אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ Coli Escherichia: עיצוב, ייצור טיהור

Summary

מוצג פרוטוקול לייצור, טיהור ושימוש בשלפוחיות ממברנה חיצוניות ארוזות אנזימים (OMV) המספק יציבות אנזימים משופרת ליישום ביישומים מגוונים.

Abstract

עניין גובר יישום טכניקות ביולוגיה סינטטיות לתכנת שלפוחית ​​קרום חיצונית (OMV) מוביל כמה יישומים מעניינים וייחודיים מאוד עבור OMV שבו חלקיקים מסורתיים מוכיחים קשים מדי לסנתז. נכון להיום, כל חיידקים גראם שליליים הוכחו לייצר אריזות הוכחת OMV של מגוון מטענים הכוללת מולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים החומר הגנטי. בהתבסס על המטענים המגוונים שלהם, OMV הם מעורבים בתהליכים ביולוגיים רבים, החלו מתקשורת תאי תאים כדי העברת גנים ואספקה ​​של גורמים ארסיים התלויים בו חיידקים מפיקים את OMV. רק לאחרונה חיידקי OMV להיות נגיש לשימוש על פני מגוון רחב של יישומים באמצעות פיתוח טכניקות לשלוט ואריזה ישירה של חלבונים רקומביננטיים לתוך OMV. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור, טיהור, ושימוש OMV ארוז אנזים מתן השתפר overaייצור ll של אנזים רקומביננטי, vesiculation גדל, ויציבות אנזים משופר. ניצול מוצלח של פרוטוקול זה יגרום ליצירת זן חיידקים אשר בו זמנית מייצר חלבון רקומביננטי ומפנה אותו אנקפסולציה OMV באמצעות יצירת זיקה סינטתית בין חלבון רקומביננטי חלבון עוגן הממברנה חיצוני. גם פרוטוקול זה מפרט שיטות לבידוד OMV מתרבויות חיידקים כמו גם טכניקות טיפול הולמות ודברים שיש להביא בחשבון בעת ​​התאמת פרוטוקול זה לשימוש עבור יישומים ייחודיים אחרים כגון: משלוח סמי תרופות, אבחון רפואי, וטיפול סביבתי.

Introduction

אנו מציגים כאן שיטה בעיצוב, ייצור, וטיהור של שלפוחית ​​הממברנה החיצונית חיידקי טעון אנזים (OMV). OMV הם קטנים, בעיקר unilamellar, proteoliposomes כי טווח בגודל 30-200 ^1,2 ננומטר. כל חיידקים גראם-שליליים גראם חיוביים כי נחקרו עד כה הוכיחו שחרור או OMV או שלפוחית תאיים (EV) מפני השטח שלהם ^3,4. המנגנון המדויק שבו OMV מיוצר עדיין הובהר באופן מלא בשל אוכלוסיות חיידקים המגוונות אשר מפרישות אותם כמו גם את הפונקציות השונות, כי הם משרתים. OMV הוכח להובלת מגוון רחב של מטענים ממולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים ו החומר גנטי מגיש מגוון רחב של איתות מורכבת, טרנסלוקציה גן, ארסיות מתפקדת ^5,6.

המנגנונים המדויקים של biogenesis OMV אינם מתאפיינים היטב, נראים שונה בין מינים של חיידקים. למרות תיהים למעשה, פתחנו שיטה לשיפור יעיל האריזה של חלבון רקומביננטי לתוך OMV ידי יצירת הצמדה סינטתית בין חלבון של עניין וכן אנדוגני חלבון הנפוץ ביותר בקרום החיצוני חיידקי OMV שלאחר מכן. בהיעדר זיקה סינטתית, או זיקה שולבה באופן מלאכותי, בין חלבון recombinantly הביע ואת OMV את יעילות האריזה הנצפית היא מאוד נמוכה ^7. תוצאה זו היא צפויה כמו שילוב של חלבונים בתוך OMV גם מתרחשת דרך אנקפסולציה מקריות בדיוק ברגע של היווצרות OMV על פני השטח חיידקי או באמצעות אריזות בבימויו של המנגנונים אינם מובנים היטב. חלק ההצלחה נצפתה חלבוני אריזה פשוט דרך על ביטוי במרחב periplasmic המסתמך על אנקפסולציה מקרית אלא אריזה יעילה מאוד חלבון תלוי עם כמה חלבוני אריזה ביעילות גבוהה בהשוואה לאחרים הב- אינו לארוז בכלל ^8-10. על ידי ניצול טכניקות ביולוגיה סינטתית משותפות חפשנו להנדס Escherichia coli (E. coli) לייצר בו זמנית, חבילה ומפרישי אנזים פעיל עניין לתוך OMV עוקף מגבלות ידע קיימות לגבי איך OMV נוצרת וכיצד מטען נבחר על-ידי החיידקים אריזה.

