מאמר שיטה

עבודה עם תאים השמיעתיים HEI-OC1

DOI:

10.3791/54425

⸱

3 בספטמבר 2016

 ,  ,  , 
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) הוא אחד מקווי תאי השמיעה הבודדים של עכברים הזמינים כיום למטרות מחקר. פרוטוקול זה מתאר כיצד לעבוד עם תאי HEI-OC1 כדי לחקור את ההשפעות הציטוטוקסיות של תרופות פרמקולוגיות כמו גם את התכונות התפקודיות של חלבוני האוזן הפנימית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HEI-OC1 הוא אחד מקווי תאי השמיעה הבודדים של עכברים הזמינים למטרות מחקר. תאים אלה, שהוצעו במקור כמערכת חוץ גופית לסינון תרופות אוטוטוקסיות, שימשו לחקירת מסלולים אפופטוטיים המופעלים על ידי תרופות, אוטופגיה, הזדקנות, מנגנון ההגנה על התאים, תגובות דלקתיות, התמיינות תאים, השפעות גנטיות ואפיגנטיות של תרופות פרמקולוגיות, השפעות של היפוקסיה, מתח רשתית חמצוני ואנדופלזמי, וביטוי של תעלות וקולטנים מולקולריים. בין שאר הסמנים החשובים של תאי שיער שבלול, תאי HEI-OC1 מבטאים באופן אנדוגני פרסטין, החלבון המוטורי הפרדיגמטי של תאי השיער החיצוניים. לפיכך, הם יכולים להיות שימושיים מאוד להבהרת היבטים פונקציונליים חדשים של חלבון שמיעתי חשוב זה. תאי HEI-OC1 הם חזקים מאוד, והתרבית שלהם בדרך כלל אינה מציגה סיבוכים גדולים. עם זאת, הם דורשים כמה תנאים מיוחדים כגון הימנעות משימוש בקוקטיילים אנטי-בקטריאליים נפוצים המכילים סטרפטומיצין או אנטיביוטיקה אחרת, כמו גם דגירה ב-33 מעלות צלזיוס כדי לעורר התפשטות תאים ודגירה ב-39 מעלות צלזיוס כדי לעורר התמיינות תאים. כאן, אנו מתארים כיצד לתרבית תאי HEI-OC1 וכיצד להשתמש בהם בכמה מבחנים אופייניים, כגון התפשטות תאים, כדאיות, מוות, אוטופגיה והזדקנות, כמו גם כיצד לבצע מדידות קיבול מהדק טלאי וקיבוליות לא ליניארית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוזן בית מכון-איברים של 1 קורטי (HEI-OC1) תאים נגזרים מאיבר השמיעה של 1,2 עכבר מהונדס. דגירה של כל תא מעכבר מהונדס זה על 33 ° C / 10% CO 2 (תנאי מתירני) גרם ביטוי של גן מנציחה שמפעיל בידול דה ושגשוגם מואץ; הזזת תאים ל -39 ° C / 5% CO 2 (תנאים שאינם מתירני) להביא לפגיעה התפשטות, בידול, לפחות במקרה של HEI-OC1, מוות של תאים 2,3.

תאי HEI-OC1 היו משובטים ומאופיינים במעבדה שלנו לפני למעלה מעשור, מחקרים ראשוניים הראו כי הם מביעים סמנים ספציפיים של תאי שיער שבלול, כגון פרסטין, 7 א שרירן, Atoh1, BDNF, calbindin ו calmodulin, אלא גם סמנים של תומכים תאים כמו connexin 26 ו הקולטן לגורם הצמיחה פיברובלסטים (FGF-R) 2. לכן, הוצע כי HEI-OC1 יכול לייצג common ובתאים עבור תאים חושיים ותמיכה של האיבר של קורטי 2. מחקרים מקבילים ספקו ראיות מוצקות לכך ארכיטיפי תרופות ototoxic כמו ציספלטין, גנטמיצין ו סטרפטומיצין מושרה הפעלת caspase-3 בתאים אלה, בעוד תרופות נחשבות בלתי ototoxic, כמו פניצילין, לא 2,3. לכן, שורת תא זו הוצעה כמערכת במבחנה כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים מעורבים ototoxicity ו להקרנה של ototoxicity הפוטנציאל או נכסי otoprotective של תרופות תרופתיות חדשות. ההערכה היא כי תאי HEI-OC1 שימשו יותר ממאה וחמישים מחקרים שפורסמו בעשר השנים האחרונות.

