 500 חיץ לשטוף μL להסיר cisplatin עודף.
   7. לשטוף דגימות פעמיים עם 500 μL PBS להסיר עודף חלבון.
5. קיבוע לדוגמא
   1. מדגם גלול ב 500 μL PBS.
   2. הוספת נפח שווה של 4% PFA ב PBS ריכוז סופי של 2%; פיפטה לערבב.
      הערה: כן 4% PFA טריים אבקה, כדי להתאים את pH 6.9 ולהעביר דרך פילטר 0.44 מיקרומטר. 4% PFA ב PBS ניתן לאחסן 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. הימנע פורמלין premade מסופק אמפולות, אלא אם כן נבדקו באופן ספציפי, כפי שהוא לעתים קרובות מכיל מזהמי מתכת עלולות להפריע ערוצי מסה הנמדדים. ריכוז נמוך של PFA עשוי להיות מספיק ולעזור כדי למזער את ההשפעה של קיבוע על נוגדן מחייב אבל צריך להיבדק באופן אמפירי.
   3. דגירה של 15 דקות ב RT על שייקר מסלולית עם ערבוב מתמיד.
   4. תאי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 4 °. למזוג או בזהירות לשאוב Wi supernatantthout להפריע גלולה.
   5. לשטוף דגימות עם PBS להסיר פתרון PFA.
      הערה: בשלב זה דגימות ניתן לאחסן בקצרה על 4 מעלות צלזיוס. אחסון ממושך ב 4 ° C עלול לגרום לזילות של המדגם ירד מכתים.

2. ברקודים

הערה: בעוד המתודולוגיה ניצול cisplatin monoisotopic barcoding barcoding ופלדיום מוצג בו זמנית, או יכול לשמש באופן עצמאי או להימנע לחלוטין אם לא נדרש על ידי ניסוי.

1. Monoisotopic ציספלטין ברקודים
   הערה: מאחר barcoding cisplatin ו- cisplatin חי / מכתים המלח להסתמך על חופפים ערוצי יש להקפיד על מנת להבטיח כי cisplatin רקע חי / מכתים המלח בתאים חיים ממוזער מכיוון שהדבר עלול להפריע לדיוק של ברקוד ציספלטין.
   1. לדלל 1 מ"מ פתרונות המניות monoisotopic cisplatin כדי 200 מיקרומטר PBS.
   2. לקבלת דוארברקוד ייחודי cisplatin ACH להכין צינור 1.5 מ"ל עם 500 μl PBS לכל 2 x 10 ⁶ תאים קבלת ברקוד.
   3. כדי להכין כל ברקוד ייחודי להוסיף כל cisplatin monoisotopic החלים לריכוז סופי של 200 ננומטר.
   4. תאים גלולים ב 500 μl של PBS לכל 2 x 10 ⁶ תאים.
   5. הוסף נפח שווה של הפתרון ברקוד המקביל מדגם זה.
   6. דגירה דגימות ב RT עבור 5 דקות על שייקר מסלולית עם ערבוב מתמיד.
   7. להרוות ציספלטין עם חיץ נפח לשטוף שווה.
   8. תאי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 4 °. למזוג או בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה.
   9. לשטוף דגימות פעמיים עם 500 μL חיץ לשטוף כדי להסיר cisplatin עודף.
2. ברקודים פלדיום
   הערה: ריאגנטים barcoding פלדיום יכולים להיות מוכן ⁵ או לרכוש מסחרי.
   1. חלוף חלקיתpermeabilization ¹⁹
      הערה: barcoding קלאציה פלדיום דורש permeabilization חלקית עבור ריאגנטים לעבור דרך קרום התא וחסונה תווית התא.
      1. לשטוף דגימות עם 500 μL PBS.
      2. לשטוף דגימות עם 500 μL PBS בתוספת 0.02% saponin.
      3. גלולה גלולה בנפח שיורית.
   2. החל barcoding פלדיום.
      1. לדלל המניות 100x של ריאגנט barcoding פלדיום ב 1 מ"ל קר כקרח PBS בתוספת 0.02% saponin.
      2. במהירות להוסיף ריאגנט barcoding מדולל מדגם resuspended.
      3. דגירה של 15 דקות ב RT על שייקר מסלולית ב עם ערבוב מתמיד.
      4. לשטוף דגימות פעמיים עם 500 μL לשטוף חיץ.