לעניין יישום זה מערכת bioconjugation חלבון פיצול נבחרת ההצמדה הסינטתית בחירה כדי להקל אריזה כיוונית לתוך OMV. כפי שהשם מרמז מערכת bioconjugation חלבון פיצול מורכבת משני תחומים למקטע ומשלימים אינטראקציה זה עם זה. תחומי חלבון הפיצול שנבחרו לצורך פרוטוקול זה המכונה SpyCatcher (SC) ואת SpyTag (ST) התחום נגזרים פיברונקטין מחייב pyogenes סטרפטוקוקוס החלבון (FbaB) ^11. מערכת חלבון פיצול זה הוא יוצא דופן בכך wתרנגולת שתי יחידות המשנה הן בתוך קרבת אג"ח isopeptide יוצרת באופן ספונטני בין הפרוקסימלי אספרטית שאריות חומצת חומצה ליזין אמינו יצירת הצמדה קוולנטי. היווצרות קשר Isopeptide אינה דורשת תוספת של חלבונים מלווים, אנזימים קטליטי, או קו-פקטורים ויכולה להתרחש בקלות בטמפרטורת חדר (RT) על פני טווח רחב של מצבים רלוונטיים מבחינה הפיזיולוגית ^12.

כהוכחה מושג, phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) מ diminuta Brevundimonas נבחרה להיות ארוז לתוך E. coli נגזר OMV ^13. PTE מכיל אתר binuclear Zn / Zn פעיל ויש לו את היכולת לשבור זרחנים אורגניים באמצעות תגובה הידרוליזה המרת aryldialkylphosphates לתוך dialkylphosphates ו כהלים aryl ^14. חשיפה זרחנים אורגניים פוגעת בתפקוד העצבי הנכון דרך עיכוב הידרוליזה של אצטילכולין על ידי האצטילכולין בצמתים neuromuscular מאקיןתרכובות organophosphate נגזר g ¹⁵ מסוכן מאוד. ממושך או חשיפה משמעותית זרחנים אורגניים תוצאות נפוצות עוויתות בלתי נשלטת בדרך כלל גורם למוות באמצעות מחנק. בעוד PTE מציג את הפעילות הקטליטית הגבוהה ביותר כלפי paraoxon, דברה חזקה מאוד, הוא גם מסוגל hydrolyzing מגוון רחב של חומרי הדברה אחרות ו- V / G סוג גזי עצבים כימיים ^16. כדי להקל על אריזת OMV, פלסמיד חיידקי תוכנן מקודד מבנה גן המכיל מקדם מושרה, רצף לוקליזציה periplasmic, ואתר שיבוט מרובה קצר במעלה זרם של רצף גן SC. החדרה של גן PTE בין מנהיג רצף SC מותר ליצירת מתג גנטי שמכוון את חלבון היתוך PTE-SC למרחב periplasmic לאריזת OMV. למרות שהמאמצים המתוארים כאן להתמקד PTE, גן האנזים הוא להחלפה יכול להיות מוחלף בקלות עם רצף גן אחר facאריזת ilitate של אנזים או חלבון חלופי.