בעוד מסתכל ההשפעה הפרו-אפופטוטיים הפוטנציאל של תרופות שונות היה המטרה העיקרית של רוב המחקרים שכללו את שורות תאים, תהליכים בתא חשובים אחרים כמו autophagy והזדקנות החלו רק כדי להיחקר בתאי HEI-OC1 4-7. אנינה מחקר שנערך לאחרונה במעבדה שלנו 8, השתמשנו תאים HEI-OC1 לאסוף מערך מקיף של נתונים על מוות של תאים, הישרדות, התפשטות, הזדקנות ו autophagy המושרה על ידי תרופות פרמקולוגיות שונות תדירים במרפאה. אנחנו גם בהשוואה כמה מהתגובות של תאי HEI-OC1 עם אלו של HEK-293 (תאי כליה עובריים אנושיים) והלה (תאי אפיתל אדם) מקבלים טיפול זהה. התוצאות שלנו הצביעו על כך HEI-OC1 תאים להגיב על כל תרופה בצורה אופיינית, עם dose- ייחודי ורגיש תלוי זמן לפחות אחד המנגנונים נחקרים. גם הדגשנו כי מחקר כי פרשנות נכונה של תוצאות הניסוי תדרוש ביצוע מחקרים מקבילים עם יותר מאחד טכניקה 8.

במחקר אחר חקרנו את השימוש בתאי HEI-OC1 כדי להעריך את התגובה התפקודית של פרסטין, החלבון המנוע של תאי שיער חיצוניים שבלול (OHCs) 9 . דיווחנו cytometry זרימה ומחקרים מיקרוסקופיית לייזר confocal על דפוס הביטוי פרסטין, כמו גם קיבול קוי (NLC) ומחקרים ההידוק תא-תיקון כל בתאים HEI-OC1 בתרבית בשעה מתירנית (P-HEI-OC1) והלא תנאי היתר (NP-HEI-OC1). התוצאות שלנו הצביעו על כך הוא ביטוי פרסטין סך קרום פלזמת גידול לוקליזציה באופן תלוי-זמן בתאי NP-HEI-OC1. מעניין, מצאנו גם כי גידול לוקליזציה פרסטין על קרום הפלזמה של תאי NP-HEI-OC1 בקורלציה עם ירידה Na + K + ATPase, אשר translocated מן קרום הפלזמה אל הציטופלסמה ללא שינויים משמעותיים ביטוי תא כולל. בנוסף, הראינו כי P-HEI-OC1 יש לתאים NLC חזק הקשורים פרסטין תפקוד מוטורי, אשר ירד כאשר הצפיפות של מולקולות פרסטין נוכחי קרום הפלזמה גדלה. בסך הכל, תוצאות אלו תומכות התועלת של HEI-OC1 תאים לחקור חלבוני שמיעה.

במאמר זה וידאו אנו מתארים כיצד תרבות תאי HEI-OC1, למה זה נוח להשתמש תאים גדלים בתנאי היתר (P-HEI-OC1) ללימודי cytotoxicity, איך להעריך את המנגנון / s של cytotoxicity-סמים ואיך לבצע מחקרים אלקטרו (למשל, תיקון- clamp, קיבול שאינו ליניארי (NLC)) לחקור תכונות פעילות של פרסטין, המנוע המולקולרי של OHCs שבלול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים

הערה: כל פרוטוקולי culturing התא חייבים להתבצע באמצעות טכניקות תרבות תאים תקינות (לעיון ראה פרקי 3 הראשונים של ביולוגיה של תא: חוברת מעבדה, כרך 10). תאי HEI-OC1 אינם דורשים כל ציפוי נוסף או טיפול של מנות תרבית תאים לדבקות וצמיחה נכונות. חשוב מאוד: לא להשתמש בכלי זכוכית למטרות תרבית תאים; הפנוטיפ ואת התגובה ביולוגית של התאים לתרופות תרופתיות ישתנה (G Kalinec & F Kalinec, לא פורסם); מנות תרבית תאי פלסטיק קונבנציונליות מומלצות (ראה טבלה של חומרים / ציוד). שים לב מיוחד לטכניקות ספטית כדי למנוע זיהומים, אבל אף פעם לא להשתמש באנטיביוטיקה (למשל, אמפיצילין או סטרפטומיצין) עם תאי HEI-OC1. במידת הצורך, להשתמש amphotericin B. בעוד הלה HEK-293 תאים שימשו כבקרה במחקרים קודמים עם HEI-OC1 8, כל שורת תאים אחרים יכוללהיות מקובל למטרה זו.