Cell Surface 3. מכתים

הערה: מכתים פני התא יכול להתבצע על תאים חיים לפני קיבוע. זה עשוי להיות נחוץ עבור נוגדנים כי לאבד זיקה their אפיטופ לאחר קיבוע. כמה דגימות תאים עשויים להפיק תועלת חסימה נוספת, כגון חסימת Fc עבור לויקוציטים, לפני תיוג נוגדן כדי להפחית את הרקע. חסימה אופטימלית צריך להיקבע באופן אמפירי סוג מדגם ספציפי.

1. כן לוח מכתים נוגדן תא שטח.
   1. מערבבים 0.5 μL, או אמפירית כמות נחושה, של כל נוגדן 0.5 מ"ג / מ"ל ​​תא השטח לדגימה לתוך צינור מ"ל 1.5. הוסף חוצץ כביסה במידת הצורך להביא נפח עד 10 μL לדגימה. מערבבים ידי pipetting.
      הערה: לקבוע עובדת דילול לכל נוגדן לפני להתנסות באופן אמפירי על ידי ניסוי טיטרציה.
   2. בריכת נוגדן פני התא להתחלק שווה בשווה לתוך צינור אחד 1.5 מ"ל עבור כל דגימה להיות מוכתם.
   3. הכן 500 μl של חיץ לשטוף בצינור 1.5 מ"ל עבור כל דגימה.
2. החל מכתים פני תא דגימות בנפח מנורמל עבור כל הדגימות.
   הערה: כדי ENSתיוג יור נוגדן עקב דגימות מרובות הוא חיוני כדי לשלוט בעוצמת קול המדגם וריכוז נוגדנים בזהירות. השלבים הבאים שואפים להשיג עקביות זה על ידי ההבטחה כי הכרכים המדגמים הסופיים לאחר הנוגדן נוסף הם אחידים.
   1. תאי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 4 °. למזוג או בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה.
   2. עם סט פיפטה 200 μL כדי 50 μL, להסיר פתרון נותר מן גלולת מדגם והעברת צינור של ברכת נוגדן תא שטח aliquoted.
   3. פיפטה את כל הנוזל בצינור aliquot ללא ציור אוויר אל קצה פיפטה.
   4. תוך כדי לחיצה על בוכנת פיפטה להימנע ציור אוויר להזיז את הקצה לתוך צינור מוכן של 500 μL חיץ לשטוף ולשחרר את הבוכנה.
   5. להוסיף בחזרה את התוכן של קצה פיפטה המדגם מחדש להשעות המדגם בנוזל עם pipetting עדין.
   6. דגירת הדגימות עבור 1שעות ב RT על שייקר מסלולית עם ערבוב מתמיד.
   7. לשטוף דגימות פעמים עם 500 μL חיץ לשטוף כדי להבטיח כי כל הנוגדן החופשי הוא נשטף.
   8. לשטוף דגימות עם 500 μL PBS.
   9. Resuspend התא גלולה ב 500 μl PBS.
   10. הוספת נפח שווה של 4% PFA ב PBS; פיפטה לערבב.
   11. דגירה של 10 דקות על שייקר מסלולית.