כמו החלק השני של ההצמדה הסינטתית, חלבון הממברנה חיצוני בשפע (OmpA) נבחר להציג את רצף הפפטיד ST. בעוד הבחירה של חלבון עוגן יכול להשתנות, זה הכרחי כי החלבון יש דומיין מתירנית המציג במרחב periplasmic, סובל את ההיתוך לבנות ללא גרימת cytotoxicity, ידוע להיות נוכח OMV, ואינו מצטבר כאשר הוא recombinantly מיוצר. OmpA הוא חלבון 37.2 kDa הטרנסממברני Porin כי ידוע להיות מבוטא בכמות גבוהה בקרום החיצוני בקטריאלי ולאחר OMV ^17. הוא מעורב התחבורה של מולקולות קטנות, <2 ננומטר בגודל, דרך הממברנה בקטריאלי ^18. יש Native OmpA שני תחומים ייחודיים מבחינה מבנית, מוטיב חבית בטא הטרנסממברני וחלק periplasmically מסיס בטרמינל C-ידוע אינטראקציה עם ¹⁹ פפטידוגליקן. בשנות ה designe היתוך OmpA-ST מוטציהד כאן חלק מסוף-C של OmpA נמחק ואת ST היה התמזג N- periplasmically פונה או C-Termini. מחיקת חלק periplasmic של OmpA מקטינה את מספר האינטראקציות בין הממברנה החיצונית ואת פפטידוגליקן וכתוצאה מכך יציבות הממברנה מובילה Hyper-vesiculation ^7. הגנום OmpA נשמרה בנוסף לבנות OmpA-ST הביע recombinantly להמתיק יציבות הממברנה ברוטו.

Protocol

1. הכנת פלסמידים

1. הכן פלסמיד (למשל, pET22) המכיל חלבון העוגן (OmpA) התמזגו לתחום הצמדה biorthogonal (המכונה בפרוטוקול זה כמו עוגן-ST), תג epitope (כגון 6xHis, תגי myc או דגל לטיהור והזדהות), תג לוקליזציה periplasmic, עמידות לאנטיביוטיקה, ומוצא מתאים של שכפול מבוסס על זן החיידקים הנבחר ^7.
   1. תמצית ה- DNA פלסמיד מתרבויות לילה באמצעות ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי בעקבות הפרוטוקול של היצרן.
2. כן פלסמיד (למשל, pACYC184) המכיל את האנזים / חלבון (PTE) להיות ארוז בתוך OMV התמזג תחום ההצמדה bioorthogonal משלים לזו של חלבון העוגן (המכונה בפרוטוקול זה כמו-SC אנזים), תג epitope, תג לוקליזציה periplasmic, עמידות לאנטיביוטיקה כי שונה פלסמיד החלבון העוגן, ואת orig המתאיםב של שכפול מבוסס על זן ⁷ החיידקים שנבחר.
   1. תמצית ה- DNA פלסמיד מתרבויות לילה באמצעות ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי בעקבות של פרוטוקול היצרן ^7.

2. דור של תרבות חיידק אריזת OMV

1. בידוד פלסמיד
   1. לטהר פלסמידים קידוד-SC האנזים לבנות העוגנת-ST בונה שורות תאי תחזוקה נפרדות באמצעות ערכת בידוד פלסמיד מסחרית לפי הפרוטוקול של יצרן ^7. קביעת ריכוז ה- DNA וטוהר ידי מדידת ספיגה ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר.
2. Co-טרנספורמציה
   1. בחר זן חיידק אשר זמין מסחרי כדי להקל ביטוי חלבון.
      הערה: BL21 (DE3) תאים נוצלו כאן. Lysogen T7 נדרש עבור ביטוי של המבנה עוגן-ST, אשר מסתמך על האמרגן T7 ו פולימראז T7 RNA עבור protביטוי עין. השימוש זני חיידקים אחרים דורש גם נוכחות של הגן T7 lysogen או שימוש פלסמיד מלבד pET22 ^7.
   2. לדלל DNA פלסמיד מטוהר לריכוזים טוחנים שווים אז להפוך אותם תאי חיידקיים מוסמך דרך או שינוי הלם חום או electroporation בעקבות הפרוטוקול של היצרן עבור התאים המוסמכים הנבחרים.
   3. פלייט טרנספורמציה תאים על אנטיביוטיקה המכילים לוריא- Bertani (LB) אגר צלחות בשתי אמפיצילין (pET22) ו chloramphenicol (pACYC184); הן בריכוזים סופי של 25 מיקרוגרם / מ"ל.
   4. מניחים את צלחת תרבות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לבודד שיבוטים רק המכילים פלסמידים שניהם.
      הערה: מושבות ששורדות מבחר אנטיביוטי תשמשנה את כל הכנות OMV בעתיד. אנטיביוטיקה (אמפיצילין ו chloramphenicol) תתווסף לכל ההתרבויות הנוזליות כדי לשמור על לחץ סלקטיבי להבטיח במעמד שני פלסמידים.

