פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

העור הוא חיוני להישרדות שלנו. הוא מורכב משלושה רבדים עיקריים האפידרמיס החיצוני, בדרמיס ובהיפודרמיס. האפידרמיס היא רקם משובים מאוד. זהו אפיתל מרובדת קשקש, המורכב בעיקר של קרטינוציטים. קרטינוציטים נולדים בשכבת הבסיס, ולעבור כלפי מעלה דרך שכבות suprabasal תוך הבחנה, ובסופו של דבר הם שופכים בשכבת cornified החיצונית כחודש לאחר הלידה שלהם. האפידרמיס מפתחת מספר נספחים כולל זקיקי השיער ובלוטות חלב. זקיקי השיער גם להתחדש באופן מחזורי לאורך כל החיים ^1. קיבולת ההתחדשות של האפידרמיס מופעלת על ידי נוכחות של תאי גזע ובתאים נמצאים בשכבת הבסיס של האפידרמיס interfollicular ושיער זקיק ^2.

מסלולי איתות רבים היו מעורבים בפיתוח אפידרמיס והתחדשות. חלקם מתרחשים בתוךהאפידרמיס בלבד, כגון מסלול הקיפוד. אירועי איתות אחרים מתקיימים בין הדרמיס לאפידרמיס ^3. לדוגמא, אותות Wnt מן הדרמיס נחשבים חשוב להתפתחות זקיק שיער, והם מופרשים על ידי פטמית עורי בתחילת anagen להפעיל התפשטות תאי זקיק שיער בליטת גזע / ובתאים וצמיחת זקיק שיער ^4. חשוב להבין את המנגנונים התאיים ומולקולריים השולטים בהתפתחות אפידרמיס והתחדשות כדי להבין טוב יותר כיצד הם עשויים להיות מוטרדים במחלת עור משובים כגון סרטן העור.

מאמר זה מתאר ליר C, U nobstructed קוקטיילי B גשם ואני maging ו- C ניתוח omputational (מעוקב) פרוטוקול ^5-7 להבהיר הכנות עור הר שלמות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון ב 3 ממדים ברזולוצית תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. השיטה מעוקב כרוכה טבילה של עוררקמות בשני בקבוקים כימיים מבוסס aminoalcohol. פתרונות אלה להתאים את המדדים השבירים במדגם העור, משאירים את הרקמה שקופה והחלבונים ללא פגע, המאפשר immunodetection ברזולוצית תא בודד.

שימוש בפרוטוקול מעוקב זה, הבסיס, מתרבים אוכלוסיות keratinocyte באפידרמיס interfollicular ובסופו של זקיק השיער הם צילמו ב ביופסיות עור בעובי מלא של עכברים wildtype באמצעות אנטי Keratin14 (K14) ונוגדנים אנטי Ki67. בלוטות החלב ב ביופסיות עור wildtype היו דמיינו גם באמצעות מכתים האדום הנילוס. לבסוף, אוכלוסיות keratinocyte הבסיס ב wildtype ו hyperplastic YAP2-5SA-ΔC ביופסיות עור הושוו ^8.

פרוטוקול מעוקב זה מאפשר הערכה חזותית של ביטוי חלבון ביופסיות עור בעובי מלאה ברזולוצית תא בודדת, והוא מהווה כלי חשוב להעריך האנטומיה אפידרמיס ופגמים מורפולוגיים בעור מהונדס גנטיעכברים, וכדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים שבבסיס התפתחות אפידרמיס והתחדשות.

משפט ואתיקה: כל הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים לעקוב אחר ההנחיות של טיפול בבעלי חיים ועדת האתיקה (ACEC) בשעה אוסטרליה UNSW תחת פרוטוקול שאושר ACEC 13 / 64B.