4. תא Permeabilization ו תאיים מכתים

1. Cell permeabilization
   1. תאי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 4 °. למזוג או בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה.
   2. Resuspend תאים בנפח שיורית ידי vortexing בעדינות עד הגלולה הוא ניתק.
      הערה: אי לנתק תאים לפני הוספת MeOH יגרום תאים הדבקים יחד והפקת סרט דק אשר יוביל לאובדן מדגם חלקי.
   3. מיד להוסיף 1 מ"ל של 100% MeOH לכל 2 x 10 ^{6 <}/ Sup> תאים בעדינות פיפטה לערבב.
      הערה: שיטות permeabilization אחרות יכולה להוות תחליף ל- MeOH ו עשוי להיות נחוץ כדי להשיג permeabilization האופטימלי עבור סוגי תאים מסוימים. עבור מקורות תא מסוימים saponin 0.1% Triton X-100, 0.2% Tween-20 או 0.1% בפתרון PBS עבור permeabilization עשויה לשמור על שלמות התא טוב יותר תוך מתן permeabilization עקבית.
   4. דגירה דגימות עבור h 1 לפחות או עד למקסימום של 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס למשך permeabilization.
      הערה: בשלב זה דגימות ב MeOH ניתן לאחסן עד 1 חודש -80 מעלות צלזיוס.
   5. תאי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 4 °. למזוג או בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה.
   6. להוסיף 1 מ"ל של חיץ הכביסה עבור כל מ"ל MeOH המשמש permeabilize המדגם. בעדינות resuspend גלולה התא.
   7. לשטוף מדגם פעמיים עם 500 μL לשטוף חיץ.
2. כן לוח מכתים נוגדן תאי.
   1. מערבבים 0.5 μL, או אמפירית כמות נחושה, של כל נוגדן 0.5 מ"ג / מ"ל ​​תאיים לדגימה לתוך צינור מ"ל 1.5. הוסף חוצץ כביסה במידת הצורך להביא נפח עד 10 μL לדגימה. מערבבים ידי pipetting.
   2. פיצול ברכת נוגדן תאית באופן שווה לתוך צינור אחד 1.5 מיליליטר עבור כל דגימה.
   3. הכן 500 μL של חיץ לשטוף בצינור 1.5 מ"ל עבור כל דגימה.
3. החל מכתים תאי כדי דגימות בנפח מנורמל עבור כל הדגימות.
   הערה: כדי להבטיח תיוג נוגדן עקב דגימות מרובות הוא חיוני כדי לשלוט בעוצמת הקול מדגם בזהירות וריכוז נוגדנים.
   1. תאי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 4 °. למזוג או בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה.
   2. עם 200 פיפטה μL מוגדר 50 μL יסירו הנותרים פתרון ממדגם גלולה ו והעברת צינור של הבריכה נוגדן תא השטח aliquoted.
   3. פִּיפֵּטָהעד שכל הנוזל בצינור aliquot ללא ציור אוויר אל קצה פיפטה.
   4. תוך כדי לחיצה על בוכנת פיפטה להימנע ציור אוויר להזיז את הקצה לתוך צינור מוכן של 500 μL חיץ לשטוף ולשחרר את הבוכנה, עריכת חיץ לשטוף עבור נפח דגימה סך של 50 μL.
   5. להוסיף בחזרה את התוכן של קצה פיפטה המדגם מחדש להשעות המדגם בנוזל עם pipetting עדין.
   6. דגירה דגימות עבור שעה 1 ב RT על שייקר מסלולית עם ערבוב מתמיד.
   7. לשטוף דגימות פעמיים עם 500 μL לשטוף חיץ.
   8. לשטוף דגימות עם 500 μL PBS.

5. תיוג אירידיום

1. דגימות תקן
   1. דגימות גלולות ב 500 μL של PBS.
   2. הוספת 500 μL של 4% PFA ב PBS.
   3. דגירה למשך תקופה מינימלית של 15 דקות ב RT על שייקר מסלולית עם ערבוב מתמיד.
2. החל תיוג אירידיום של דנ"א
   1. הוספת 500 μL 62.5 ננומטר אירידיום פתרון PFA כדי דגימות.
      הערה: בניסויים באמצעות תאי permeabilized, לדלל את מניות 500x Ir191 / 193 עבור דילול סופי של 1: 2000, כדי למנוע overstaining.
   2. דגירה של 15 דקות ב RT על שייקר מסלולית עם ערבוב מתמיד.
      הערה: אם ביצוע barcoding cisplatin monoisotopic לא לדגור דגימות עם אירידיום יותר מ 15 דקות מאז אותות Ir193 החזקים יכולים לתרום ערוץ Pt194 מונית ולהשפיע לרעה על איכות barcoding.
   3. תאי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 4 °. למזוג או בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה.
   4. לשטוף דגימות פעמיים עם 500 0.1% BSA μL במים deionized מסונן.
      הערה: לאחר מוכנים אנו ממליצים להפיק דגימות בתוך 24 h במידת האפשר. דגימות Prepared עשויות להיות מאוחסנות לטווח קצר ב 4 ° C,אבל יש להיזהר כדי למנוע השפלה. במידת האפשר שוטף הסופית צריכה להתבצע במים deionized מסונן ללא BSA כמו זה יקטין את התצהיר על קונוסים קאמרית סמפלר ספריי של המכונה אשר יקטין ניקוי מכשיר. עבור hESCs יש צורך לבצע שטיפות אלה בעוד כולל BSA כדי למנוע אובדן מדגם יידבק אל פני שטח הצינור.

