הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של הידרוג'לים מתפקדים RGD כמכשירים להעברת תאים ותרופות. ההליך כולל תוספת ציקלו-אזיד אלקין-אזיד מזורזת נחושת (CuAAC) בין חומצה פוליאקרילית ששונה באלקין (PAA) ונגזרת RGD-אזיד. ההידרוג'לים נוצרים באמצעות עיבוי בסיוע מיקרוגל ונחקרים תכונותיהם הפיזיקוכימיות.

תקציר

השימוש בפולימרים כביו-חומרים סיפק יתרונות משמעותיים ביישומים טיפוליים. בפרט, האפשרות לשנות ולתפקד שרשראות פולימרים עם תרכובות המסוגלות לשפר תאימות ביולוגית, תכונות מכניות או כדאיות תאים מאפשרת תכנון של חומרים חדשים כדי לעמוד באתגרים חדשים בתחום הביו-רפואי. עם אסטרטגיות הפונקציונליזציה של הפולימרים, כימיית הקליק היא כלי רב עוצמה לשיפור תאימות התאים ותכונות העברת התרופות של מכשירים פולימריים. באופן דומה, הצורך הבסיסי של הביו-רפואה להשתמש בכלים סטריליים כדי למנוע תופעות לוואי שליליות פוטנציאליות, כגון רעילות או זיהום של הסביבה הביולוגית, מעורר עניין גובר באסטרטגיה בסיוע מיקרוגל.

השילוב של כימיית קליק ושיטה בסיוע מיקרוגל מתאים לייצור הידרוג'לים תואמים ביולוגית עם פונקציות רצויות וביצועים משופרים ביישומים ביו-רפואיים. עבודה זו נועדה לסנתז הידרוג'לים מתפקדים RGD. RGD (חומצה ארגינילגליצילספרטית) הוא טריפפטיד שיכול לחקות חלבוני הידבקות תאים ולהיקשר לקולטנים על פני התא, וליצור מיקרו-סביבה מסבירת פנים לתאים בתוך הרשת הפולימרית התלת-ממדית של ההידרוג'לים. פונקציונליזציה של RGD מתרחשת באמצעות תוספת ציקלו-דו-קוטבית של Huisgen 1,3. חלק מקבוצות הקרבוקסיל של PAA משתנות עם חלק אלקין, בעוד ש-RGD מתפקד עם חומצת אזידו כשאריות הסופיות של רצף הפפטידים. לבסוף, שני המוצרים משמשים בתגובת לחיצה מזורזת נחושת כדי לקשר לצמיתות את הפפטיד ל-PAA. פולימר שונה זה משמש עם קרבומר, אגרוז ופוליאתילן גליקול (PEG) לסינתזה של מטריצת הידרוג'ל. המבנה התלת מימדי נוצר עקב תגובת אסטריפיקציה הכוללת קבוצות קרבוקסיל מקבוצות PAA וקרבומר והידרוקסיל מאגרוז ו-PEG באמצעות עיבוי פולי בסיוע מיקרוגל. היעילות של מנגנון הג'לציה מבטיחה רמה גבוהה של פונקציונליזציה של RGD. בנוסף, ההליך להעמסת תרכובות טיפוליות או כלים ביולוגיים בתוך רשת פונקציונלית זו הוא פשוט מאוד וניתן לשחזור.

מבוא

הידרוג הן רשתות תלת מימדי נוצר על ידי פולימרים צולבים הידרופילי, אשר הם טבעיים או סינתטיים, ואת המאופיינת במבנה תלת מימדי ייחודי. מכשירים אלו אטרקטיביים יותר ויותר בתחומי הביו-הרפואיים של אספקת סמים, הנדסת רקמות, נושאות גנים ^1,2 חיישנים חכמים. אכן, תכולת המים הגבוהה שלהם, כמו גם המאפיינים rheological המכאניים שלהם להפוך אותם מועמדים מתאימים לחקות microenvironments רקמות רך ולגרום להם כלים יעילים ציטוקינים מסיסים במים או מסירת גורם גדילה. אחד לשימוש המבטיח ביותר הוא בתור ביולוגי בזריקות נושאת תאי תרכובות ביו. הידרוג עשוי לשפר הישרדות תא ואת גורלו תאי גזע מלא על ידי החזקה ודווקא מתן אותות רגולטוריות תאי גזע באופן רלוונטי פיסיולוגי, כפי שנצפה במבחנה בניסויי vivo ^3,4. היתרון המוביל של זה הוא האפשרותכדי לשמור על תאים מוזרקים בתוך האזור של חיסון (in situ), הפחתת כמות התאים שמשאירה את שטח extravasates לתוך מבול הדם, נודד בכל רחבי הגוף ואיבוד יעד המטרה ^5. היציבות של רשתות הידרוג'ל תלת ממדי נובעת מאתרי cross-linking שלה, שהוקמו על ידי קשרים קוולנטיים או כוחות משיכה בין שרשרות הפולימר ^6.