3. הפקת OMV

1. הרחבת המושבה
   1. לחסן 5 מיליליטר של תקשורת בתרבות (מרק מצוין בדרך כלל (TB) או LB) המכילה אנטיביוטיקה בריכוזים הנ"ל (שלב 2.2.3) עם מושבה אחת מצלחות הבחירה המתוארות 2.2.4.
   2. בצע 1: דילול פי 100 של תרבות המתנע הלילה לתוך צלוחיות תרבות מבולבלות.
      הערה: השתמש נפח התקשורת בין 250-500 מ"ל.
   3. שמירה על תרבות ב 37 ° C רועד ב 250 סל"ד על מנת להבטיח כי אוורור מספיק של התרבות מושגת.
2. אינדוקציה של כל פלסמיד
   1. אפשר תרבות החיידקים לגדול ל OD ₆₀₀ של 0.6-0.8, כ 3 שעות של צמיחה לאחר החיסון של בקבוק הצמיחה העיקרי.
   2. כדי לשפר את התשואה הסופית של שלפוחית ​​טיעון PTE-SC, בצנטריפוגה התרבות השלמה ב 7,000 XG במשך 15 דקות. Resuspend התא הגלול בתקשורת התרבות המחוממת מראש, טריה.
      הערה: זה optצעד ional מסייע להסיר כל OMV ריק שנמצאים התקשורת והתרבות לפני אינדוקצית PTE-SC.
   3. בצע פתרון המניה 20% של L-arabinose במים ולסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. פתרון L-arabinose חנות ב 4 ° C. במשך 2-4 שבועות.
   4. מוסיף את פתרון L-arabinose אל בקבוק התרבות לריכוז 0.2% סופי ליזום ייצור PTE-SC.
      הערה: זה עוזר לטעון מראש את המרחב periplasmic עם PTE-SC לפני קידום vesiculation מוגברת באמצעות אינדוקציה של מוטציה OmpA-ST.
   5. בצע פתרון 1 M איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) במים ולסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
      הערה: IPTG חייב לשמש מיד לאחר התייבשות. Aliquots של IPTG ניתן לאחסן קפוא במשך 3-6 חודשים ניתן להפשיר מיד לפני השימוש.
   6. הוספת IPTG לאחר תקופת דגירה 3 שעות נוספת לריכוז סופי של 0.5 מ"מ ליזום ייצור של OmpA-ST.
   7. אפשר המבוי הסתוםture לגדול במשך 8-14 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס תוך רעד.

