מאמר שיטה

עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים

DOI:

10.3791/54397

⸱

13 באוגוסט 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, 2Department of Physics, Fu-Jen Catholic University, 3Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקנים מיקרו-מיוצרים המשולבים עם רכיבים נוזליים מספקים פלטפורמה במבחנה למחקרי תאים המחקים את המיקרו-סביבה in vivo. פיתחנו שבבים מיקרופלואידיים מבוססי פולימתיל-מתאקרילט לחקר תגובות תאיות תחת גירוי מתח כימי/חשמלי/גזירה יחיד או קיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכשירי microfluidic מסוגלים ליצור א-סביבת מייקרו הסלולר מדויקת לשליטה של ​​pH, טמפרטורה, ריכוז מלח, וגירויים פיסיים או כימיים אחרים. הם שימשו בדרך כלל ללימודי תאים במבחנה על ידי מתן in vivo כמו הסביבה. במיוחד, כיצד תאים בתגובה הדרגתית כימי, שדות חשמליים, מדגיש גזירת משך אינטרסים רבים מאז התופעות האלה חשובות להבנת תכונות ופונקציות הסלולר. שבבי microfluidic אלה יכולים להיות עשויים זכוכית מצעים, פרוסות סיליקון, polydimethylsiloxane (PDMS) פולימרים, polymethylmethacrylate (PMMA) מצעים, או פוליאתילן טרפתאלט מצעים (PET). מתוך החומרים הללו, מצעים PMMA הם זולים ניתן לעבד בקלות באמצעות אבלציה לייזר וכתיבה. למרות כמה מכשירים microfluidic עוצבו מפוברק להפקה מרובה, המתקיימות זו בצד זו כימית גירויים חשמליים, אף אחד מהם לא נחשביעיל מספיק בהפחתת חזרות ניסוי, בפרט למטרות הקרנה. בדו"ח זה, אנו מתארים תכנון הייצור שלנו של שני שבבים microfluidic מבוסס PMMA לחקירת תגובות הסלולר, בייצור של מיני חמצן תגובתי ואת הגירה, תחת גירויי מתח יחידים או להתאבדות כימית / חשמל / גזירה. השבב הראשון מייצר חמישה ריכוזים יחסיים של 0, 1/8, 1/2, 7/8 ו -1 באזורי התרבות, יחד עם שיפוע לחץ גזירה מיוצר בתוך כל אחד מהתחומים האלה. השבב השני מייצר אותו הריכוזים יחסיים, אך עם חמש עוצמות שדה חשמלי שונות שנוצרו בתוך כל אזור תרבות. התקנים אלה לא מספקים תאים רק עם תפוקה מדויק, מיקרו-סביבה לשליטה אלא גם להגדיל את ניסיוני מאוד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתאי vivo מוקפים במגוון ביומולקולות כולל תאי מטריקס (ECM), פחמימות, שומנים, ותאים אחרים. הם functionalize ידי להגיב לגירויים מיקרו-סביבתיים כגון אינטראקציות עם ECM ותגובות הדרגתיים הכימי של גורמי גדילה שונים. באופן מסורתי, מחקרים תא במבחנה נערכים במנות התא בתרבות שבה הצריכה של תאים ריאגנטים גדול ותאי לגדול סטטי (לא מחזורי) בסביבה. לאחרונה, מכשירים מפוברקי מייקרו משולב עם רכיבים נוזליים ספקו פלטפורמה חלופית מחקרי תא בצורה לשליטה יותר. מכשירים כאלה מסוגלים ליצור מייקרו-סביבה מדויקת של גירויים כימיים ופיסיים תוך מזעור צריכת תאים ריאגנטים. שבבי microfluidic אלה יכולים להיות עשויים זכוכית מצעים, פרוסות סיליקון, polydimethylsiloxane (PDMS) פולימרים, polymethylmethacrylate מצעים (PMMA), או polyethylenetereפתלטים (PET) מצעים 1-3. מכשירים מבוססי PDMS הם שקופים, ביולוגית, ו חדיר לגזים, מה שהופך אותם מתאימים תרבות מחקרים תא לטווח ארוך. מצעים PMMA ו PET הם זולים וקלים להיות מעובד באמצעות אבלציה לייזר וכתיבה.