  1. החייאה של תאים קפואים HEI-OC1
    הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש גם עם שורות תאים אחרים מאותו העכבר המהונדס פותח במעבדה שלנו, כגון OC-K3, מהאיבר של קורטי 11,12, ו SV-K1, מן stria vascularis 13,14.
    1. הסר בקבוקון של תאים HEI-OC1 cryopreserved מנוזל N 2, ולמקם אותו באמבט מים ב 37 ° C. לצלול רק את החצי התחתון של הבקבוקון, ולאפשר לו להפשיר עד כמות של קרח קטנה נשארת הבקבוקון. נגב את החלק החיצוני של הבקבוקון עם 70% אלכוהול.
    2. פיפטה את התאים מבקבוקון ולספק את כל נפח (~ 1.5 x 10 5 תאים / מ"ל) לאט, טיפה אחר טיפה, לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיום הגידול מראש התחמם, כמו בינוני של הנשר שונה של Dulbecco ( DMEM), בתוספת סרום שור העובר 10% (FBS).
    3. הסר DMSO ידי צנטריפוגה את הצינור ב 300-500 XG במשך 5 דקות, השלכת tהוא supernatant מחדש השעיית התאים 9 מ"ל של מדיום הגידול טריים (DMEM + 10% FBS). Disaggregate גושים או גיליונות של התאים על ידי הגאות והשפל של תאים מושעה, מן פיפטה עד בינוני ולהיפך, שלוש עד ארבע פעמים עם קצה פיפטה נוגע בתחתית של התחתית.
    4. מניחים את הנפח הכולל של התאים מושעה במדיום הגידול ב 100 מ"מ בקוטר מטופל, תרבות מנות תא פלסטיק.
    5. דגירה התאים ב 33 מעלות צלזיוס עם 10% CO 2 (תנאי מתירני).
  2. תת של תאי HEI-OC1
    הערה: לפני המפגש (~ 80%) התאים יובאו לתוך השעיה ותת-תרבותית על מנת למנוע ההתרבות גוססת. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עם שורות תאים אחרים שפותחו במעבדה שלנו מאותו עכבר מהונדס, כגון OC-K3, מאיבר של קורטי 11,12, ו SV-K1, מן stria vascularis 13,14.
    1. הסר בינוני הישן לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של PBS.
    2. מכסים את monolayer תא עם תמיסה של טריפסין 0.25%, באמצעות 1 מ"ל לכל 25 ס"מ 2 של שטח הפנים. כדי להעביר אל השלב הבא יותר מ -40% מכלל התאים חייבים להיות מנותקים. בדקו את התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, ואם יש צורך, "סטירה או קש" את כלי התרבות בעדינות כדי לשחרר את כל תאים מצורפים נותרים.
      הערה: שמור על עצמך כמו trypsinization לתקופות ארוכות יכול לגרום מוות של תאים; לא מספיק והתאים המועברים מספיק עבור המחקרים המתוכננים.
    3. Resuspend התאים, הנוהל המתואר ב 1.1.3, ולהעבירם צינור חרוטי 15 מ"ל.
    4. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300-500 XG, להשליך את המדיום, לאסוף את התאים עם מדיום גידול טרי וזרע אותם, לפחות, ארבעה 100 מנות תרבית תאי מ"מ בקוטר. מספר תאים לכל צלחת יהיה תלוי בכמות של תאים התאוששו. דגירת התאים ב 33 מעלות צלזיוס עם 10% CO 2 (P-HEI-OC1) ולחלק שוב כמספר פעמים דרושותהניסויים המתוכננים או להפקת מלאי חדש.
    5. להכנה מלאי, להחליף 100 מנות מ"מ קוטר ידי צלוחיות תרבית תאי 250-550 מיליליטר; לניסויים, מנות קטנות או צלחות-בארות רבות עשויות להיות הולמות יותר.
    6. לבידול, דגירה תאים HEI-OC1 בתנאי מתירני עד הגיעם ~ 80 מפגש%; ולאחר מכן להעביר את הכלים ל -39 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 (NP-HEI-OC1) עבור 2 עד 3 שבועות.
      הערה: תאים יהיה בהדרגה להפסיק מתרבים ומתים. שינוי המדיום פעם ביומיים כדי להסיר תאים מתים. בהתאם למספר של תאים המקוריים, בדרך כלל לאחר כ -4 שבועות לא יותר תאים יהיו זמינים עבור ניסויים. בידול מתחיל ברגע התאים ממוקמים בתנאי NP, אך לא בכל תא להבדיל באותו קצב. חשוב לציין, פרסטין ביטוי לוקליזציה קרום עליות במהלך תהליך ההתמיינות (ראה נציג תוצאות, איור 4), מתן שירות איכותיוכמותיים אינדיקציה של רמת הבידול.