4. טיהור OMV

1. הסרת חיידקים שלמים
   1. צנטריפוגה תקשורת תרבית החיידקים במשך 15 דקות ב 7000 XG ב 4 ° C עד גלולות חיידקים שלמים.
   2. למזוג, ולשמור, התקשורת את החלק העליון של צנטריפוגה פוסט תא הגלול נזהר לא להפריע תא גלול.
   3. חזור על שלבים 4.1.1 ו 4.1.2 עבור מחזור צנטריפוגה אחת נוספת על מנת להבטיח את כל החיידקים שלמים יוסרו מן התקשורת והתרבות וישלהקפיד למזוג ולשמור התקשורת.
2. הסרת אגרגטים חלבון
   1. בהמשך לטהר את התקשורת ותרבות חיידקים באמצעות מסנן הממברנה 0.45 מיקרומטר להסיר שיירי חיידקים וחומר סלולר גדול לא רצוי.
      הערה: השתמש חומר הממברנה תואם ביולוגית החלמה גבוה חלבון ספיחה נמוכה כגון אצטט תאית (CA) או polyvinylidene difluoride (PVDF). כרכים מסנן מזרק פחות מ -100 מ"ל ואמצעי אחסון ואקום מסנן יותר מ -100 מ"ל.
      1. לסנן מזרק, לצייר בינוני תרבות לתוך מזרק 10-50 מ"ל סטרילי. צרף 0.45 מיקרומטר מסנן כדי Luer סוף המזרק. לדכא בוכנה ולאסוף זרימה דרך בכלי חדש.
      2. כדי לשאוב מסנן, להעביר בינוני תרבות מנגנון סינון סטרילי. צרף יחידת ואקום משאבה או לשקוע aspirator כדי ליצור יניקה. העבר בינוני מסוננים כלי חדש.
3. בידוד של OMV באמצעות ultracentrifugation
   1. מוסיף את התקשורת והתרבות המסוננת לתוך צינורות צנטריפוגה נזהרו לאזן צינורות יריבים בצנטריפוגה.
   2. גלולה ב ~ 150,000 XG במשך 3 שעות ב 4 מעלות צלזיוס ultracentrifuge באמצעות הרוטור המקביל התאמה הן המכשיר וצינורות מנוצלים.
   3. למזוג תקשורת וההתרבות המדולדלת OMV מן גלולת OMV, נזהר שלא להפריע גלולת OMV, מייד עם השלמת oצנטריפוגה f כמאפשר גלולת OMV להישאר בתקשורת ירכך גלול צמצום התאוששות OMV.
      הערה: גלולה זו תהיה חום מעט בהתאם לכמות התחלתי של תרבות חיידקים עשוי או לא עשוי להיות גלוי על ידי עין. Aspirating התקשורת ישירות מהחלק העליון של הצינור צנטריפוגה היא גם אופציה תוך התחשבות שהתקשורת יותר יוסר OMV גלולה יותר טהור המדגם OMV הסופי יהיה.
   4. שמור את supernatant centrifuged עבור פיזור אור דינאמי מאוחר יותר בדיקות (DLS) על מנת לוודא כי חלקיקי OMV היו מתרוקנים לחלוטין מהתקשורת.
   5. להוסיף 0.5-1 מ"ל של בופר פוספט מסוננים סטרילית (PBS) pH 7.4 או 100 מ"מ N חומצה -Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic (צ 'ס) חיץ ב- pH 8.0 כדי גלולה OMV שמאפשר לו דגירה במשך 30 דקות ב RT. ודא כי הגלולה לא להתייבש.
      הערה: קצות כוח יוני פתרון, pH וטמפרטורה עלולה לגרום מסיסות מופחתת OMV ולקדם aggregation.
   6. בזהירות pipet פתרון OMV מטוהר מצינור צנטריפוגות, ערבוב בעדינות כדי להבטיח הגלולה כולה כבר solubilized.