מכשירי microfluidic אמורים לספק תאים עם סביבת מייקרו יציבה לשליטה שבו תאים כפופים כימי שונה וגירויים פיסיים. לדוגמה, שבבי microfluidic משמשים ללמוד chemotaxis של התאים. במקום שיטות מסורתיות המעסיקות בוידן קאמרית נימי 4,5 התקני fluidic מיניאטורי אלה יכולים ליצור הדרגתיים כימיים מדויקים ללימוד 1,6,7 ההתנהגויות של התאים. דוגמא נוספת היא ללמוד הגירה כיוונית של התאים תחת שדות חשמליים (EFS) חברת electrotaxis בשם תופעה. התנהגויות Electrotactic של תאים דווחו להיות קשורות עצב התחדשות 8, התפתחות עוברית 9,ו ריפוי פצעים 10,11. מחקרים רבים בוצעו כדי לחקור את electrotaxis של סוגי תאים שונים, כולל תאים סרטניים 12,13, לימפוציטים 14,15, תאי לוקמיה 11, ותאי גזע 16. כמקובל, צלחות פטרי וכוסות כיסוי המשמשים לבניית תאי electrotactic להפקת מקדמי הפליטה 17. Setups פשוט כזה מציב בעיות של אידוי בינוני וב- EFS המדויקת, אבל אפשר להתגבר עליהם על ידי מכשירי microfluidic של סגורה, ערוצי fluidic מוגדרים היטב 12,18,19.

כדי ללמוד תגובות הסלולר באופן שיטתי תחת גירויים כימיים וחשמליים מדויקים, לשליטה, זה יהיה תועלת רבה לפתח מכשירי microfluidic מסוגלים לספק תאים עם גירויים מרובים בו זמנית. לדוגמה, Li et al. דיווחתי על מכשיר microfluidic מבוסס PDMS ליצירת יחיד או להתאבדות הדרגתית כימי וב- EFS 20. קאו et al. devברח שבב microfluidic דומה לווסת את chemotaxis של תאי סרטן הריאות על ידי מקדמי פליטה 6. יתר על כן, להגדיל את התפוקה, ואח הואו. מעוצב מפוברק שבב PMMA מבוסס רב-כפול-חשמל-שדה לספק תאים עם 8 גירויים משולבים שונים, להיות (2 עוצמות EF x 4 ריכוזים כימיים) 21. כדי להגביר עוד יותר את לאורך ולהוסיף גירוי מאמץ הגזירה, פתחנו שני מכשירים microfluidic מבוסס PMMA ללימוד תגובות הסלולר תחת גירויי מתח יחיד או להתאבדות כימית / חשמל / גזירה.

דווח ע"י Lo et al. 22,23, מכשירים אלה מכילים חמישה ערוצי תרבית תאים עצמאיים בכפוף זורם fluidic רציף, מחקו את מערכת דם in vivo. בשנת השבב הראשון (שבב לחץ הכימי-גזירה או שבב CSS), חמישה ריכוזים יחסיים של 0, 1/8, 1/2, 7/8 ו -1 נוצרים באזורי התרבות, ואת שיפוע לחץ גזירה הוא produCED בתוך כל אחד מחמשת תחומי התרבות. השבב השני (השבב בתחום הכימי-חשמלי או שבב CEF), באמצעות סט אחד של אלקטרודות ו -2 משאבות מזרק, חמש עוצמות EF נוצרות בנוסף לחמישה ריכוזים כימיים שונים בתוך אזורי התרבות אלה. חישובים וסימולציות נומריות מבוצעים לעיצוב טוב יותר ולהפעיל את השבבים הללו, ותאי סרטן הריאות בתרבית בתוך מכשירים אלה כפופים גירויים יחידים או coexisting לצפיית תגובותיהם ביחס לייצור (reactive oxygen species ROS), שיעור ההגירה, ואת כיוון הגירה. שבבים אלה הם הפגינו להיות חוסכים זמן, תפוקה גבוהה והתקנים אמינים עבור חוקרת כיצד תאים מגיבים לגירויים שונים מיקרו-סביבתיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שבב עיצוב ו ייצור