במסגרת זו, כימיה סלקטיבית מאונכת להחיל שרשרות פולימר הוא כלי תכליתי מסוגל לשפר את הביצועים הידרוג'ל ^7. ואכן, השינוי של פולימרים עם קבוצות כימיות מתאימות יכול לעזור לספק כימי מתאים, פיזי תכונות מכאניות לשפר כדאיויות תא והשימוש בם היווצרות רקמה. באותו אופן, בין הטכניקות לטעון תאים או גורמי גדילה בתוך מטריצת ג'ל, השימוש של פפטיד RGD מאפשר שיפורי הידבקות תא והישרדות. RGD הוא tripeptide מורכבשל ארגינין, גליצין וחומצה אספרטית, שהוא בלי ספק היעיל ביותר, ולעתים קרובות מועסקי tripeptide בשל יכולתה לטפל יותר קולטן הידבקות תא אחד וההשפעה הביולוגית שלה על עיגון תא, התנהגות והישרדות ^8,9. בעבודה זו, הסינתזה של הידרוג הפונקציונלית RGD נלמדת במטרה בעיצוב הרשתות מאופיינות תכונות הביוכימיות מספיק עבור microenvironment תא מסבירי פנים.

שימוש קרינת מיקרוגל בסינתזה הידרוג'ל מציע הליך פשוט כדי למזער תגובות לוואי ולקבל שיעורי תגובה גבוהים ותשואות בתוך פרק זמן קצר יותר לעומת התהליכים התרמיים הקונבנציונליים ^10. שיטה זו אינה דורשת צעדים טיהור והתשואות הידרוג'ל סטרילית בשל אינטראקציות של פולימרים והיעדר ממיס אורגני במערכת התגובה ^11. לכן, היא מבטיחה באחוזים גבוהים של RGD צמוד רשת הפולימרים כי אף modifications נדרש הקבוצות הכימיות פולימר המעורבים ביצירת ג'ל. קבוצות carboxyl, מן PAA ו carbomer, וקבוצות הידרוקסיל, מ PEG ו agarose, להצמיח את המבנה התלת-ממדי הידרוג'ל באמצעות תגובה polycondensation. הפולימרים ציינו משמשים לסינתזה של הידרוג בטיפולים תיקון פגיעה בחוט השדרה ^12. התקנים אלה, כפי שדווח קודם עובד ^13,14, להראות התאמה ביולוגית גבוהה, כמו גם תכונות מכניות physicochemical הדומים לאלו של רקמות חיות רבות בטבע thixotropic. יתר על כן, הם נשארים מקומי באתרו, על אזור ההזרקה.

בעבודה זו, קבוצות carboxyl PAA הם שונים עם מחצית אלקין (איור 1), וכן תרכובת RGD-יזיד הוא מסונתזת ניצול תגובתיות של קבוצת מסוף tripeptide -NH ₂ עם תרכובת כימית מוכנה עם מבנה (CH _{2) n} - N ₃ ( איור 2). כתוצאה מכך, PAA השונה מגיב עם נגזר RGD-יזיד הקלקה CuAAC התגובה ^15-17 (איור 3). שימוש זרז נחושת (I) מוביל לשיפורים משמעותיים בשני קצב התגובה ואת רגיוסלקטיביות. התגובה CuAAC נעשה שימוש נרחב סינתזה אורגנית ב מדע הפולימרים. הוא משלב יעילות גבוהה וסובלנות גבוהה הקבוצות הפונקציונליות, וזה מושפע שימוש בממסים אורגניים. סלקטיביות גבוהה, זמן תגובה מהיר הליך טיהור פשוט לאפשר הקניית פולימרי כוכב, קופולימרים לחסום או שרשרות השתלת moieties רצוי ^18. האסטרטגיה לחץ זה מאפשר לשנות פולימרים לאחר פילמור להתאים אישית את מאפייני physicochemical בהתאם ליישום ביוכימיים הסופי. תנאי ניסוי CuAAC הם לשחזור בקלות (התגובה היא לא רגישה למים, ואילו חמצון נחושת עלול להתרחש מינימאלי), והמהותtriazole נוצר מבטיח יציבות של המוצר. השימוש מתכת נחושת יכול להיחשב נקודה קריטית, עקב השפעה רעילה הפוטנציאל שלה נגד תאים והן במיקרו-סביבה ביולוגית, אבל דיאליזה משמש כשיטה טיהור כדי לאפשר פינוי מוחלט של שאריות קטליטי. לבסוף, PAA שונה RGD משמש סינתזה הידרוג'ל (איור 4) ואת מאפייני physicochemical של רשתות וכתוצאה נחקרות, על מנת לבדוק את הפונקציונליות הפוטנציאל של מערכות אלה כנשאים תאים או סמים.