2. מחקרי Cytotoxicity ותרופות

הערה: תאי HEI-OC1 גדלו בתנאי ההיתר (P-HEI-OC1) מומלצי המחקרים הללו (ראו נציג תוצאות, איור 1).

  1. כדאיות התא (Assay MTT)
    1. איסוף תאי P-HEI-OC1 על ידי ביצוע ההליך מתואר 1.2, ולספור איתם או דלפק תא אוטומטי או hemocytometer. התאם את הריכוז כדי 2.0 x 10 5 תאים / מ"ל.
    2. זרעי התאים על 96-גם צלחות תחתיות שטוחה ברורה (100 μl לכל היטב), דגירת הלילה עבור התקשרות למצע, ולאחר מכן להתייחס אליהם עם הסמים של עניין. אל תשכחו לכלול חסר ותאים שאינם מטופלים (שליטה)!
    3. לאחר טיפול תרופתי (בדרך כלל 24 או 48 שעות ב 33 מעלות צלזיוס), לבצע את assay MTT בעקבות הפרוטוקול של היצרן. בכללייש, הפרוטוקולים עבור assay זה את השלבים הבאים:
      1. הוסף 10 μl של מגיב MTT היטב כל אחד.
      2. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 4 שעות עד צבע סגול גלוי, ולאחר מכן להוסיף 100 μl של מגיב דטרגנט MTT היטב כל אחד. אין לטלטל את הצלחת.
      3. מכסים את הצלחת ולהשאיר אותה בחושך במשך 2 עד 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
      4. שימוש בקורא צלחת microplate למדוד ספיגה ב 570 ננומטר בכל טוב, כולל את החסר (מדיום גידול לבד). לנרמל את הנתונים באמצעות OD הממוצע בתאים שליטים 100% של כדאיויות.
  2. Assay caspase 3/7 הפעלה
    הערה: תאי HEI-OC1 גדלו בתנאי ההיתר (P-HEI-OC1) מומלצים ללימודים אלה.
    1. איסוף תאי HEI-OC1 על ידי ביצוע ההליך מתואר 1.2, ולספור איתם או דלפק תא אוטומטי או hemocytometer. התאם את הריכוז כדי 2.0 x 10 5 תאים / מ"ל.
    2. זרעי התאים על ש"שITE קירות 96-גם צלחות (100 μl לכל היטב), דגירת הלילה עבור התקשרות למצע, ולאחר מכן להתייחס אליהם עם הסמים של עניין. אל תשכחו לכלול חסר ותאים שאינם מטופלים (שליטה)!
    3. לאחר טיפול תרופתי (בדרך כלל 24 או 48 שעות ב 33 מעלות צלזיוס), לבצע את assay caspase בעקבות הפרוטוקול של היצרן בהתאמה. באופן כללי, את הפרוטוקולים assay זה יש את השלבים הבאים:
      1. כן ריאגנטים, לערבב אותם היטב, ולאפשר להם לאזן לטמפרטורת חדר.
      2. הסרת תאים מן החממה ולאפשר צלחות לאזן לטמפרטורת החדר.
      3. מוסיף את הכמות המצוינת של מגיב היטב כל, להיות זהיר, כדי למנוע זיהום צולב על ידי לא נוגע בארות המכילות מדגמים שונים בקצות פיפטה אותו.
      4. מכסים את הצלחת ומערבבים במשך 30 שניות באמצעות שאכר הצלחת ב 300-500 סל"ד.
      5. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך תקופה של לפחות 30 דקות. determinדואר תקופת הדגירה האופטימלית באופן אמפירי. אם טמפרטורת החדר נעה להשתמש חממה קבועה בטמפרטורה, בגלל תנודות טמפרטורה תשפענה קריאת הארה.
      6. מדוד הארה בכל טוב, לנרמל ערכים באמצעות הארה ממוצעת בתאים שליטים 100% של הפעלת caspase.
  3. חלוקת התא (הפצת נשק)
    1. איסוף תאי HEI-OC1 על ידי ביצוע ההליך מתואר 1.2, ולספור איתם או דלפק תא אוטומטי או hemocytometer. התאם את הריכוז כדי 2.0 x 10 5 תאים / מ"ל.