  1. צייר דפוסים להיות ablated על מצעי PMMA וקלטות פעמים בצד באמצעות תוכנה מסחרית 24.
    1. כדי לחקור את ההשפעות של ריכוזים כימיים מדגיש גזירה, לצייר צורה "עץ חג המולד" עם רוחב משתנה בסופה בכל אחד מחמשת אזורי התרבות (איור 1A ו -1 B).
    2. כדי לחקור את ההשפעות של ריכוזים כימיים לשדות חשמליים, לצייר צורה "עץ חג המולד" עם שני ערוצי fluidic יותר לגשרי מלח (איור 2 א ו -2).
  2. סופר דפוס בודד על גיליון PMMA או דבק דו-הצד על ידי טעינת הקבצים המתאימים לתוך חרט ליזר CO 2.
    1. הפעל את הלייזר חרט, ולבדוק את החיבור שלה אל המחשב. פתח את התבנית כדי להיות ablated באמצעות תוכנה מסחרית.
    2. הנח גיליון PMMA או o דבק דו-צדדיהעליון n השלב של חרט. התאם את המיקוד של הלייזר CO 2 במידת הצורך באמצעות סרגל כיול הלייזר הוא Ne-גלוי.
    3. טען את התבנית לתוך החרט עבור אבלציה על סדין PMMA או את הקלטת.
    4. תרים את הסדין או קלטת בדוגמת, להסיר חתיכות רצויות, לנקות את השטח עם נושבת חנקן.
      הערה: העובי של גיליון PMMA הוא 1 מ"מ, וכי של הסרט דו צדדי הוא 0.07 מ"מ או 0.22 מ"מ.

2. צ 'יפ אסיפה

  1. עם דבק סופר, לצרף מתאמים אקריליק (= גובה x רוחב x אורך 10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ, בעלת תבריג באמצע) לשכבה העליונה ביותר של השבב על ידי יישור ההברגה ואת ריקים בחלק העליון שכבת -most. מתאמים אלה לשמש בינוני צריכת אוויר / שקעים ומחברי גשר מלח.
  2. הרכב את שבב microfluidic בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית.
  3. הרכב את שבב microfluidic לחץ כימי-גזירה (שבב CSS).
    1. אttach 3 גיליונות של גליונות PMMA scribed באמצעות 2 חתיכות של נייר דו-צדדי scribed. (איור 1A ו -1 B).
    2. להוסיף חתיכה אחת יותר של הקלטת 0.07 מ"מ עובי דו צדדי לתחתית של השבב ולצרף השבב כדי בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ.
    3. שים את שבב הרכבה בתא ואקום למשך לילה.
  4. כדי להרכיב את שבב שדה חשמלי-הכימי (שבב CEF), לצרף את גיליון PMMA לקלטת דו צדדית של עובי = 0.22 מ"מ (איור 2 א ו -2).
    1. צרף בגיליון PMMA scribed קלטת דו צדדית כדי בצלחת 10 ס"מ קוטר פטרי באמצעות פיסת אותו סרט.
  5. השאר את השבב התאסף בתוך מכסה המנוע ולחשוף אותו UV למשך 30 דקות עבור עיקור.
  6. חבר את פתחי הכניסה לשני מזרקים 3 מ"ל באמצעות צינורות פלסטיק ואגוזים חזק האצבע. חבר היציאה לצינור פסולת באמצעות צינור פלסטיק אגוז אצבע חזקה.
    הערה: חיטויכל הצינורות והאגוזים ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לפני השימוש.
  7. לאט לוחץ על המתג על מזרק ממשלת ערוצי fluidic עם PBS. Push מזרקים קדימה ואחורה כדי להסיר בועות.
  8. שים את השבבים בתוך אינקובטור הלילה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2.
    הערה: שני שלבים אלה נועדו לשטוף את השבב ולהסיר כל בועות שנותרו בתוך השבב.
  9. קח את השבב מתוך האינקובטור.
  10. כן גשרי מלח אגרו להפקת שדות חשמליים בשבב CEF.
    1. ממיסים 3% נקודת התכה נמוכה agarose ב בופר פוספט 1x חיץ (PBS) באמצעות מיקרוגל.
    2. להזריק agarose-שלבית פתרון לתוך תעלה גשר מלח להכניס את האלקטרודות לפני הפתרון מבצר.
    3. מניחים אלקטרודות כלוריד-כסף כסף / לתוך אגוזים צינורי.
  11. חבר את המזרקים על משאבות המזרק, וזרימת מדיום התרבות ברציפות (EagleR Modified של Dulbecco17; s בינוני, DMEM) לתוך התעלה fluidic במשך 10 דקות בקצב זרימה של 20 μl / min להחליף PBS.