1. הכנה של רקמת עור העכבר השקופה

הערה: כל העכברים השתמשו במחקר זה היו על רקע גנטי C57BL / 6

1. אוסף של רקמת עור עכבר.
   1. ברוב אנושיות להרדים את העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם.
   2. מוציאים בזהירות שערות מאזור העור רלוונטי עם בלטפל גוזם לא לפצוע את העור.
   3. העור לשטוף כדי לטהר עם 70% אתנול בופר פוספט (PBS).
   4. רם עור צוואר גב עם מלקחיים ולעשות חתך במספריים.
   5. לנתח שטח גדול של עור עכבר הגבה (כ 1.5 x 4 סנטימטרים).
   6. שיטוח מטה הדרמיס-צד העור על נייר הסינון, ולעשות לעצמך את הכיוון הקדמי-אחורי של המדגם.
   7. תְלַתמ 'מסנן נייר סביב העור גזור, ומכניסים צינור 15 מ"ל מלא מוכן טרי 4% paraformaldehyde (PFA) פתרון PBS.
   8. תקן עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר, או לילה במקרר ב 4 ° C..
   9. העור 2 לשטוף x 5 דקות ב PBS בצינור 15 מ"ל.
      הערה: להלן (1.1.10 - 1.1.12) הם שלבים אופציונליים עבור אחסון לטווח ארוך של רקמה.
   10. מייבשים את העור גזור ב PBS ככל שעלה ריכוז של אתנול (25%, 50% 70%) בצינור 15 מ"ל במהלך השלבים לשטוף 1-שעות בטמפרטורת החדר.
   11. אחסן העור מיובש באתנול 70% ב PBS בצינור 15 מ"ל ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
   12. 4 שעות לפני סליקה, רעננותם רקמת העור ב- PBS עם ירידה בריכוז של אתנול (70%, 50%, 25%, 0%) בצינור 15 מ"ל במהלך השלבים לשטוף 1-שעות בטמפרטורת החדר.
2. ניקוי ביופסיות עור העכבר
   1. הכן את פתרון סליקת CUBIC1 ידי המסת אוריאת 3.85 גרם ו 3.85 גרם N, N, N ', N'-tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediamine ב 5.38 מ"ל מים מזוקקים על תנור מוגדר 60 - 70 מעלות צלזיוס. השתמש בוחש חם.
   2. להוסיף פוליאתילן גליקול 2.31 גרם האתר מונו-p-isooctylphenyl / טריטון X-100 הפתרון פעם ברור ו התקרר לטמפרטורת החדר.
   3. חותכים את העור של העכבר עם סכין גילוח חד לתוך ביופסיות של ממדים המשוער 0.2 x 0.5 ס"מ, לצלול 5 מ"ל של תמיסת סליקה CUBIC1 בתוך שפופרת 15 מ"ל. כדי לייעל את להדמיה של זקיקי שיער, להבטיח כי הצד הארוך יותר של הביופסיה הוא חתך לאורך כיוון אנטרו-האחורי של המדגם.
   4. מניחים על במה מסתובבת בתנור הכלאה על 37 מעלות צלזיוס.
   5. שנה את פתרון הסליקה לאחר 7 ימים. כן פתרון CUBIC1 הטרי לפני השימוש.
   6. בדוק את השקיפות של הרקמות לאחר 7 ימים. במידת צורך, לעזוב ביופסיות בתמיסת סליקת CUBIC1 עד הרקמה שקופה לחלוטין.
   7. לאחר הביופסיה של העור היא שקופה,להסיר את הפתרון CUBIC1, ולהוסיף 4 מ"ל של 1 × PBS לשטוף את רקמת 4 פעמים במשך 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
   8. שטפו את רקמת העור ב -20% w / סוכרוז נ ב PBS בצינור 15 מ"ל במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
   9. להקפיא את רקמות הרכבת טמפרטורת חיתוך בינוני אופטימלית (אוקטובר) מתחם בתוך שפופרת 15 מיליליטר הלילה במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: צעד זה יגביר את החדירות של הביופסיה לחדירת נוגדנים בשלבים הבאים.