5. אפיון OMV

1. השתמש בכל מעקב DLS או ננו-חלקיקים זמינות מסחרי תוכנות באות הפרוטוקולים של היצרן ספק ייחודיים לכל מכשיר כדי לקבוע התפלגות גודל OMV וריכוז חלקיקים.
   הערה: כאן, התפלגות גודל OMV וריכוז נקבע ניצול NanoSight LM10 מעקב Nanoparticle ו נ.ת.ע 2.3 תוכנת ניתוח.
   1. פתח את התוכנה.
   2. הפעל מיקרוסקופ ולנקות את כל המשטחים על היחידה מיקרוסקופ ומעקב ננו-חלקיקים.
   3. הוסף ~ 0.5 מ"ל של מדגם OMV ישירות בחלון התצוגה של מכשיר מעקב החלקיקים דרך Luer הולם עם מזרק 1 מ"ל סטרילי להיות בטוח כדי לכסות את חלון הצפייה כולו ללא הזרקת כל בועות אוויר לתוך המערכת.
   4. מקום tהוא ננו-החלקיקים לעקוב אחר יחידה על במת מיקרוסקופ ולהדליק את הליזר.
   5. לחץ על "לכיד" בתוכנה.
   6. התאם את המיקוד מיקרוסקופ הבמה כדי להמחיש את חלקיקי על ההווה במסך התצוגה המקדימה בחלון התוכנה.
   7. התאם את "תריס המצלמה" ו "מצלמת רווח" עד חלקיקים בהירים הם דמיינו בבירור על רקע כהה.
   8. התאם ללכוד משך זמן עד 60 שניות.
   9. לחץ על "שיא".
   10. כשתתבקש, קלט המדגם / טמפרטורה המכשיר, לתייג המדגם, ולשמור את הנתונים וידאו על השלמת כל נתקלים בתיקייה הייעודית המשתמש.
   11. שמור את כל פרמטרי הניתוח (סף זיהוי, לטשטש, אורך מסלול Min, גודל חלקיקים צפוי מינ ') על זיהוי אוטומטי' ולחץ על "רצף תהליך."
       הערה: עיין במדריך למשתמש עבור כיצד כל פרמטר יכול להיות מותאם באופן עצמאי לתוצאות ניתוח לכוונן.
   12. הפצת חלקיקי גודל חלקיקי שיא / mריכוז l כפי שנקבע על ידי התוכנה.
       הערה: טווח גודל הידרודינמית טיפוסי OMV היא בין 30-200 ננומטר עם ריכוז החלקיקים / מ"ל של ~ 10 x 10 ^8.
2. קביעת תכולת חלבון OMV
   1. השתמש SDS-PAGE תקן ופרוטוקולים כתמים מערביים להעריך טוהר OMV, ייצור אנזים, ואת יעילות crosslinking SC-ST ^7.
      הערה: יעילות Crosslinking לא תהיה 100% ^7.

6. אימות של אריזת האנזים

1. Assay פעילות PTE
   1. לבצע את כל מבחני אנזימטיות חיץ מתאים כגון 100 מ"מ צ'ס חיץ (pH 8) במהירות של 25 מעלות צלזיוס או קובט או מרובבים בצלחת 96/384 היטב.
   2. הוסף 5 μl של דילול 1: 1,000 של paraoxon במאגר צ'ס 90 μl של צ'ס ו -5 μl של OMV מטוהרים (~ 36-לקפל מרוכז לעומת ריכוז OMV נוכח התקשורת והתרבות).
      זהירות: Paraoxon הוא חומר הדברה רעילויש לטפל לפי יצרן והנחיות מוסדיות.
   3. קח קריאות ספיגות במרווחי זמן קבועים (כל 20 שניות ~ 2 hr זמן תגובה כולל) ב 405 ננומטר (ε = 18.1 מ"מ ^{-1 -1} סנטימטר) ועל 348 ננומטר (ε נקודת isosbestic = 5.4 מ"מ ^{-1 -1} סנטימטר) כדי לפקח על התקדמות התגובה של מוצר התמוטטות paraoxon chromogenic, p -nitrophenol.
      הערה: בערכי pH מעל 8 בצורת deprotonated הדומיננטית של p -nitrophenol קיימת המאפשרת ניטור מדויק ב 405 ננומטר. בכל פתרונות pH המורכב או אחרים התחתונים יש צורך לנצל את נקודת isosbestic של 348 ננומטר כמו צורות שונות של -nitrophenol p תהיינה נוכחות.
   4. חישוב מהירויות התגובה הראשונית על ידי קביעת השיפוע של החלק הליניארי של עקומות התקדמות משלב 6.1.3 להשוות את הכמות היחסית של PTE בכל מדגם, יעילות אריזה, וייצור PTE הכולל.
   5. בצע האנזימטית תקןפרוטוקולים assay כדי לקבוע K _M, V _{מקס החתול} k עבור OMV כמוס PTE.
      הערה: ניתוח Lineweaver-בורק יכול להיות מנוצל עבור קביעת פרמטרים קינטיים אלה שבהם y ליירט = 1 / V _max והשיפוע = K _M / V _{מקסימום} ^20.
2. המצע הטרנסממברני / דיפוזיה מוצרים.
   1. לבצע את ניתוח assay הקינטית אותו כמתואר בשלב 6.1 ניצול ריכוזים גוברים של טריטון X-100 ב חיץ צ'ס מן 0-3% לפי נפח.
      הערה: התוספת של טריטון X-100 לפונקציות OMV solubilized לשבש את bilayer השומנים המאפשר את התוכן של OMV שיהיה נגיש בקלות לפתרון התגובה.
   2. לחשב ולהשוות את מהירויות הראשונית בכל רמת טריטון X-100 כדי לוודא מעבר הטרנסממברני של מוצר המצע / שמציין שינוי מזערי פעילות אנזים (מירויות ראשוניות) לעומת אנזים פעילות in בהיעדר טריטון X-100. אם גידול משמעותי בפעילות האנזים הוא ציין בנוכחות טריטון X-100 סביר להניח כי המצע אינו מפוזר באופן חופשי לתוך OMV.
   3. פעילות אנזים חינם Assay (כמתואר לעיל בסעיף 6.1) בנוכחות של טריטון X-100 כדי לוודא פעילות אנזימים לא מעוכבת על ידי הפעיל השטח עצמו.
      הערה: אם הפעילות מושפעת במידה רבה על ידי Triton X-100, תוספים אלטרנטיביים כגון ספונינים או polysorbate השונה / שטח tween עשוי להיות מתאים יותר כדי לקרוע את קרום OMV.