3. תא הכנה והגדרה ניסיון

הערה: טרום חמים 1x PBS, בינוני תרבות (DMEM בתוספת FBS), טריפסין באמבט מים 37 ° C לפני השימוש.

  1. פלייט 2 x 10 5 סרטן ריאות תאים CL1-5 25,26 בצלחת 10 ס"מ פטרי מסופק עם DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS). דגירה התאים בתוך אינקובטור מתחת לגיל 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס עד מפגש 90%.
  2. לשאוב בינוני לשטוף את התאים פעם עם PBS 1x מחומם מראש. הוסף 2 מ"ל של חיץ טריפסין 0.05% אל התאים לחכות ל -2 עד 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים.
  3. מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל ולהוסיף 6 מ"ל של מדיום תרבות לתוך הצינור. בעדינות להפוך את הצינור לערבוב ולהוציא 5 μl של המדיום המכיל תאים עבור לספור את מספר הסלולרי בתוך hemocytometer.
  4. צנטריפוגה הצינור ב 300 x גרם במשך 5 דקות. להשעות 10 6 תאים ב 1 מ"ל של מדיום תרבות ומקום המדיום המכיל תאים בתוך מזרק 1 מ"ל.
  5. להשרות מדיום התא המכיל לתוך שבב microfluidic משקע ולוודא שהפתרון מפיץ כל דרך החמישה תחומי התרבות. דגירת השבב בתוך אינקובטור מתחת לגיל 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.

4. התקנה ניסיונית

  1. קח את השבב מתוך האינקובטור ולמקם אותו על גבי פח תחמוצת אינדיום שקוף דוד זכוכית (איטו).
    הערה: זכוכית איטו מחוברת בקר פרופורציונלי-נפרד נגזרים (מח"ש) לשמירה על הטמפרטורה ב 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס באמצעות משוב מצמד תרמי הידק בחוזקה בין דוד איטו ואת השבב.
  2. שים את הרכבת שבב-דוד על גבי במת XY ממונעת של מיקרוסקופ הפוכה למעקב אחר נדידת תאים או בשלב XY קבוע שלמיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך למדידת הייצור של ROS.
  3. כדי ליצור ריכוזים כימיים שונים, למלא שני מזרקים עם 5 מיליליטר של תמיסות כימיות של ריכוזים יחסיים 0 ו -1 (מומס מדיום תרבות) ולשאוב אותם לתוך השבב ברמות ספיקה רצויה: בשבב CSS, בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר / min עבור שעה 1; שבב CEF, בקצב זרימה של 20 μl / min שיעור 20 דקות ו זרימה הראשונה של 20 μl / hr לעוד 120 דקות (סה"כ זמן = 2 hr).
  4. בשנת שבב CEF, למעקב אחר נדידת תאים, תכנית במת XY של המיקרוסקופ לחזור לצלם, באמצעות רפלקס דיגיטלית עדשה אחת (DSLR) מצלמה, של שדה מסוים של נוף (FOVs) בתוך אזורי תרבות כל 15 דקות עבור 2 hr.
  5. למדידת הייצור של ROS, השתמש אינדיקטור הקרינה מבוססי diacetate 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce (2'-7'-DCFDA).
    1. הכן את המניות של 2'-7'-DCFDA ב -10 מ"מ di כיתה וביולוגיה מולקולריתsulfoxide מתיל (DMSO). לדלל DCFDA ב DMEM רק ללא בסרום (5 מיקרומטר DMEM). Deacetylase הפוטנציאל יכול להגדיל את אותות רקע ולהפחית את אותות בתאים.
    2. אחרי שעה 1 של גירוי מאמץ הגזירה בשבב CSS או אחרי שעה 2 של גירוי EF בשבב CEF, לשאוב 2'-7'-DCFDA (5 מיקרומטר DMEM) לתוך שבב בקצב זרימה של 20 μl / min 20 דק 'הראשון בקצב זרימה של 20 μl / שעה למשך 20 דקות אחרות. לשטיפה, לשאוב DMEM לתוך השבב בקצב זרימה של 20 μl / שעה למשך 20 דקות.
    3. קח תמונות, באמצעות מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD), של FOVs מסוימים בתוך תחומי תרבות לניתוח בעוצמות פלורסנט.