    2. זרעי התאים על 96-גם צלחות תחתיות שטוחה ברורה (100 μl לכל היטב), דגירת הלילה בשעת תנאי מתירני עבור התקשרות למצע, ולאחר מכן להתייחס אליהם עם הסמים של עניין. אל תשכחו לכלול חסר ותאים שאינם מטופלים (שליטה)!
    3. שעה אחת לאחר הטיפול, להוסיף היטב כל 1 μl של BrdU 100x מוכן (5-Bromo-2'-deoxyuriלסעוד) פתרון, ולהחזיר את הצלחות אל החממה ב 33 מעלות צלזיוס.
    4. לאחר 12, 24 ו -48 שעות, להסיר את המדיום הקיים מהצלחות המקבילות ולשטוף היטב כל פעם עם PBS.
    5. בצע את assay התפשטות תאים בעקבות הפרוטוקול של היצרן. באופן כללי, את הפרוטוקולים assay זה יש את השלבים הבאים:
      1. כן ריאגנטים, כולל תיקון / פתרון denaturing, לשטוף חיץ, פתרון זיהוי נוגדן ראשוני, פתרון זיהוי נוגדנים משני, ופתרון BrdU כמצוין הפרוטוקול של היצרן.
      2. מוסיפים את פתרון תיקון / denaturing זה טוב, בסכומים בפרוטוקול של היצרן, ולשמור על צלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
      3. הסר את הפתרון לתקן / denaturing ומוסיפים את הנוגדן העיקרי בריכוז בפרוטוקול של היצרן. שמור את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
      4. הסר את הפתרון עם הנמלה העיקריתibody, לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם חיץ לשטוף, ולאחר מכן להוסיף את הנוגדנים משני בריכוז בפרוטוקול של היצרן. שמור את הצלחת עם נוגדנים משני בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
      5. הסר את הפתרון עם נוגדנים משני, לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם חיץ לשטוף, ומוסיפים את המצע. לאחר 10 הדגירה דקות בטמפרטורת החדר, להוסיף את הפתרון STOP. היזהר: שליטה על שינוי צבע; אם הפתרון הופך כהה מאוד, לעצור את התגובה לפני מועד פיתוח התקן של 10 דק '.
      6. קראו ספיגה ב 450 ננומטר בתוך 30 דקות של הוספת פתרון STOP.
  4. cytotoxicity
    הערה: תאי HEI-OC1 גדלו בתנאי ההיתר (P-HEI-OC1) מומלצים ללימודים אלה.
    1. לדגור על תנאי מתירני, בדרך כלל 24-48 שעות, תאי HEI-OC1 במדיום תרבית תאים לבד (שליטה) או בינוני בתוספת תרופות עניין.
    2. בסוף הטיפול, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS, ולנתק באמצעות 1 מ"ל לכל 25 ס"מ 2 של שטח הפנים של פתרון התא דיסוציאציה אנזימטית במשך 3 דקות.
    3. לאחר הניתוק, לאסוף גלולת התאים על ידי צנטריפוגה ב 3000 XG במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, להכתים את התאים במשך 15 דקות בחושך עם המגיב הכלול assay cytotoxicity.
    4. לקבוע את מספר תאים HEI-OC1 חי על ידי זרימת cytometry כפי שצוין על ידי היצרן של cytometer את הזרימה.
  5. הְזדַקְנוּת
    1. לדגור על תנאי מתירני, בדרך כלל 24-48 שעות, תאי HEI-OC1 במדיום תרבית תאים לבד (שליטה) או בינוני בתוספת תרופות עניין.