6. הכינו דגימות עבור רכישה

1. ספירת תאים
   1. תאים גלולים ב 500 BSA 0.1% μL במי deionized מסוננים ולסנן לתוך צינור טרי באמצעות כובע מסנן 35 מיקרומטר תא.
      הערה: הורדת רמת ה- BSA עבור השטיפה הסופית מקטינה את השאריות שהשאירו על nebulizer cytometry ההמוני. תאים שאינם חסידים ניתן לכבס והשעיה במי deionized מסונן.
   2. ספירת תאים על ידי העברת 10 μL של השעית תא צינור microcentrifuge. לדלל aliquot כדי יחס ידועtrypan כחול (כדי לסייע עם להדמית תא) ומעביר hemocytometer או מערכת ספירת תאים אוטומטית.
   3. תאי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 4 °. למזוג או בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה.
2. כן ודגימות עומס
   1. כדי להכין חרוזים כיול להסיר מן המקרר לנער במרץ כדי להשעות.
   2. אם פועל דגימות באמצעות מסה cytometry autosampler, להוסיף 50 μL של חרוזים כיול היטב בכל צלחת מדגם מכן להוסיף את המספר הרצוי של תאים להיות מנותח. אם דגימות פועלות על ידי הזרקה ידנית להוסיף 50 μL של חרוזי כיול לדגום, לדלל מדגם במי deionized מסונן, לערבב היטב מדגם עומס ליציאת הזרקת מדגם cytometry המוני. דילול המדגם המתאים עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא להיות מנותחת, אלא דילול של 10 ⁶ הוא בדרך כלל ¹ מתאים.

הפרוטוקול המובא כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב במגוון רחב של דגימות תאים בתרבית ראשוניות עם שינויים קלים בלבד. בהתאם לדרישות של הניסוי, זה יכול להתבצע באופן מודולרי כאשר אלמנטים מסוימים, כגון מכתים barcoding או תא שטח, אינם נחוצים. מנוצל במלואו פרוטוקול זה מאפשר הכנת ההמונית מרובבת cytometry הדגימות שכותרתו עבור הדרת תאים מתה, זיהוי אוכלוסיית S-שלב ומוכתם עבור כימות של עד 38 נוגדן מכוון.