5. חישובים של ריכוזים כימיים, מאמצי גזירה, ואת שדות חשמליים

  1. בשני שבב CSS ו- שבב CEF, לחשב את הריכוזים הכימיים בחמשת תחומי התרבות. לדוגמה, על ידי הזרקת H 2 O 2 של concentrations 0 ו -200 מיקרומטר מן שני פתחי הכניסה, ריכוזי 0, 25, 100, 175, ו -200 מיקרומטר נוצרים.
    הערה: אם תניח כי כל הנוזלים לפצל זרימה חלקה באופן שווה סביב המזלג, הריכוזים היחסיים בחמשת תחומי התרבות הם 0, 1/8, 1/2, 7/8 ו -1, בהתאמה.
  2. בשנת שבב CSS, לחשב את מאמץ הגזירה (τ) בתוך כל אחד מאזורי התרבות באמצעות figure-protocol-1 27, שם Q הוא קצב זרימת נפח, η היא צמיגות fluidic, h הוא גובה של הערוץ, W הוא רוחב של הערוץ.
    הערה: על ידי הגדרת Q = 0.3 מ"ל / דקה בכל מפרצון (Q = 0.12 מ"ל / דקה בכל אזור התרבות), η = 0.0008 Pa · s עבור המדיום תרבות, h = 1 מ"מ, ו W = 1 ~ 4 מ"מ, מאמץ גזירה מחושב יותר והוא נע בין 0.0048 Pa (אזור רחב 4 מ"מ) כדי 0.0192 Pa (אזור רחב 1 מ"מ).
  3. בשבב CEF, לחשב את כוח EF בתוך כל אחד מאזורי התרבות באמצעות E = I / (EFF σA) (חוק אוהם), כאשר I הוא הזרם החשמלי זורם מעבר לתעלת fluidic, σ היא מוליכות החשמלית של מדיום התרבות, ו- A EFF הוא שטח החתך האפקטיבי של הערוץ.
    הערה: σ שימוש = 1.38 Ω -1 מ -1 עבור המדיום תרבות ו- A EFF = 0.22 מ"מ 2 (width = 1 מ"מ וגובה = 0.22 מ"מ), את הכוח EF מחושב כ- E (mV / מ"מ) = אני ( א) × 3.3 × 10 6.
    1. כפי שניתן לראות בתרשים 2 ד, לטפל המעגל השווה חמישה מעגלים בניתוח קיסרי עם ארבעה (8 + 35 + 8) מגזרים ואחד (5 + 35 + 5) קטע.
      הערה: על ידי ניתוח מעגל מקביל זה על פי חוק מתח קירכהוף ואת חוק אוהם, זרמים הזורמים על פני חמש תרבות הםכמו, אני 1 עד 5 I מלמטה למעלה, מחושבים להיות סביב 0.49 אני (אזור 1), 0.25 אני (אזור 2), 0.13 אני (אזור 3), 0.08 אני (אזור 4), ו 0.05 אני (אזור 5), בהתאמה, כאשר I הוא (DC זרם ישר בסך הכל). עם dc היישומית של 0.157 mA, מקדמי פליטת 254, 130, 67, 41, ו -26 mV / מ"מ נוצרים בתוך החמישה אזורי התרבות.
      הערה: לניתוח חשמל פשוט של רשת microfluidic, בכל מגזרי fluidic נחשבים נגדים עם התנגדות יחסי האורכים שלהם.