2. Immunofluorescence מכתים

1. להפשיר רקמה 1.2.9) לטמפרטורת החדר במשך 2 - 3 שעות.
2. רקמות לשטוף בצינור 15 מ"ל עם 5 מ"ל של PBS עבור 8 שעות בטמפרטורת החדר כדי להסיר מתחם OCT.
3. העברת ביופסיות לצינור 2 מ"ל, דגירה רקמות ארנב 1 מ"ל אנטי Keratin14 או ארנבת נוגדן אנטי Ki67, הן מדולל 1: 100 ב PBST (PBS + 0.1% Triton-X100) במשך 3 ימים על שייקר בתוך 37 ° בתנור C.
4. ביופסיות מעבירים 15 מיליליטר צינור,nd לשטוף רקמות 4 פעמים במשך 6 שעות ב 5 מ"ל של PBST על שייקר בתנור 37 מעלות צלזיוס.
5. העברת ביופסיות לצינור 2 מ"ל, להוסיף 1 מ"ל נגד ארנב Alexa594 נוגדנים משני בדילול 1: 100 ב PBST דגירה 3 ימים על שייקר בתנור 37 מעלות צלזיוס.
6. העברת ביופסיות לצינור 15 מ"ל, ולשטוף רקמות 4 פעמים במשך 6 שעות ב 5 מ"ל של PBST על שייקר בתנור 37 מעלות צלזיוס.
7. העברת ביופסיות לצינור 2 מ"ל, להוסיף 1 מ"ל 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) פתרון counterstain גרעיני (1: 1,000) ב PBST דגירה לילה על שייקר בתנור 37 מעלות צלזיוס.
8. הסר פתרון counterstaining DAPI, ולהוסיף 1 מ"ל של PBST אל הצינור 2 מ"ל לשטוף רקמות 4 פעמים במשך 6 שעות על שייקר בתנור 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: שלב אופציונלי: ביופסיות ניתן לאחסן בחושך ב 1x PBS עם אזיד הנתרן 0.02% למשך 3 שבועות לפחות.

3. האדום הנילוס מכתים

1. ממיסים אבקת האדום הנילוס dimethylsulfoxide (DMSO) לריכוז סופי של 1 מ 'g / ml
2. הוסף 1 μl פתרון האדום הנילוס עד 1 מ"ל PBS לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל.
3. רקמת ההפשרה מן 1.2.9) לטמפרטורת החדר במשך 2 - 3 שעות, ולשטוף עם 5 מ"ל PBS עבור 8 שעות בטמפרטורת החדר.
4. העבר ביופסיות לצינור 2 מ"ל, לצלול רקמות 1 מ"ל פתרון מכתים האדום הנילוס עבור 2.5 שעות בטמפרטורת החדר.
5. שטפו את ביופסיות עור בצינור 2 מ"ל עם 1 מ"ל PBST 4 פעמים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
6. הסר פתרון PBST מהצינור 2 מ"ל, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת counterstaining גרעיני DAPI (1: 1,000) ב PBST דגירה לילה בטמפרטורת החדר.
7. הסר פתרון counterstaining DAPI, ולהוסיף 1ml של PBST בצינור 2 מ"ל לשטוף את רקמת העור 4 פעמים במשך 6 שעות בטמפרטורת החדר.
   הערה: שלב אופציונלי: ביופסיות ניתן לאחסן בחושך ב 1x PBS עם אזיד הנתרן 0.02% למשך 3 שבועות לפחות.