7. אחסון OMV

1. קְפִיאָה
   1. aliquots המקום ~ 100 μl של OMV מטוהר ישירות לתוך חנקן נוזלי כדי להצמיד להקפיא את aliquots להיות בטוח שלא להטביע את הצלוחיות או ליצור קשר עם כל חנקן נוזלי מלאים עם המדגם עצמו.
      הערה: מטוהרים OMV ניתן הצמד קפוא ישירות למאגר כי נבחר solubilizing גלולה OMV במהלך purificatתהליך היון ללא cryoprotectants נוסף ⁷ צורך.
   2. אחסן את aliquots קפוא הצמד ב -80 מעלות צלזיוס.
   3. להפשיר aliquots קפוא משלב 7.1.1 ידי הצבתם ב RT להיות בטוח שלא לחמם את דגימות.
   4. לפני הכנת כל הדגימות לאחסון באופן זה לבצע את assay האנזים המתואר בשלב 6.1 השוואת מהירויות הראשונית לפני ואחרי הקפאה כדי לוודא כי אין אובדן משמעותי להקפיא להפשיר פוסט פעילות האנזים.
      הערה: חנות מטוהרים OMV ב 4 ° C אם הפחתה בפעילות האנזים הוא ציין עקב ההקפאה.
2. lyophilization
   1. Lyophilize את aliquots OMV המטוהר קפוא צמד שימוש בציוד lyophilization הזמין מסחרי ^21.
   2. חנות lyophilized aliquots ב RT במשך שבועות או ב -80 מעלות צלזיוס במשך חודשים רבים.
   3. להוסיף את אותו נפח של מים מטוהרים אל OMV lyophilized כמו לפני lyophilization ולתת לעמוד ב RT למשך 30 דקות רעננותם tהוא לדגום. מערבבים בעדינות בעת הצורך להיות בטוח שלא מערבולת או sonicate OMV.
   4. להוסיף אבקת OMV lyophilized ישירות Point-of-care עבור יישומים בהם / דילול לפני solubilization אינו הכרחי.