תוצאות צפויות מיוצרות על ידי השיטות המפורטים בפרוטוקול זה (איור 2) מתוארות באיור 3. לאחר איסוף נתונים, נורמליזציה של עוצמת אות המבוססת על עוצמת חרוז הכיול יכולה להתבצע בתוך תוכנת cytometry ההמונית. בעקבות נורמליזציה, proce נתונים ראשונייםssing להסיר חרוזי כיול, שער על תאים בודדים ולהסיר תאים מתים יכול להתבצע באופן ידני באמצעות כל תוכנה מסוגלת לנתח את זרימת cytometry נתונים. הסרת חרוזים כיול יכול להתבצע באופן ידני על ידי gating על האוכלוסייה Ir191 + Ce140- (איור 3A) או עם אלגוריתם המבוסס MATLAB 20. אירועי תא בודד (קו מתאר שחור, איור 3B) ניתן מגודרים תוך הסרת multiplets פסולת התא, על ידי gating על עלילת biaxial של Ir193 ואת אורך אירוע (איור 3B). תיוג ציספלטין של תאים מתים יכול להיות מנוצל כדי לכמת את כמות המוות של תאים; המוצגים הם דוגמאות של דגימות עם (3D איור) נמוך וגבוה (איור 3E) בכמויות של תאים מתים. תאים מתים ניתן להסיר את הנתונים על ידי gating את האוכלוסייה + Pt198 (איור 3E). ברקודים של דגימות, אם עם ריאגנטים ציספלטין או פלדיום monoisotopic, תוצאות הפרדה ברורה של samples בתוך פרמטרי barcoding (איור 3 ג), אשר מאפשרים לתאים יוקצה זהות המדגם המקורית שלהם. שיטות אופציונליות נוספות, כגון תיוג IdU, לאפשר זיהוי של אוכלוסיות ספציפיות, למשל, תאי S-שלב (איור 3F). בעקבות נורמליזציה, debarcoding ו gating הראשוניות, הנתונים הממדיים הגבוהים ניתן לנתח ניצול מגוון של אלגוריתמים כולל ספייד 17 ועוד כמה מיועדים מונית cytometry ניתוח נתונים להדמיה 18. אלגוריתמים כגון ספייד לקחת את הנתונים ממדיים הגבוהים, אשר יכול להיות קשה לפרש שכן לא ניתן דמיינו ישירות במצבו הגבוה ממדי, וליצור מצג ממדי נמוך של הנתונים, אשר הוא יותר מקובל הפרשנות חזותית (האיור 3G).

איור 1: עקרונות יסוד של המוני cytometry המדידה. הכנת דגימות תאים עבור המוני cytometry ניתוח כרוך תאים מכתימים עם נוגדנים שכותרתו עם איזוטופים מתכת בעיקר מסדרת lanthanide אלמנטים. לפי שיטה זו כל נוגדן העלה כנגד אפיטופ ספציפי מסומן עם איזוטופ בעל מסה אטומית ייחודית, כגון Samarium 154. נוגדנים כנגד אפיטופים כי הם משטח, ציטופלסמית, גרעיני או הכרומטין המקומי יכול לשמש באופן פוטנציאלי. תאי תווית מוזרקים והתפזרו ברחבי המונית cytometry nebulizer כמו טיפות תא בודדות שבו הם מיונן על ידי לפיד פלזמת ארגון. ענן החלקיקים כתוצאה משולל האטומים בעלי מסה נמוכות על ידי מסנן מונית quadrupole בעוד השפע של יוני מסה אטומיים גדולים נמדדים על ידי הגלאי. כמות המדודה של כל יון המוני ייחודי התואמת את שפע הסלולר של אפיטופ המטרה של הנוגדן שלו הקשור. בעוד l תיאורטיimit של מעל 100 פרמטרים שאפשר לכמת ניצול מתודולוגיה זו, ריאגנטים לאפשר זיהוי הנוכחיים הזמינים המסחרי של מעל 40 פרמטרים לכל תא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: דיאגרמת זרימת העבודה של הליך ניסיוני וצעדים אופציונליים. תיאור של השלבים העיקריים המעורבים פרוטוקול הכנת תאים עבור cytometry ההמונית. שלבים אופציונליים מסומנים על ידי קופסאות תפוזים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: דוגמא נתונים המופקים מן התחת מ cytometry ניתוח. (א) העלילה Biaxial מראה את הפרדת תאים (גבוה Ir191, נמוך Ce140), חרוזים (נמוך Ir191, גבוה Ce140) ו כפילויות חרוז-תא (גבוה Ir191, גבוה Ce140). (ב) העלילה Biaxial מראה המראה הצפוי של Ir193 vs אורך האירוע. Gating של תאים בודדים אשר מסיר multiplets פסולת התא הסלולרי מוצג. (C) העלילה Biaxial מראה דוגמה לאור שני ערוצי המונית מן barcoding ציספלטין. (D - E) נתוני דוגמא מן cisplatin חי / מכתים מלח עבור דגימות עם אחוז נמוך (D) ואחוז גבוה (E) של תאים מתים. (F) עלילת Biaxial של תאי H9 hESC שכותרתו עם IdU להבחין תאי S-שלב ו נוגדן נגד B1 Cyclin להבחין מחזור תא נוסף. (G אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

למחברים אין מה לחשוף.