4. הדמיה

1. הכן את פתרון סליקת CUBIC2, המכיל 50% (W / v) סוכרוז, 25% (w / v) אוריאה, 10% (w / v) 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol, ו -0.1% (v / v) טריטון X-100.
2. דגירה רקמת העור בתמיסה 1 מ"ל CUBIC2 בתוך שפופרת 2 מ"ל על שייקר למשך 24 שעות בתנור על 37 מעלות צלזיוס. שלב זה יהיה אפילו מקדם השבירה של הרקמה.
3. בדוק את הבהירות של הרקמה. לאחר ברור, מקם את ביופסיה של העור כולו (0.2 x 0.5 ס"מ) על הצד הארוך שלה על coverslip זכוכית, כך לכיוון אורך של זקיקי השיער מקביל פני השטח coverslip (# 1 24 x 60 מ"מ)
   הערה: שלב אופציונאלי: ביופסיות צבעוניות נוגדן ניתן לאחסן פתרון CUBIC2 כ -7 ימים. הנילוס מוכתם אדום ביופסיות ניתן לאחסן רק בתמיסה CUBIC2 עד 1 יום, וצריך להיות צילמו בהקדם האפשרי.
4. הכן תא הדמיה (איור 1)
   הערה: מתכלים הנדרשים לעריכת לחדר ההדמיה הם: נקודת סימון כחול, לשחק בצק או דומה, ו -2 coverslips (24 x 50 מ"מ) (F1A igure).
   1. הכינו שתי רצועות דקות של נקודת סימון כחול (בקוטר כ 1 מ"מ X 2 ס"מ), ושני coverslips (איור 1B).
   2. מניחים רצועות כיוון כחול על פיסת כיסוי אחד, המאפשר מרחב מספיק עבור ביופסיה של העור (איור 1 ג). 4.4.3)
   3. מניחים ביופסיה של העור בין רצועות על coverslip בטיפת פתרון CUBIC2 (תרשים 1C).
   4. מכסים ביופסיה של העור עם coverslip השני (איור 1D).
5. הנח את תא הדמיה עם ביופסיה של העור רכוב על הבמה של מיקרוסקופ confocal ולהעביר את הרקמה לתוך מסלול האור.
6. סרוק את המדגם באמצעות מקור אור כספי או הלוגן ומסנני epifluorescence רגילים (למשל, DAPI / GFP / CY3 / Cy5) לזהות אזורים מוכתמים fluorescently של עניין.
7. אזורי תמונה של עניין באמצעות מטרת 10X ו 20X (NA 0.75) וטכניקות דימות פלואורסצנטי confocal סטנדרטיות (למשל., עם DAPI מוכתם דגימות להאיר עם לייזר 405 ננומטר ולאסוף אותות הקרינה בין 425 - 475 ננומטר, ועם Alexa פלואוריד 594 או הנילוס דגימות האדום מוכתם להאיר עם לייזר 561 ננומטר ולאסוף אותות הקרינה בין 570 - 620 ננומטר).
8. צור תמונת Z-ערימות של כל אזור של עניין באמצעות תוכנת רכישת תמונת מיקרוסקופ Z-מחסנית (למשל., באמצעות אלמנטי ש"ח הדמית תוכנת 4.13 כמתואר להלן).
   1. ודאו כוח ליזר אופטימלי PMT HV / הגדרות אופסט נבחרו לאסוף קרינה מדגמת.
   2. פתח את סרגל הכלים "ND הרכישה" מ "בקרות רכישה".
   3. בחר "סדרת הגדרת Z" כרטיסייה (להבטיח את כל הכרטיסיות האחרות הן לא מסומנות).
   4. בעוד סריקה בזמן אמת, להתמקד לחלק העליון של המדגם ולחץ על כפתור "למעלה".
   5. פוקוס על החלק התחתון של המדגם ולחץ על הכפתור "התחתי".
   6. גודל קלט צעד נדרש (או כפתור גודל צעד אופטימיזציה עיתונות).
   7. מִרֹאשׁss את "הפעל כעת" כפתור.
   8. שמור ערימות-Z כתוצאה כמו ערימות התמונה Tiff הפרט (1 fluorochrome לכל מחסנית Z תמונה).
9. השתמש Z- ערימות תמונה לשחזר אזורי 3D נפח של עניין באמצעות תוכנת ניתוח 3D (למשל., באמצעות Imaris x64 7.2.3 כמפורט להלן).
   1. התחל תוכנת ניתוח.
   2. בחר "לעלות" כפתור בסרגל הכלים עבור מהיקף כושר הייצור 3D.
   3. להרחיב הראשונה תמונה צבעונית מחסנית Z (למשל., DAPI).
   4. השתמש בכלי 'הוסף ערוץ' כדי להוסיף ערוצי צבע נוספים, ערוץ אחד לכל fluorochrome. כך מדגם המכיל גם DAPI ו אלקסה פלואוריד 594 fluorochromes ידרוש שני ערוצים.
   5. השתמש באפשרות "מאפייני תמונה" כדי להגדיר פיקסל הנכון (voxel) ממדים (XYZ), כפי שנקבע 4.7 לעיל.
   6. השתמש "לכיוון תצוגה" כלי לשנות צבעים ערוץ לפי הצורך (למשל, להגדיר ערוץ DAPI לכחול, Alexa פלואוריד 594 ערוץ לאדום).
   7. לפוsition נפח 3D בחלון התמונה, להשתמש בעכבר המחשב ללחוץ ונפח גרור כנדרש.
   8. השתמש באפשרות "Snapshot" בסרגל הכלים כדי ליצור צילומי מסך של תמונת 3D.
   9. השתמש באפשרות "האנימציה" בסרגל הכלים כדי ליצור סרטי סיבוב מדגם 3D.