6. ניתוח נתונים

הערה: ניתוח הנתונים מתבצע באמצעות תוכנת ImageJ.

  1. נתח את ייצור ROS.
    1. הפעל את תוכנת ImageJ. יש להקליק על "קובץ" → להרחיב לטעון תמונה ניאון כדי להיות מנותח.
    2. יש להקליק על "תמונה" → "סוג" → "16 סיביות" לשנות את imגיל סולם אפור.
    3. לצייר מצולע לצרף לתא. יש להקליק על "נתח" → "מדוד" כדי למדוד את עוצמת פלורסנט הממוצע של התא.
    4. חזור 6.1.3 לאסוף עוצמות מ -50 תאים לפחות של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ולחשב את העוצמת הממוצעת עם סטיית התקן של ממוצע (SEM).
    5. חזור 6.1.1-6.1.4 עבור כל תנאי הניסוי.
  2. לנתח נדידת תאים.
    1. הפעל את תוכנת ImageJ. יש להקליק על "קובץ" → להרחיב לטעון תמונה נלקחה ב זמן = 0 להיות מנותח.
    2. לצייר מצולע לצרף לתא. יש להקליק על "נתח" → "מדוד" למדוד את מרכז המסה של התא (x 1, y 1).
    3. חזור 6.2.1- 6.2.2 למדוד את מרכז המסה של אותו תא כמו (x 2, y 2) מתמונה אחרת לקחת בשלב = t.
    4. חשב את שיעור ההגירה (ב מיקרומטר / hr) שלזה תא figure-protocol-2 .
    5. חזור 6.2.1-6.2.4 לאסוף שיעורי הגירה מ -50 תאים לפחות של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ולחשב את שיעור הגירה ממוצע עם סטיית התקן של הממוצע (SEM).
    6. מ 6.2.2 ו 6.2.3, לחשב את הכוונה על נדידת תאים זה כמו קוסינוס θ או figure-protocol-3 , שבו θ היא הזווית בין הווקטור של EF יישומית (מחיובי לשלילי) ואת הווקטור מההתחלה לתפקיד סוף התא (2G איור).
    7. חזור 6.2.6 לאסוף הכוונת גירה מ -50 תאים לפחות של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ולחשב את הכוונה על ההגירה הממוצעת עם סטיית התקן של ממוצע (SEM).
    8. חשב את שיעור ההגירה הממוצעת עם SEM ואת הכוונת הגירה הממוצעת עם SEM עבור כל תנאי ניסוי.
      הערה: כוונה עלשל +1 עולה כי כל התאים נודדים לעבר הקתודה, וערך -1 מציין כי כל התאים נודדים לעבר האנודה. ההכוונה של קבוצת תאים שנעה באקראי הוא קרוב ל -0.
  3. לנתח יישור נייד.
    1. הפעל את תוכנת ImageJ. יש להקליק על "קובץ" → "פתח" כדי לטעון תמונה להיות מנותח.
    2. פנק את התא כמו אליפסה למתוח קו כדי לציין את הציר הארוך של תא. יש להקליק על "נתח" → "מדוד" למדוד את הזווית β בין הקו בכיוון EF האופקי.
    3. חזור 6.3.2 לאסוף β מ -50 תאים לפחות של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ולחשב ממוצע קוסינוס β עם סטיית התקן של הממוצע (SEM).
    4. חזור 6.3.1-6.3.3 עבור כל תנאי הניסוי.
      הערה: cos β של +1 עולה כי כל התאים ליישר במקביל השימושי EF, וערך 0 מציין כי כל התאים ליישר perpendicularly אל יישומי EF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