    2. קבע את מספר התאים החיוביים-galactosidase בטא קשור-הזדקנות באמצעות cytometry זרימה עם הפרוטוקול המתואר על ידי Debacq-Chainiaux et al. שיטת 15 או אחרים ידועים לספק תוצאות אמינות. פרוטוקול קצר עבור cytometry זרימה הוא את הדברים הבאים:
      1. בסוף של טיפולים ניסיוניים, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולאחר מכן לדגור אותם עם 100 ננומטר Bafilomycin A1 במדיום תרבית תאים עבור שעה 1 ב תנאי מתירני.
      2. להוסיף C12FDG בריכוז סופי של ~ 33 מיקרומטר, ולהמשיך דוגרי התאים במשך 1-2 שעות.
      3. שוטפים את התאים פעמיים עם PBS, למסוק אותם באמצעות 1 מ"ל לכל 25 ס"מ 2 של שטח הפנים של פתרון התא דיסוציאציה אנזימטית במשך 3 דקות, ו גלולה אותם על ידי צנטריפוגה ב 3000 XG במשך 5 דקות.
      4. Resuspend התאים קר כקרח PBS ולקבוע את מספר התאים חיובי HEI-OC1 ידי זרימת cytometry כפי שצוין על ידי היצרן של cytometer את הזרימה.
  6. autophagy
    1. איסוף תאים HEI-OC1 לשלוט ומורעבת (משולל בסרום במשך 48 שעות) על ידי ביצוע ההליך המתואר 1.2, ולעבד אותם כתם המערבי הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים. באופן כללי, הפרוטוקולים כתמים מערבי יש את הדברים הבאים steps:
      1. HEI-OC1 זרע תאים 6 צלחות גם בריכוז של 1.0 x 10 5 תאים / מ"ל. לאחר 24 ו / או 48 שעות, לשטוף את התאים עם PBS קר כקרח.
      2. Lyse עם 200 μl של חיץ TNESV (1% NP40, 50 mM Tris-HCl 7.5 pH, 100 מ"מ NaCl, EDTA 2 מ"מ, 1 מ"מ Na 3 VO 4) עם קוקטייל מעכבי פרוטאז ו 1 מ"מ PMSF במשך 5 דקות על הקרח.
      3. אוספים את התאים (על ידי גירוד בתחתית כל טוב), להעביר צינורות microcentrifuge צנטריפוגות ב 16,800 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..
      4. אסוף את supernatants ולכמת את ריכוז החלבון באמצעות assay BCA.
      5. הוסף חוצץ טעינת 5x ו 1 מ"מ DTT מדגם ומרתיחים במשך 5 דקות כדי לפגל את החלבונים.
      6. הפעל את הדגימות באמצעות SDS-PAGE על ג'ל 4-12%, ולהעביר ממברנות PVDF.
      7. חסום את ממברנות עם 5% שומן חלב מיובש TBS-T עם 0.1% Tween 20 במשך 60 דקות ב RT.
      8. דגירת ממברנות הלילה ב 4 ° C עם נמלה עיקריתibodies.
      9. למחרת, לשטוף את הקרומים בהרחבה עם TBS-T, דגירה עם נוגדן IgG משני מצומדות כדי peroxidase חזרת (HRP) (1: 1,500) במשך שעה 1.
      10. זיהוי immunoreactivity עם chemiluminescence משופרת מערכת איתור (ECL). לנרמל את רמות ביטוי חלבון באמצעות GAPDH (1: 2,000 ב TBS-T עם ב 10% חלב ללא שומן מיובש) כסטנדרט.
    2. ב הכתמים המערביים לחקור את הביטוי, לפחות, שני סמנים שונים של autophagy כגון Beclin-1 ו LC3B (בדרך כלל 1: 1,000 דילול ב TBS-T עם 2.5% BSA). אל תשכחו לחפש בבקרת ביטוי חלבון כגון GAPDH או תקטין.
    3. חישוב הביטוי של החלבון של עניין על ידי צפיפות באמצעות סורק כתם דיגיטלי או תוכנת מחשב כגון תמונת NIH לרשות הציבור או ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. ניסויים Electrophysiology עם תאים HEI-OC1

