Method Article

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ Coli Escherichia: עיצוב, ייצור טיהור

DOI:

10.3791/54458

⸱

November 16th, 2016

 ,  , 
1Center for Bio/Molecular Science & Engineering, Naval Research Laboratory, 2Department of Emergency Medicine, Indiana University of School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול לייצור, טיהור ושימוש בשלפוחיות ממברנה חיצוניות ארוזות אנזימים (OMV) המספק יציבות אנזימים משופרת ליישום ביישומים מגוונים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עניין גובר יישום טכניקות ביולוגיה סינטטיות לתכנת שלפוחית ​​קרום חיצונית (OMV) מוביל כמה יישומים מעניינים וייחודיים מאוד עבור OMV שבו חלקיקים מסורתיים מוכיחים קשים מדי לסנתז. נכון להיום, כל חיידקים גראם שליליים הוכחו לייצר אריזות הוכחת OMV של מגוון מטענים הכוללת מולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים החומר הגנטי. בהתבסס על המטענים המגוונים שלהם, OMV הם מעורבים בתהליכים ביולוגיים רבים, החלו מתקשורת תאי תאים כדי העברת גנים ואספקה ​​של גורמים ארסיים התלויים בו חיידקים מפיקים את OMV. רק לאחרונה חיידקי OMV להיות נגיש לשימוש על פני מגוון רחב של יישומים באמצעות פיתוח טכניקות לשלוט ואריזה ישירה של חלבונים רקומביננטיים לתוך OMV. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור, טיהור, ושימוש OMV ארוז אנזים מתן השתפר overaייצור ll של אנזים רקומביננטי, vesiculation גדל, ויציבות אנזים משופר. ניצול מוצלח של פרוטוקול זה יגרום ליצירת זן חיידקים אשר בו זמנית מייצר חלבון רקומביננטי ומפנה אותו אנקפסולציה OMV באמצעות יצירת זיקה סינטתית בין חלבון רקומביננטי חלבון עוגן הממברנה חיצוני. גם פרוטוקול זה מפרט שיטות לבידוד OMV מתרבויות חיידקים כמו גם טכניקות טיפול הולמות ודברים שיש להביא בחשבון בעת ​​התאמת פרוטוקול זה לשימוש עבור יישומים ייחודיים אחרים כגון: משלוח סמי תרופות, אבחון רפואי, וטיפול סביבתי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים כאן שיטה בעיצוב, ייצור, וטיהור של שלפוחית ​​הממברנה החיצונית חיידקי טעון אנזים (OMV). OMV הם קטנים, בעיקר unilamellar, proteoliposomes כי טווח בגודל 30-200 1,2 ננומטר. כל חיידקים גראם-שליליים גראם חיוביים כי נחקרו עד כה הוכיחו שחרור או OMV או שלפוחית תאיים (EV) מפני השטח שלהם 3,4. המנגנון המדויק שבו OMV מיוצר עדיין הובהר באופן מלא בשל אוכלוסיות חיידקים המגוונות אשר מפרישות אותם כמו גם את הפונקציות השונות, כי הם משרתים. OMV הוכח להובלת מגוון רחב של מטענים ממולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים ו החומר גנטי מגיש מגוון רחב של איתות מורכבת, טרנסלוקציה גן, ארסיות מתפקדת 5,6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת פלסמידים