איור 1: PAA שונה סינתזה אלקין סכימה של functionalization PAA עם קבוצת אלקין;. "n" מציין את מונומרים עם קבוצת carboxyl מגיבים עם propargylamine. אנא לחץ כאן לצפייהגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2:.. סינתזה-יזיד RGD הסינתזה של נגזרי RGD-יזידו אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: לחץ תגובת תכנית תגובה קליק בין נגזרת RGD-יזיד ו-PAA אלקין.. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: הידרוג'ל synthesis. הליך סינתזת הידרוג'ל פונקציונלי RGD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פרוטוקול

הערה: כימיקלים המשמשים כפי שהתקבלו. לינארית RGD נרכש, אבל זה יכול להיות מוכן על ידי סינתזה פפטיד שלב מוצק רגיל Fmoc ^16,19. ממסים של כיתת אנליטי. הדיאליזה מחייבת שימוש קרום עם M _w חתוך שווה 3,500 Da. התרכובות המסונתזות מאופייני ¹ ספקטרום NMR H ונרשם על כלורופורם באמצעות ספקטרומטר 400 MHz (CDCl ₃₎ או תחמוצת דאוטריום (D ₂ O) כמו ממסים, משמרות כימיות מדווחות כערכים δ חלקים למ'. יתר על כן, הידרוג חשוף ניתוח FT-IR באמצעות טכניקה גלולה KBR והאפיון הפיזי שלהם כרוך מחקרי gelation הוערכו באמצעות המבחנה ההפוכה ב 37 ° C.

1. סינתזה של 4-Azidobutanoyl כלוריד 1

1. ממיסים 500 מ"ג של 4-azidobutanoic חומצה (3.90 מילימול) ב 10 מ"ל של dichloromethane ו -0.5 מ"ל של dimethylformamide.
2. מצננים את הפתרון ב 0 ° C, באמצעות אמבט קרח.
3. להוסיף 505 μl של כלוריד oxalyl (5.85 מילימול) עד ​​5 מ"ל של dichloromethane ולאט לאט מוסיפים dropwise למערכת התגובה, תוך ערבוב.
4. אחרי שעה 1 ב 0 ° C באמצעות באמבט קרח, לחזור לטמפרטורת החדר.
5. הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות המאייד רוטרי.
6. לאפיין את המוצר הנרכש על ידי ¹ ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת המדגם ב CDCl ₃ ^16.

2. סינתזה של-אזיד RGD נגזרים 2

1. ממיסים 50 מ"ג של RGD (0.145 mmol) ב 1 מ"ל של 1 M NaOH.
2. ממיסים 24 מ"ג 1 (0.16 מילימול) ב 2 מ"ל של tetrahydrofuran.
3. להוסיף את כל הפתרון RGD כדי dropwise פתרון 1 ב 0 ° C באמצעות אמבט קרח.
4. לחזור לטמפרטורת החדר ומערבבים לילה.
5. הוסף 1 מ"ל של 1 M HCl.
6. הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות המאייד רוטרי.
7. לאפיין את OBTained המוצר על ידי ¹ ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת מדגם D ₂ O ^16.

3. PAA אלקין שינוי 3

1. ממיסים 200 מ"ג של 35% w / w פתרון PAA (2.8 מילימול) ב 15 מ"ל מים מזוקקים.
2. הוסף 15.4 מ"ג הידרוכלוריד propargylamine (0.20 מילימול).
3. ממיסים 42.8 מ"ג של מימה 1-hydroxybenzotriazole (HOBt, 0.28 מילימול) ב 14 מ"ל של 1: פתרון מים מזוקקים על ידי חימום עד 50 מעלות צלזיוס: 1 v / v אצטוניטריל.
4. להוסיף את כל הפתרון HOBt לפתרון PAA בטמפרטורת החדר.
5. הוסף 53.6 מ"ג של ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0.28 מילימול) לתערובת התגובה.
6. השתמש 1 M HCl כדי להתאים את ה- pH ל 5.5 ומערבבים מערכת התגובה הלילה בטמפרטורת החדר.
7. Dialyze הפתרון. ממיסים 11.2 גרם של נתרן כלורי ב 2 ליטר של מים מזוקקים ולאחר מכן להוסיף 0.2 מ"ל של 37% w / w HCl. Dialyze הפתרון באמצעות קרום עם M _w החתוך של 3.5 kDa.
8. perform דיאליזה במשך שלושה ימים. שנה את הפתרון דיאליזה יומי עם 2 ליטר של מים מזוקקים מוכן טרי המכיל 0.2 מ"ל של 37% w / w HCl.
9. אחסן את הפתרון הסופי ב -80 מעלות צלזיוס. Lyophilize אותו lyophilizer על פי הפרוטוקולים של היצרן.
10. לאפיין את הפולימר הפונקציונלי ידי ¹ ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת מדגם D ₂ O ^16.