ביופסיות עור גב עובי מלאות של עכברי wildtype מבוגרים הובהרו, מוכתמים נוגדן מחייב סמן keratinocyte הבזליים Keratin14 (K14), גרעינים היו counterstained עם פתרון המכתים DAPI (איור 2 ו סרט 1).

גרעיני DAPI החיוביים נראו ברחבי המדגם (איור 2 א, ג), והכתימו K14 היה גלוי אך ורק שכבת הבסיס חד תא העבה של האפידרמיס interfollicular, ומתאר את בלוטות חלב (הכוכבית שחור), מעטפת השורש החיצונית של זקיקי שיער, ובסופו של חיידקי שיער משני (איור 2 ב, ג), כפי שפורסמו בעבר 9. עוצמת מכתים K14 הייתה גבוהה ב האפידרמיס interfollicular, זקיק שיער דיסטלי ואת חיידקי שיער המשניים (כוכביות לבנות), והוא היה נמוך יחסית באזור הבליטה של זקיקי השיער (Bu ב איור 2 ג). את גבשושיות עורי היו גם בבירור visiblדואר באמצעות תיוג DAPI (חץ איור 2 ג).

לדמיין תאים מתרבים, ביופסיות עור גב מלא עובי telogen של עכברי wildtype מבוגרים הובהרו ומוכתם עם נוגדן אנטי Ki67, גרעינים היו counterstained עם פתרון DAPI (איור 3, ו- Movie 2).

קרטינוציטים מתרבים אותרו האפידרמיס interfollicular הבזליים (IFE באיור 3C), ובסופו של מצר (האם ב איור 3 ג) של זקיקי השיער, אבל לא באזור הבליטה (Bu ב איור 3 ג).

כדי להמחיש בלוטות החלב, ביופסיות עור הגב מלא עובי ב anagen של עכברים wildtype מבוגר הובהרו ומוכתם האדום הנילוס כי תוויות תכולת השומן של sebocytes, גרעינים היו counterstained עם פתרון מכתים DAPI (איור 4 ו- Movie 3). אדום-חיובי הנילוס sebaceouבלוטות s נצפו באזור המצר של זקיקי השיער (SB באיור 4C), מראה כי הפרוטוקול מעוקב אינו משפיע על המורפולוגיה משמעותית של מבני שומן המכיל אלה. באופן בלתי צפוי, לשערות גם תויגו עם האדום הנילוס (HS באיור 4C).

כדי להמחיש את השינויים המורפולוגיים באפידרמיס של עכברים טרנסגניים YAP2-5SA-ΔC לבטא חלבון מוטנטי יאפ היפראקטיבי קרטינוציטים הבזליים 8, ביופסיות עור הגב בעובי מלא של wildtype מבוגר ועכברים להמלטה מהונדס YAP2-5SA-ΔC הובהרו ומוכתם נוגדן אנטי K14, גרעינים היו counterstained עם פתרון DAPI (איור 5, ו- Movie 4 (wildtype) ו- Movie 5 (YAP2-5SA-ΔC)).