את הלחץ הכימי-הגזירה (CSS) צ'יפ

שבב CSS עשוי שלושה גיליונות PMMA, כל אחד מ"מ עובי 1, מצורפים יחד באמצעות שתי קלטות דו צדדיות, כל אחד בעובי 0.07 מ"מ (איור 1 א 'ו -1 B). המבנה "עץ חג המולד" מייצר חמישה ריכוזים יחסיים של 0, 1/8, 1/2, 7/8 ו -1 בחמשת תחומי התרבות. על ידי תכנון באזור התרבות כמשולש, שיפוע לחץ גזירה, בעצמה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שבביים מבוסס PMMA מיוצרים באמצעות אבלציה ליזר וכתיבה שהן זולות ושיטות קלות בהשוואה לשבבים מבוססים PDMS הדורשים ליתוגרפיה רך יותר מסובך. לאחר תכנון שבב microfluidic, הייצור וההרכבה ניתן לעשות זאת בתוך רק 5 דקות. ישנם כמה צעדים קריטיים כי יש לשים לב כדי בביצוע הניסוי. הראשון הוא סוגיית "רכבת". המתאמים צריכים להיות מודבקים כראוי לשכבה העליונה ביותר של השבב. דבק יכול לדלוף לתוך ערוצי fluidic אם יותר מדי מוחל, ונוזל יכול לדלוף החוצה של שבב אם דבק מעט מדי נעשה שימוש. כמו כן, ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה כספית על ידי משרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן תחת חוזה מס. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), No. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun), והפרויקט הלאומי לפיתוח קריירה של אוניברסיטת טייוואן (103R7888) (K. Y. Lo). המחברים מודים גם למרכז לחומרים מתפתחים ומכשירים מתקדמים, האוניברסיטה הלאומית של טייוואן, על השימוש בחדר תרבית התאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)Gibco11965-092מדיום תרבית תאים
טריפסיןGibco25300-054ניתוק תאים מהצלחת
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco10082147מדיום תרבית תאים
10 ס"מ תרבית תאים צלחת פטריNunc150350תרבית תאים
Bright-Line  ציודספירת תאיםZ359629סיגמא
PMMAשבב מיקרופלואידיתמותאם אישית
מותאם אישית שבב מיקרופלואידיתמותאם אישית
0.07/0.22 מ"מ סרט דו צדדי 3M8018/9088שבב מיקרופלואידי,
נקודת התכה נמוכה אגרוזסיגמאA9414גשר מלח
2'-7'-דיכלורודיהידרופלואורסקה דיאצטט,סיגמאD6883מדידת ROS תוך-תאית
תחמוצת פח אינדיום (ITO), זכוכיתMerck300739מחמם
, בקר פרופורציונלי-אינטגרלי-נגזרת JETEC אלקטרוניקה ושות 'TTM-J4-R-ABבקר טמפרטורה
מצמד תרמיTECPELTPK-02Aבקר טמפרטורה
CO2 כותב לייזרכלי לייזר & טכניקס קורפלייצור שבבים מיקרופלואידייםILS2
עידןחדשNE-300שאיבת מדיום וכימיקלים לתוך השבב
ספק כוחמדע עיקרי MP-300Vאספקת זרמים ישרים
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסCKX41ניטור נדידת תאים
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךNikonTS-100ניטור מיגרציה של תאים ואותות פלואורסצנטיים
מצלמת DSLRCanon60Dהקלטת תמונות שדה בהיר 
מצלמת CCDNikonDS-Qi1הקלטת תמונות פלואורסצנט 
דבק סופר3M סקוטש7004הצמדת מתאמים למצעי PMMA
AutoCAD AutodeskInc.תכנון שבבים מיקרופלואידיים
DMSOSigmaD8418המסת DCFDA
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאותכימות עוצמות פלואורסצנטיות ונדידת תאים
של המציטומטר מתאם , , משאבות מזרק

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
  2. Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  4. Adler, J. Chemoreceptors in bacteria. Science. 166, 1588-1597 (1969).
  5. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
  6. Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107(2014).
  7. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
  8. Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
  9. Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
  10. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  11. Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
  12. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  13. Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
  14. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
  15. Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
  16. Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
  17. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
  18. Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117(2012).
  19. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
  20. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  21. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007(2014).
  22. Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15(2016).
  23. Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108(2013).
  24. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
  25. Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
  26. Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
  27. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  28. Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
  29. Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
  30. Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
  31. Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
  32. Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
  33. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PMMA SubstratesLaser AblationChemical GradientsElectrical FieldsReactive Oxygen SpeciesCell MigrationExperimental Throughput

מאמרים קשורים