Results

ביטוי סימולטני של שני חלבונים רקומביננטיים, כפי שנדרש לצורך אסטרטגית אריזת OMV המפורטים בפרוטוקול זה, ניתן להשיג באמצעות מספר דרכים שונות. כאן, מערכת וקטור שני נוצלה עם מקורותיה התואמים של שכפול קלטות גן מושרים נפרדות. על מנת לתת הביטוי של PTE-SC לבנות עמוד שדרת פלסמיד המסחרי (pACY184) תוכנן לכלול קלטת גן arabinose מושרה ו תאום ארגינין רצף מנהיג לוקליזציה periplasmic ואחריו שורה של אתרי הגבלה ייחודיים כדי להקל שיבוט של גן האנזים בתור היתוך חלבון SC...

Discussion

פונקציות פרוטוקול זה להפגין נציג מכוון טכניקת אריזה שבה אנזים עניין מיוצר וארוז לתוך OMV ידי E. coli. כמו עם טכניקות מורכבות רבות ישנם אזורים מרובים, בם הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להתאים לשימוש ביישומים ייחודיים שונים, שחלקם מפורטים להלן. בעוד מנגנון של אנקפסולציה האריזה אנזים OMV ניתן להתאים לצרכים הספציפיים ישנם מספר צעדים בתוך פרוטוקול זה אשר הם קריטיים להצלחתו. ההסרה הראשונית של חיידק שלם ופסולת הסלולר היא בעל חשיבות משמעותית תשפיע על כל הניסיונות במורד הזרם ב quan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IPTG	כל		תמיד מכינים טרי או מקפיאים.
L-arabinose	כל		ניתן להכין מבעוד מועד ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
אמפיצילין	: כל		תוספת מיד לפני השימוש לאחר שהחומר מתקרר מספיק לאחר חיטוי.
כלורמפניקול	כל		תוסף מיד לפני השימוש לאחר שהחומר מתקרר מספיק לאחר חיטוי.
TB/LB Culture Media	כל		מדיית צמיחה אחרת ככל הנראה תעבוד באופן דומה.
Triton X-100	כל		אחד מפעילי שטח פוטנציאליים פוטנציאליים מתאימים.
צלוחיות תרבות מבולבלות	כל		הבלבול מקדם רמות גבוהות יותר של אוורור.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	מאגר אופטימלי המשמש לפירוק paraoxon (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	חומר רעיל מאוד שיש לטפל בו בזהירות ולהיפטר ממנו כראוי.
מסנן מזרק 0.45 ומיקרו; m	Thermo Scientific	60183-221 (30 מ"מ)	קוטר המסנן יהיה תלוי בנפח הדגימה. קרום קשירת חלבון נמוך הוא קריטי.
חממת שייקר	ניו ברונסוויק	אקסלה E24	טמפרטורה וערבוב מדויקים חיוניים לצמיחת חיידקים הניתנת לשחזור.
צנטריפוגה תרבית סורוול	תרמו סיינטיפיק	RC 5B PLUS	צנטריפוגת תרבית בנפח גדול (500 מ"ל) המסוגלת להכיל 7,000 x גרם.
סורוול אולטרה-צנטריפוגה	Thermo Scientific	WX Ultra 90	מסוגל לכוחות צנטריפוגליים & 150,000 x גרם.
רוטור אולטרה-צנטריפוגה	Thermo Scientific	AH-629	ודא שנעשה שימוש ברוטור ובצינורות המתאימים ושהכל מאוזן כהלכה.
צינורות אולטרה-צנטריפוגה שקופים במיוחד (25 x 89 מ"מ)	בקמן קולטר	344058	ודא שאין שברי מאמץ לפני השימוש ושהצינורות מאוזנים היטב.
ספקטרופוטומטר	Tecan	Infinite M1000	הכרחי לבדיקות קינטיות של אנזימים.
מעקב אחר DLS/חלקיקים	NanoSight	LM10	הכרחי להתפלגות גודל OMV וקביעת ריכוז.
BL21(DE3)	NEB		זן ביטוי חיידקי מתאים.
pET22	EMD Millipore	69744-3	ניתן להשתמש בפלסמידים אחרים במקום אלה.
pACYC184	NEB		ניתן להשתמש בפלסמידים אחרים במקום אלה.
ערכת מיצוי ג'ל	Qiagen	28704	ערכה לדוגמה.