בעור המהונדס YAP2-5SA-ΔC, את היפרפלזיה של האפידרמיס interfollicular (חיצים כפולים עליונים בדיאגרמה 4F באיור 5F), המייצגים אוכלוסיות תא גזע המוגדלות, כפי שתוארו לעיל 8.

איור 1: הכנת לשכת ההדמיה. ת: מתכלים הנדרשים לעריכת לחדר ההדמיה הם נקודת סימון כחול, לשחק בצק או דומה, ו -2 coverslips (24 x 50 מ"מ) B:. להכין שתי רצועות דקות של נקודת סימון כחול (בקוטר כ 2 מ"מ x 2 ס"מ), ו שני coverslips C:. רצועות כיוון כחול מקום על תלוש לכסות אחד, המאפשר מספיק מקום על ביופסיה של העור. מניח את הביופסיה של העור בטיפת פתרון CUBIC2 ב בין שתי הרצועות D:. Coverslip השני מקום על רצועות כיוון כחולות לכיסוי הביופסיה של העור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: K14 / DAPI לייבל ing של עור הגב ב Telogen של עכברים בוגרים wildtype שחזור נפח 3D של ביופסיה בעור הגב ב telogen של עכבר wildtype מבוגר שכותרתו עם נוגדן K14 (האדום B, C), ו DAPI counterstain גרעיני. (כחול A, C). מכתים K14 הוא חזק באפידרמיס interfollicular (IFE), מצר ואת בלוטות חלב (הכוכבית שחור), וחידקי השיער המשני (כוכבית לבנה), ויחסית דלי הבליטה באזור (Bu). סולם bars 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3:. Ki67 תיוג של עור הגב ב Telogen של עכברים בוגרים wildtype שחזורים נפח 3D של ביופסיה בעור הגב של עכבר wildtype מבוגר שכותרתו עם נוגדנים Ki67 (האדום B, C), ו counterstain גרעיני DAPI (כחול A, C). מתרבים קרטינוציטים Ki67 חיובי ניכרים האפידרמיס interfollicular הבזליים (IFE), וכן באזור מצר (IS), אך לא את הבליטה (Bu) של זקיק השיער telogen. סולם bars 50 מיקרומטר.r קבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: מכתים האדום הנילוס של עור הגב ב אנגן של עכברים בוגרים wildtype שחזור נפח 3D של ביופסיה בעור הגב ב anagen של עכבר wildtype מבוגר שכותרתו עם האדום הנילוס (אדום B, C), ו counterstain גרעיני DAPI (כחול. A, C). מכתים הנילוס האדום גלוי sebocytes (SB) ובסופו של השערה (HS). סולם bars 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דמות5: חריגות מורפולוגי של YAP2-5SA-ΔC אפידרמיס שחזורים נפח 3D של ביופסיות עור הגב של wildtype מבוגר (A - C) YAP2-5SA-ΔC עכברים מהונדס להמלטה (D - F) שכותרתו עם נוגדן K14 (אדום. B, C, E, F), ו DAPI counterstain גרעיני (כחול A, C, D, F). היפרפלזיה אפידרמיס של האפידרמיס YAP2-5SA-ΔC ניכרת האפידרמיס interfollicular (חיצים כפולים עליונים F) ובסופו של זקיקי שיער, המציגים את ההמונים תאי גזע / אב מאפיין proximally (חיצים כפולים נמוכים ב F) 8. סולם bars 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרט 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרט 2. לחץ כאן להורדת הסרט הזה.

סרט 3. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

01movie4.jpg "/>
סרט 4. אנא לחץ כאן להורדת הסרט הזה.

סרט 5. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

החוקרים אין לי מה לחשוף.