4. סינתזה של PAA-RGD פולימר 4

1. ממיסים 78 מ"ג של PAA שונה אלקין 3 (1.083 mmol) ב 10 מ"ל מים מזוקקים.
2. ממיסים 25 מ"ג של הנגזר אזיד 2 RGD (0.0722 מילימול) ב 5 מ"ל של tetrahydrofuran.
3. להוסיף את כל הפתרון RGD לפתרון פולימריים.
4. להוסיף 2.2 מ"ג של יודיד נחושת (0.0116 מילימול) ו -2.2 מ"ג של ascorbate נתרן (0.0111 מילימול).
5. ריפלוקס את התערובת וכתוצאה מכך לילה בשעה 60 ° C, עם ערבוב.
6. מצננים את התערובת עד 25 מעלות צלזיוס.
7. Dialyzדואר הפתרון. ממיסים 11.2 גרם של נתרן כלורי ב 2 ליטר של מים מזוקקים ולאחר מכן להוסיף 0.2 מ"ל של 37% w / w HCl. Dialyze הפתרון באמצעות קרום עם M _w החתוך של 3.5 kDa.
8. בצע דיאליזה במשך שלושה ימים. שנה את הפתרון דיאליזה יומי עם 2 ליטר של מים מזוקקים מוכן טרי המכיל 0.2 מ"ל של 37% w / w HCl.
9. אחסן את הפתרון הסופי ב -80 מעלות צלזיוס. Lyophilize אותו lyophilizer על פי הפרוטוקולים של היצרן.
10. לאפיין את המוצר הנרכש על ידי ¹ ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת מדגם D ₂ O ^16.

5. פונקציונליות RGD סינתזה הידרוג'ל

1. הכן את PBS. ממיסים 645 מ"ג מלח PBS ב 50 מ"ל מים מזוקקים.
2. ערבבו 40 מ"ג של carbomer ו -10 מ"ג של פונקציונליות PAA 4 ב 9 מ"ל של PBS (שלב 5.1), בטמפרטורת החדר, עד המסה מלאה (30 דק ').
3. הוספת 400 מ"ג של PEG לפתרון ולשמור ערבוב במשך 45 דקות.
4. עצור את הערבוב ולאפשר למערכת להתיישב למשך 30 דקות.
5. השתמש 1 N NaOH כדי להתאים את pH 7.4.
6. עד 5 מ"ל של תערובת שהושג, להוסיף 25 מ"ג של אבקת agarose.
7. מקרין את המערכת עם קרינת מיקרוגל ב -500 W עד רתיחה, במשך זמן בדרך כלל בין 30 שניות ו 1 דקות, ולאחר אלקטרומגנטית לחמם עד 80 מעלות צלזיוס.
8. השאירו את התערובת חשופים בטמפרטורת החדר עד לטמפרטורה יורדת ל -50 מעלות צלזיוס, להוסיף 5 מ"ל של PBS (שלב 5.1), על מנת לקבל פתרון ביחס של 1: יחס נפח 1.
9. כן 12 גלילי פלדה המכילה multiwell צלחת בקוטר של 1.1 סנטימטר.
10. קח 500 aliquots μl מהפתרון ומניח אותם לכל גלילי פלדה.
11. השאר במנוחה במשך 45 דקות עד gelification מלא במערכת.
12. הסר את הבלונים באמצעות מלקחי נירוסטה להשיג את הידרוג.

6. טוען של כלי טיפולי (Drug או תאים)

1. חזור steps 5.1-5.7.
2. כשהתערובת (כבר מדינת סול) מגיעה 37 ° C, להוסיף 5 מיליליטר של התמיסה המכילה פתרון תרופה הרצוי או תרבית תאים, כדי לקבל מערכת סופית ביחס של 1: יחס נפח 1.
3. חזור על שלבי 5.9-5.12 להשיג ברשתות פולימריות עם biocompounds בפח פיזי בתוך הג'ל.