  1. תאי קציר
    הערה: תאים לשימוש הגובר במנות תרבות בקוטר 100 מ"מ ב -50% -80% confluency. טריפסין, Accutase, פתרון ללא אנזים, או p hosphate- ב אלין + e s uffered thylene ד iamine t etra חומצת cetic (PBS-EDTA) ניתן להשתמש להסרת תאים ללא השפעה משמעותית על מספר ואיכות של gigaseals . במקרים מסוימים, עם זאת, טיפול טריפסין גורם לתאים שברירי יותר. במקרים אלה, ולאפשר לתאים להתאושש במשך כ 30 דקות לפני תחילת הניסויים.
    1. שוטפים את התאים פעמיים עם 10 מ"ל PBS ללא Ca 2 + ו Mg 2+.
    2. הוסף 2 מ"ל של פתרון detacher האנזים ללא, כגון פתרון התא דיסוציאציה אנזימטית, דגירה מנות 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
    3. שימוש במיקרוסקופ הפוכה כדי לבדוק את הניתוק של התאים. במידת הצורך, להעביר את cell תרבות צלחת לנתק תאים יותר, אבל לעשות את זה בעדינות.
      הערה: אין לטלטל את המנה.
    4. הוסף 10 מ"ל של DMEM + 10% FBS ו פיפטה בעדינות תאים למעלה ולמטה חמש פעמים עם טפטפת 10 מ"ל.
    5. תראו את התאים תחת מיקרוסקופ. אם> 80% של תאים מופרדים כבר (יחיד), לא pipetting נוספת. אם התאים הם עדיין באשכולות, לחזור על pipetting בעדינות עד יותר מ -80 תאים% רווקים.
    6. מניחים את ~ 10 מ"ל של תאים מושעה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 100 XG, וזורקים supernatant.
    7. השתמש ~ 200 μl של פתרון הקלטה חיצוני (בינוני L-15 של ליבוביץ מותאם ל 305 - 310 mOsm עם מים מזוקקים) כדי resuspend התאים. פקד אופטי של התאים צריך להראות רבים יחידים, תאים עגולים עם קצות קרום חלקים.
  2. תיקון- clamp ומדידות NLC
    1. בצע תיקון- clamp ומדידות של קיבול קוי מתח תלוי (NLC) באמצעותמגברים ותוכנת dequate, כמו גם טכניקות אלקטרו סטנדרטיות. כפי פנימי (intrapipette) לשימוש פתרון 150 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 0.1 מ"מ EGTA, 2 מ"מ ATP-Mg, 0.1 מ"מ GTP-Na, ו -10 מ"מ HEPES; כדי להתאים את pH 7.2 עם טריס.
    2. תחת המיקרוסקופ, בחר תא יחיד, בריא, עם סיבוב וקצות קרום חלקים. חבר את קצה פיפטה זכוכית אל פני התא ולבדוק התנגדות הממברנה. זה צריך להיות סביב 3-6 megaOhms, מתאים קוטר פנימי (ID) של קצה פיפטה של ​​~ 2 מיקרומטר.
    3. לחץ בעדינות את קצה micropipette נגד קרום תא תא ולאחר מכן להחיל יניקה. חלק של קרום התא יהיה נשאב לתוך פיפטה, הפקת התנגדות חשמלית בסדר 10 - 100 gigaOhms (gigaseal).
    4. להקים את מצב כל תא ע"י שיבוש קרום הפלזמה עם פולסים יניקה.
    5. השתמש בתאים שאינם להביע פרסטין, כגון HEK-293, כביקורת 9.
      הערה: תגובות נוכחיות צריכות להיות מסוננות על 5 kHz, ותיקונים שנעשו על ההשפעות של התנגדות סדרה שיורית. כל אוסף הנתונים והניתוחים ביותר יכולים להתבצע באמצעות התוכנה בדרך כלל מצורף מגברי הנעילה. פונקצית קיבוליות יכולה להיות מצוידת בנגזרת הראשונה של פונקציה בולצמן שתי מדינות לשני עמים הקשורים תשלום קוי מתח הממברנה 16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד כמה פרסומים האחרונים דיווחנו מערך מקיף של מחקרים שמטרתם להעריך את התגובות של תאי HEI-OC1 לסמים תרופתיים כמה נפוצים כמו גם חוקר פרסטין פונקצית 8,9. במחקרים אלה עשינו שימוש כל הפרוטוקולים מתוארים בסעיפים הקודמים.