  1. הכן פלסמיד (למשל, pET22) המכיל חלבון העוגן (OmpA) התמזגו לתחום הצמדה biorthogonal (המכונה בפרוטוקול זה כמו עוגן-ST), תג epitope (כגון 6xHis, תגי myc או דגל לטיהור והזדהות), תג לוקליזציה periplasmic, עמידות לאנטיביוטיקה, ומוצא מתאים של שכפול מבוסס על זן החיידקים הנבחר 7.
    1. תמצית ה- DNA פלסמיד מתרבויות לילה באמצעות ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי בעקבות הפרוטוקול של היצרן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי סימולטני של שני חלבונים רקומביננטיים, כפי שנדרש לצורך אסטרטגית אריזת OMV המפורטים בפרוטוקול זה, ניתן להשיג באמצעות מספר דרכים שונות. כאן, מערכת וקטור שני נוצלה עם מקורותיה התואמים של שכפול קלטות גן מושרים נפרדות. על מנת לתת הביטוי של PTE-SC לבנות עמוד שדרת פלסמיד המסחרי (pACY184) תוכנן לכלול קלטת גן arabinose מושרה ו תאום ארגינין רצף מנהיג לוקליזציה periplasmic ואחריו שורה של אתרי הגבלה ייחודיים כדי להקל שיבוט של גן האנזים בתור היתוך חלבון SC.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פונקציות פרוטוקול זה להפגין נציג מכוון טכניקת אריזה שבה אנזים עניין מיוצר וארוז לתוך OMV ידי E. coli. כמו עם טכניקות מורכבות רבות ישנם אזורים מרובים, בם הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להתאים לשימוש ביישומים ייחודיים שונים, שחלקם מפורטים להלן. בעוד מנגנון של אנקפסולציה האריזה אנזים OMV ניתן להתאים לצרכים הספציפיים ישנם מספר צעדים בתוך פרוטוקול זה אשר הם קריטיים להצלחתו. ההסרה הראשונית של חיידק שלם ופסולת הסלולר היא בעל חשיבות משמעותית תשפיע על כל הניסיונות במורד הזרם ב quan.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי המשרד למחקר ימי באמצעות כספי ליבה שניתנו למעבדת המחקר הימית.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
IPTGכלתמיד מכינים טרי או מקפיאים.
L-arabinoseכלניתן להכין מבעוד מועד ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
אמפיצילין: כלתוספת מיד לפני השימוש לאחר שהחומר מתקרר מספיק לאחר חיטוי.   
כלורמפניקול כלתוסף מיד לפני השימוש לאחר שהחומר מתקרר מספיק לאחר חיטוי.   
TB/LB Culture Mediaכלמדיית צמיחה אחרת ככל הנראה תעבוד באופן דומה.
Triton X-100כלאחד מפעילי שטח פוטנציאליים פוטנציאליים מתאימים.   
צלוחיות תרבות מבולבלותכלהבלבול מקדם רמות גבוהות יותר של אוורור.   
CHESFisher BioreagentsBP318-100מאגר אופטימלי המשמש לפירוק paraoxon (pH > 8).
ParaoxonChem ServiceN-12816חומר רעיל מאוד שיש לטפל בו בזהירות ולהיפטר ממנו כראוי.   
מסנן מזרק 0.45 ומיקרו; mThermo Scientific60183-221 (30 מ"מ)קוטר המסנן יהיה תלוי בנפח הדגימה. קרום קשירת חלבון נמוך הוא קריטי.
חממת שייקרניו ברונסוויקאקסלה E24טמפרטורה וערבוב מדויקים חיוניים לצמיחת חיידקים הניתנת לשחזור. 
צנטריפוגה תרבית סורוולתרמו סיינטיפיקRC 5B PLUSצנטריפוגת תרבית בנפח גדול (500 מ"ל) המסוגלת להכיל 7,000 x גרם.
סורוול אולטרה-צנטריפוגה Thermo ScientificWX Ultra 90מסוגל לכוחות צנטריפוגליים & 150,000 x גרם.
רוטור אולטרה-צנטריפוגהThermo ScientificAH-629ודא שנעשה שימוש ברוטור ובצינורות המתאימים ושהכל מאוזן כהלכה.
צינורות אולטרה-צנטריפוגה שקופים במיוחד (25 x 89 מ"מ)בקמן קולטר344058ודא שאין שברי מאמץ לפני השימוש ושהצינורות מאוזנים היטב.
ספקטרופוטומטר TecanInfinite M1000הכרחי לבדיקות קינטיות של אנזימים.
מעקב אחר DLS/חלקיקיםNanoSight LM10הכרחי להתפלגות גודל OMV וקביעת ריכוז.   
BL21(DE3)NEBזן ביטוי חיידקי מתאים.
pET22EMD Millipore69744-3ניתן להשתמש בפלסמידים אחרים במקום אלה.   
pACYC184NEBניתן להשתמש בפלסמידים אחרים במקום אלה.   
ערכת מיצוי ג'לQiagen28704ערכה לדוגמה.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
  2. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Outer Membrane VesiclesOMV PurificationEnzyme PackagingUltracentrifugationProtein DetectionParticle TrackingEnzyme Activity AssayBacterial CultureSynthetic BiologyVesicle Characterization

Related Articles