7. אפיון הידרוג'ל

1. ניתוח FT-IR
   1. לאחר היווצרות קריש, להשרות אחד הידרוג synthetized ב 2.5 מ"ל של מים מזוקקים למשך 24 שעות.
   2. הסר את המדיה מימית שבו הידרוג'ל הוא שקוע ולהקפיא-יבש עם נוזלי N _2.
   3. לרבד המדגם הידרוג'ל פי טכניקה גלולה KBR.
      1. הוספת מרית מלאה KBR לתוך מרגמה אגת. קח כמות קטנה של מדגם הידרוג'ל (כ 0.1-2% מסכום KBR, או רק מספיק כדי לכסות את קצה מרית) ומערבבים עם אבקת KBR.
      2. טוחנים את התערובת עד שהאבקה בסדר והומוגני.
      3. השתמש בערכת גלולת KBR ליצירת גלולת IR. לחץ על האבקה באמצעות עיתונות מעבדה ידנית: 3 דקות ב קיבולת לחץ שווה ל 5 טון ולאחר מכן במשך 3 דקות בתפוקת לחץ של 10 טון.
      4. שחרר את הלחץ להשגת הגלולה הסופית כפי הומוגנית ושקופה במראה. הכנס גלולה לתוך מחזיק מדגם IR ולהפעיל את ספקטרום ^16.
2. מחקרים gelation
   1. מלאו 2 מ"ל צינור microcentrifuge עם 900 μl של PBS לאזן ל -37 מעלות צלזיוס.
   2. הוספת 100 μl של פתרון פולימר מוכן ליצור את הידרוג'ל לדגור על 37 מעלות צלזיוס.
   3. להפוך את הצינור ולבחון אם הג'ל זורם בבית 1, 2, 5, 10 ו -20 דקות. רשום את המועד שבו הג'ל אינו זורם כמו בפעם gelation.

תוצאות

נגזר אלקין PAA הוא מסונתז ביעילות מחומצת polyacrylic ו propargylamine, כפי הראה באיור 1 כאשר n תוויות את מונומרים אשר קבוצות carboxyl מגיבים עם אמין. זהות המוצר אושר על ידי ¹ ספקטרוסקופיה H-NMR. איור 5 מראה ¹ ספקטרום H-NMR של PAA שונה עם אג"ח משולש.

...

דיון

השינוי שלאחר הפילמור של PAA עם חלקי אלקין ופונקציונליזציה של RGD עם קבוצת האזידים מבטיחים היווצרות קשר יציב בין הפולימר לפפטיד. ואכן, טריאזול משמש כיחידת קישור קשיחה בין אטומי הפחמן, המחוברים למיקומי 1,4 של טבעת 1,2,3-טריאזול ולא ניתן לבקע אותו הידרוליטית או אחרת. בנוסף, טריאזול קשה מאוד לחמצון ולהפחתה, בניגוד למבנים מחזוריים אחרים כגון בנזנואידים והטרוציקלים ארומטיים קשורים²⁴. באופן זה, היכולת הכימית של מוצר PAA-RGD כמעט נעדרת בתנאי הניסוי של סינתזת הידרוג'ל. הפפטיד מושתל ברשת הפולימרית התלת-ממדית בשל אופי הק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת פולי (חומצה אקרילית) ממוצעת Mw ~ 100,000, 35 wt% ב-H2O	Sigma Aldrich	523925	CAS 9003-01-4
Poly(ethylene glycol) 2,000	Sigma Aldrich	84797	CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P	Fagron	1387083
Agarose	Invitrogen Corp.	16500-500	UltraPure
Agarose RGD פפטיד	ab142698
4-חומצה אזידובוטנואית	Aurum	Pharmatech Z-2421	CAS 54447-68-6
אוקסליל כלוריד	סיגמא אולדריץ'	O8801	CAS 79-37-8
פרופרג'ילמין הידרוכלוריד 95%	סיגמא אולדריץ'	P50919	CAS 15430-52-1
נחושת (I) יודיד	סיגמא אולדריץ'	3140	CAS 7681-65-4
נתרן אסקורבט	סיגמא אולדריץ'	Y0000039	CAS 134-03-2
פוספט חוצץ מלח	סיגמא אולדריץ'	P4417
מעבדות ספקטרום	ממברנה דיאליזה	132725	Spectra/Por 3 ממברנת דיאליזה  צינורות RC סטנדרטיים MWCO: 3.5 kD

, בע"מ