אחת התוצאות של המחקרים הקודמים אלה היה כי תאי HEI-OC1 בתרבית בתנאים אוֹסְרָנִי (39 ° C / 10% CO 2 = NP-HEI-OC1) ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדוח זה אנו מתארים כיצד התרבות תאים HEI-OC1 ולהשתמש בהם כדי להעריך מנגנונים של רעילות סמים ולחקור תכונות פעילות של פרסטין, המנוע המולקולרי של OHCs שבלול. הנהלים הטכניים, עם זאת, הם כלליים מספיק כדי להתאים בקלות מחקרים שונים.

כל הפרוטוקולים המתוארים כאן דורשים את השימוש הנכון של טכניקות תרבית תא ומבוססות 10. בדיוק כמו עם כל שורת תאים אחרת, עבודה עם תאי HEI-OC1 דורשת מתקן תרבית תאים מצויד כראוי, עם ארון ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים קיים או פוטנציאלי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01-DC010146 ו-R01-DC010397. תוכנו הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפה הרשמית של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
HEI-OC1כל ערכות הבדיקה, הציוד 
ארון בטיחות ביולוגי Class IIחברת בייקרסטרילגארד IIIוחברות המצוינות
בצנטריפוגה המקוררתEppendorf5810R2 העמודות הקודמות הן רק
מיקרוסקופ הפוךZeissAxiovert 25דוגמאות, וניתן להשתמש בכל מוצר דומה אחר
WaterbathStovallHWB115.
מונה תאיםNexcelomCellometer Auto T4
שתי (2) חממות תאים, אחת ב-33 מעלות; C/10% CO2 ואחר ב-39 מעלות; C/5% CO2Forma Scientific3110
כלי תרבית תאים, PS, 100 מ"מ x 20 מ"מ עם פתחי האוורורGreinier Bio-One664-160
כלי תרבית תאים, PS,  60 מ"מ x 15 מ"מ עם פתחי אוורור גריינר ביו-וואן628160
צלוחיות תרבית רקמות סלסטאר  250 מ"לגריינר ביו-וואן658-175
צלוחיות 550 מ"לגריינר ביו-וואן660-175
  צלחת תרבית תאים 6 בארות, עם מכסה-CellstarGreiner Bio-One657-160
צלחת תרבית רקמות Microtest, 96 באר, תחתית שטוחה עם מכסהBecton Dickinson353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96 בארות לבן, תחתית שקופהGreiner Bio-One655098
50 מ"ל צינור חרוטי מפוליפרופילן עם מכסה CellstarsBecton Dickinson 352070
15 מ"ל צינורות חרוטיים מפוליפרופילן עם מכסה-CellstarsGreiner Bio-One188-271
PBS pH 7.4 (1x) לייף טכנולוג'יז10010-023
דולבקו s Modified Eagle' s Medium (DMEM)Life Technologies11965-084
סרום בקר עוברי (FBS) HycloneSH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, ללא פנול אדוםGibco/Invitrogen21083-027
טריפסין, 0.25% Life Technologies25200-056
TACS ערכת בדיקת התפשטות תאי MTTTrevigen4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 ערכת בדיקה  Promega  G8091 
ערכת בדיקת התפשטות תאים BrdU איתות תאים6813
תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים Sigma-AldrichC5789
ערכת בדיקת ציטוטוקסיות ירוקה Cell-ToxPromega  G8741 
מכשיר FACSAriaIII BD ביוסיינס  FACSAriaIIIעם עירור 488 ננומטר (לייזר כחול)
סורק כתמים דיגיטליLI-CORC-DiGit
יחידת אלקטרופורזה וספיגהHoeferSE300 miniVE
Spectra Max 5 קורא צלחות עם Soft Max Pro 5.2 תוכנהמכשירים מולקולרייםSpectraMax 5
מגבר מהדק תיקוןHEKAEPC-10
חולץ להכנה אלקטרודות תיקוןSutter InstrumentsP-97
תאי של

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים