Method Article

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

DOI:

10.3791/54401

⸱

August 4th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1The School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, 2Neuroscience Research Australia, 3Biomedical Imaging Facility, University of New South Wales Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דו"ח זה מתאר פרוטוקול מעוקב להבהיר ביופסיות עור עכבר בעובי מלאות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון, תאים מתרבים, ו sebocytes ברזולוצית התא הבודדה ב 3D. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של האנטומיה העור והפתולוגיה, ושל פנוטיפים אפידרמיס החריגים קווי עכבר מהונדסים גנטי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העור הוא חיוני להישרדות שלנו. השכבה החיצונית באפידרמיס מורכב האפידרמיס interfollicular, שהנה אפיתל קשקשיים מרובדת המכסה את רוב הגוף שלנו, ואת הנספחים אפידרמיס כגון זקיקי השיער ובלוטות זיעה. האפידרמיס עובר התחדשות לאורך כל החיים בתגובה לפציעה. זו מופעלת כברירת K14 להביע אוכלוסיות תאי גזע / אב אפידרמיס הבזליים כי מוסדרים באופן הדוק על ידי מנגנוני ויסות מספר פעילים בתוך האפידרמיס בין האפידרמיס הדרמיס. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה לברר ביופסיות עור בעובי עכבר מלאות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון K14, Ki67 שכותרתו מתרבה תאים, הנילוס האדום שכותרתו sebocytes, ו DAPI תיוג גרעיני ברזולוצית תא בודדת ב 3D. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת וכימות של האנטומיה העור והפתולוגיה, ושל פנוטיפים אפידרמיס החריגים קווי עכבר מהונדסים גנטי. הפרוטוקול מעוקב הוא הדואר טוב ביותר השיטה זמינה עד כה כדי לחקור אינטראקציות מולקולריות תאיות ב ביופסיות עור בעובי מלאות ברזולוצית תא בודדת.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העור הוא חיוני להישרדות שלנו. הוא מורכב משלושה רבדים עיקריים האפידרמיס החיצוני, בדרמיס ובהיפודרמיס. האפידרמיס היא רקם משובים מאוד. זהו אפיתל מרובדת קשקש, המורכב בעיקר של קרטינוציטים. קרטינוציטים נולדים בשכבת הבסיס, ולעבור כלפי מעלה דרך שכבות suprabasal תוך הבחנה, ובסופו של דבר הם שופכים בשכבת cornified החיצונית כחודש לאחר הלידה שלהם. האפידרמיס מפתחת מספר נספחים כולל זקיקי השיער ובלוטות חלב. זקיקי השיער גם להתחדש באופן מחזורי לאורך כל החיים 1. קיבולת ההתחדשות של האפידרמיס מופעלת על ידי נוכחות של תאי גזע ובתאים נמצאים בשכבת הבסיס של האפידרמיס interfollicular ושיער זקיק 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפט ואתיקה: כל הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים לעקוב אחר ההנחיות של טיפול בבעלי חיים ועדת האתיקה (ACEC) בשעה אוסטרליה UNSW תחת פרוטוקול שאושר ACEC 13 / 64B.

1. הכנה של רקמת עור העכבר השקופה

הערה: כל העכברים השתמשו במחקר זה היו על רקע גנטי C57BL / 6

  1. אוסף של רקמת עור עכבר.
    1. ברוב אנושיות להרדים את העכברים על ידי נקע ב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביופסיות עור גב עובי מלאות של עכברי wildtype מבוגרים הובהרו, מוכתמים נוגדן מחייב סמן keratinocyte הבזליים Keratin14 (K14), גרעינים היו counterstained עם פתרון המכתים DAPI (איור 2 ו סרט 1).

גרעיני DAPI החיוביים נראו ברחבי המדגם (איור 2 א, ג), והכתימו K14 היה גלוי אך ורק שכבת הבסיס חד תא העבה של האפידרמיס interfollicular, ומתאר את בלוטות חלב (הכוכבית שחור), מעטפת ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המנגנונים הרגולטוריים שליטת פיתוח הומאוסטזיס עור נלמדים הנפוץ ביותר 2D באמצעות חתך רקמות מכתים היסטולוגית או תיוג עם נוגדנים, המאפשר רק הערכה מוגבלת של מורפולוגיה עור, אוכלוסיות תאים או ביטוי חלבון. מספר שיטות פותחו כדי לשפר את להדמיה של הארגון המרחבי של תאים וחלבונים ברזולוצית תא בודד ב 3 ממדים ב mounts כל אפידרמיס 10-13. חלקם עם זאת כרוך הפרדת האפידרמיס מן הדרמיס, אשר מבחינה טכנית מאתגרת במיוחד באמצעות העור השעיר, ולעתים קרובות גורם לנזק לרקמות קרע של זקיקי השיער. כמו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים אוסטרליים ביו-משאבים (Garvan מכון, אוסטרליה), מרכז המשאבים הביולוגי (אוסטרליה UNSW) ואת הטיפול בבעלי החיים & ועדת אתיקה לתמיכה בניסויים בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למחקר בריאות הרפואית של אוסטרליה (פרויקט גרנט APP1062720). ד"ר סזאר פ Canales הוא מקבלי מלגה צ'ילה CONICYT-Becas (# 72,101,076). מר באסם Akladios היא כלת פרס לתארים מתקדמים הבינלאומי של אוניברסיטת ידי UNSW אוסטרליה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ' P6418
אתנול 96% (לא מפורק)אספקת כימיהUN1170
נילוס אדוםסיגמא-אולדריץ' 72485-100 מ"ג
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)Roche10236276001
N,N,N',N' -tetrakis (2-הידרוקסיפרופיל) אתילנדיאמיןMerck Millipore821940
פוליאתילן גליקול מונו-p-איזואוקטילפניל אתרMerck Millipore648462
Triton X-100Merck Millipore648462
סוכרוזסיגמא-אולדריץ' S0389
טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) תרכובתרקמה-Tek4583
נוגדן נגד קרטין14CovancePRB-155P
נוגדן נגד Ki67 Abcamab16667
חמור נגד ארנב Alexa 594Life TechnologiesA21207
דימתיל-סולפוקסידסיגמא-אולדריץ' D2650
אוריאהMerck Millipore66612
2,2′,2′ '-ניטרילוטריאתנולMerck Millipore137002
מיקרוסקופ קונפוקליניקון אינסטרומנטס בע"מניקון A1 - מיקרוסקופ
cruZer6 גוזם פניםבראון בראון cruZer6 פנים
נתרן אזידסיגמא-אולדריץ' 
, קונפוקלי438456

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
  2. Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
  3. Hardy, M. H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CUBIC ProtocolSkin Biopsy PreparationProtein Expression VisualizationSingle Cell ResolutionConfocal Microscopy ImagingK14 Protein ExpressionKi67 Proliferating CellsNile Red SebocytesDAPI Nuclear LabelingEpidermal Anatomy Analysis

Related Articles