הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized

16K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54468

⸱

14 בספטמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Reconstructive Sciences, University of Connecticut Health Center, 2Department of Computer Science and Engineering, University of Connecticut, 3Department of Orthopaedic Surgery, University of Connecticut Health Center, 4Department of Orthopaedics, University of Rochester

במאמר זה

סיכום

בכתב יד זה, אנו מציגים פלטפורמת קריוהיסטולוגיה אוטומטית למחצה בעלת תפוקה גבוהה להפקת תמונות מרוכבות מיושרות של מדדי תגובה מרובים ממספר סבבים של הדמיה פלואורסצנטית על חלקים קפואים של רקמות מינרליות.

תקציר

יש צורך הולך וגובר בפנוטיפ והיסטופתולוגיה יעילים של מגוון רקמות. הצורך הזה בפנוטיפ ניכר בפרויקטים השאפתניים לשבש כל גן בגנום העכבר. קהילת המחקר זקוקה לאמצעים מהירים וזולים לפנוטיפ רקמות באמצעות היסטולוגיה. ניתוחים היסטולוגיים של רקמות השלד הם לרוב גוזלים זמן וכמותיים למחצה במקרה הטוב, ודורשים באופן קבוע פרשנות סובייקטיבית של שקופיות מאנשים מאומנים. כאן, אנו מציגים פרדיגמה קריוהיסטולוגית לפנוטיפ יעיל וזול של רקמות מינרליות. ראשית, אנו מציגים שיטה חדשה של הקפאה מיוצבת סרט המשמרת את המורפולוגיה של רקמות מינרליות. לאחר מכן חלקים אלה מודבקים בצורה נוקשה לשקופיות זכוכית ומצולמים שוב ושוב על פני מספר סבבי צביעה. לאחר מכן, התמונות המתקבלות מיושרות באופן ידני או באמצעות תוכנת מחשב כדי להפיק ערימות מורכבות של מספר תמונות בשכבות. הפרוטוקול מאפשר לוקליזציה משותפת של אותות מולקולריים רבים לתאים ספציפיים בתוך קטע נתון. בנוסף, ניתן לכמת את האותות הפלואורסצנטיים הללו באופן אובייקטיבי באמצעות תוכנת מחשב. פרוטוקול זה מתגבר על רבים מהחסרונות הקשורים להיסטולוגיה של רקמות מינרליות ויכול לשמש פלטפורמה לפנוטיפ בעל תפוקה גבוהה ותכולה גבוהה של רקמות שריר ושלד בתנועה קדימה.

מבוא

מחקר ביולוגי לעתים קרובות דורש phenotyping ביותר, אשר מזוהה לעתים קרובות עם איזשהו ניתוח היסטולוגית 1-3. צורך זה בולט עוד יותר עם ​​פרויקטים שאפתניים לשבש כל גן של העכבר הגנום 4. ניתוחים היסטולוגית אלו יכולים לנוע בין הערכת מורפולוגיה תאים ו / או תכונות אנטומיות לביטוי מיפוי של גנים ספציפיים או חלבונים בתאים בודדים. למעשה, אחת תרומות יסוד של היסטולוגיה לתחום הגנומיקה היא היכולת לקשר בין אות מולקולרית ספציפית לסוג באזור או תאים ספציפי.

שיטות מסורתיות של היסטולוגיה, במיוחד עבור רקמות שריר-שלד, הם בדרך כלל זמן רב ומייגע, מחייב לפעמים שבועות כדי לתקן, decalcify, סעיף, כתם, ותמונת הדגימה מכן לנתח את התמונות באמצעות פרשנות אנושית. ניתוח אותות מולקולריים מרובים, אם באמצעות אימונוהיסטוכימיה, באתרו hybridizatיון, או כתמים מיוחדים, דורשים סעיפים רבים, ואפילו דגימות מרובות לביצוע כראוי. בנוסף, מספר תגובות האפשריות אלה לא יכולים להיות שותף מקומי לאותו תא ולפעמים לא יכול להיות שותף מקומי לאזור מסוים בתוך דגימה נתונה. ככל שתחום גנומיקה epigenomics נע לתוך העידן הדיגיטלי, בתחום היסטולוגית חייב גם בעקבותיהם לספק תפוקה גבוהה ביותר, וניתוח אוטומטי של מגוון של אותות מולקולריים בתוך קטע היסטולוגית יחיד.

אכן, יש ביקוש עבור טכניקות היסטולוגית משופרות שיכול לשייך אותות מולקולריים מרובים תאים ספציפיים בתוך דגימה נתונה. לאחרונה, פרסמנו שיטת cryohistological תפוקה הגבוהה חדשה להערכת אמצעי מענה כמה בתוך קטע נתון מרקמות mineralized 5-14. התהליך כרוך לייצוב cryosection עם cryotape הקפוא, דבקות בסעיף המודבק נוקשה לשקופית מיקרוסקופ, וניצוח מספר סבבי מכתים והדמיה על כל מקטע. הסיבובים האלה של תמונות אז מיושרים באופן ידני או באמצעות אוטומציה המחשב לפני ניתוח התמונה (איור 1). כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים של תהליך זה ולספק דוגמאות בהן טכניקות אלה שיפרו את הבנתנו של תהליכים ביולוגיים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

האוניברסיטה של ​​ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים מרכז בריאות קונטיקט ושימוש אישר את כל הנהלים בעלי חיים.

קיבוע 1. והטבעה

  1. להרדימו באמצעות מחנק CO 2 או שיטות מאושרות אחרות.
  2. קציר את הרקמה של עניין (למשל, איבר, חוליות, וכו ') ומניחים 10% פורמלין נייטרלי שנאגרו על 4 מעלות צלזיוס עד שיתוקן כראוי. קח טיפול מיוחד כדי לשמור על מיקום האנטומי עקבי לפני הקיבוע. למשל, לתקן גפיים עם מפרקים על כיפוף עקבי, וסיבוב פנימי, וסיבוב חיצוני זוויות 11. בדרך כלל, לתקן גפי עכבר שלמים 1 - 3 ימים.
    זהירות: פורמלין רעיל יש לטפל במנדף כשהוא לבוש בציוד מגן אישי מתאים.
    הערה: מסגרת הזמן של קיבעון תלוי בגודל של הדגימה. אם הניסוי מאפשר, חיתוך ופתח את העצם ישפר קיבעון של תא המוח.דגימות מסוימות עשויות לדרוש קיבעון זלוף 15 למזער רקע ניאון (למשל, אותות ניאון קלושים בתוך מח עצם).
  3. העברת דגימות מן פורמלין 30% סוכרוז שנעשה 1x PBS ו דגירה במשך 12 - 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: לאחר וטופח במשך 12 - 24 שעות, דגימות אז יכולות להיות ממוקמות ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. שיטת אחסון זו מומלצת ניסויים שבהם החוקרים מתכוונים להטביע דוגמאות רבות באותו גוש אבל לא יכול לקצור את כל הדוגמאות להלן בעת ובעונה אחת (למשל, ניסויים עם נקודות זמן מרובים).
  4. הסר דגימות מן סוכרוז לנתח משם כל רקמה עודפת.
  5. ממלאים cryomold (גודל של עובש הוא תלוי בגודל הדגימה) חלק מהדרך עם קריו הטבעה בינוני. מניח מדגם עובש כך חיתוך מטוס עבור האזור של עניין מקביל עם החלק התחתון של התבנית.
    הערה: דוגמה למיקום רקמות ספציפיות והכיווןניתן למצוא באיור 2A - B.
  6. מניח את cryomold על פיסת קרח יבש עד שכבה דקה של קופא בינוני הטבעת קריו ובהמשך מתקן הדגימה במקום. מלא את נפח הנותרים של cryomold עם קריו הטבעה בינוני תוך שמירה על cryomold על גלולת הקרח היבשה.
  7. מניחים את cryomold במיכל המכיל מקורר-מראש בוטאן 2-מתיל ידי קרח יבש. לאחר דגימות קפואות לחלוטין, להסיר cryomolds ולהתנער 2-מתיל-בוטאן עודף. עוטפים בצלופן cryomolds ומניחים -20 ° C או -80 ° C במקפיא לאחסון.
    הערה: דוגמאות ניתן לייבש לאורך זמן כאשר הם מאוחסנים בינוני הטבעת קריו, במיוחד ב -20 ° C. אנו ממליצים אחסון של דגימות עבור יותר 1 - 2 חודשים קריו הטבעה בינוני ב -80 ° C או סוכרוז 30% ב -80 ° C (ראה שלב 1.3).

2. חתך רקמות Tape מיוצב

  1. הסר בלוקים הדגימה מהמקפיא ומכניסים cryostat עם הטמפרטורה להגדיר בין -20 ו -25 מעלות צלזיוס.
  2. הסר את הבלוק מן cryomold לקצץ משם קריו עודף הטבעה בינוני עם סכין גילוח.
  3. מקום קצת בינוני הטבעה קריו על גבי דיסק הדגימה ולאחר מכן יישרתי את הבלוק כך את פני השטח של דיסק הדגימה מקביל למשטח התחתון של הבלוק ובכך הקמת מטוס החיתוך הנכון עבור האזור של עניין.
  4. מניחים את הדיסק הדגימה ב cryostat ולאפשר עבור קריו הטבעה בינוני להקפיא.
  5. מניח את הדיסק הדגים על ראשו הדגימה ולהתאים את הראש כך קיצוצי להב מקבילים אל פני השטח של בלוק הדגימה.
  6. חתוך את הבלוק לרמה בתוך האזור של עניין לנער אותם שבבי מפני השטח של הבלוק.
  7. חותכים חתיכה של cryotape גדול מספיק כדי לכסות את האזור של עניין צמרמורת מראש ב cryostat.
    הערה: חתיכות מרובות ניתן לחתוך בגדלים עקביים מאוחסנות בתוך cryostב במהלך חתך.
  8. סור גיבוי לא חסיד מן cryotape ידי אחיזת הקלטת ידי הכרטיסיות לא דביק כסף / זהב באמצעות מלקחיים מכן למקם את הקלטת על הצד-הדביק לחסום למטה.
  9. הפעל לחץ קל על cryotape באמצעות הגלגלת (איור 2 ג).
  10. הפוך קטע (5 - 8 מיקרומטר) או באמצעות המנוע האוטומטי או גלגל חיתוך ידני של cryostat.
    הערה: זהו תרגול טוב כדי להחזיק את קצה cryotape כפי שהיא באה לבמה כך הסעיף אינו נופל מהבמה במהלך חתך (איור 2 ד).
  11. הנח את צד רקמות סעיף עד בשקופית מיקרוסקופ פלסטיק בתוך cryostat.
  12. להסיר את שקופית הפלסטיק מן cryostat ולאפשר מדיום הטבעת קריו להתמוסס כך בסעיף שומר על פני השקופית.
  13. חזור חתך עבור קטעי סדרה או אזורים אחרים בעלי עניין.
  14. בסיום, לאחסן את החלקים בתוך קופסת שקופיותt 4, -20 או -80 ° C בהתאם לאורך של האחסון הנדרשים ואת אמצעי המענה במורד הזרם. למשל, להשתמש בשקופיות כי הם הולכים להיות מוכתם עבור הפעילות האנזימטית (ראה 5.2 - 5.3) בתוך חודש אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס.

3. הדבקה של סעיפים כדי שקופיות מיקרוסקופ

  1. UV- לריפוי שיטת דבק.
    1. לייבל שקופית מיקרוסקופ.
      הערה: ואוטומציה מוגברת, דוגמיות שקופיות יכולות להיות מתויגות עם ברקודים.
    2. החל ירידה של דבק אופטי מופעל UV לשתי שקופיות זכוכית ולהשתמש בקץ שקופית פלסטיק כדי להפיץ שכבה דקה של דבק על פני השטח של שקופיות הזכוכית.
    3. חותכים את הכרטיסייה כסף / זהב ולהניח בצד רקמות סעיף מודבק על הדבק של השקופית הראשונה. החל את הסעיף על תנועה סיבובית מקצה אחד לקצה השני כדי למזער את ההיווצרות של בועות בפח מתחת הקלטת.
      הערה: השקופית הראשונה משמשת טרום להרטיב את התחתון של tהוא הסרט לפני הצבתו בשקופית השנייה (הקבועה) (שלב 3.1.4).
    4. הסר את הקטע מוקלט מתוך השקופית הראשונה ולמקם אותו על שכבת הדבק של השקופית השנייה (איור 3 א). שוב, לטפל כדי למנוע הילכדות של בועות.
      הערה: שלב זה לוקח בפועל אמן.
    5. לאחר המספר המתאים של קטעים לניסוי הנתון מושם על כל שקופית, לקנח הדבק העודף מן האזורים הסמוכים.
    6. בדוק כל מקטע מקרוב על בועות או סיבים מתחת הקלטת. בצע בדיקה זו תחת זכוכית מיקרוסקופ או מגדלת. אם יש חסימות, להסיר את החלק הפרט, להסיר את החסימות, ולאחר מכן החל מחדש אותו לשקופית זכוכית.
    7. ברגע זה נקבע כי אין מכשולים על פי הסעיפים המודבקים, במקום שקופיות מיקרוסקופ תחת אור UV השחור עבור 5 - 10 דקות כדי crosslink הדבק.
  2. שיטת דבק Chitosan.
    1. כן הe 1% דבק chitosan. כן פתרון חומצה אצטית על ידי המסת 0.25 מיליליטר של חומצה אצטית מרוכזת במי DI 100 מיליליטר (0.25% v / v). ממיסים 1 גרם של אבקת chitosan ב 100 מ"ל של תמיסת חומצה אצטית ומערבבים הפתרון O / N או עד שכל האבקה chitosan נמס.
      הערה: הפתרון הוא יציב ב RT.
    2. להפקיד ירידה של פתרון chitosan עבור כל מקטע שיונח בשקופית.
    3. חותך את כרטיסיית כסף / זהב של הקלטת ומניח בכל צד רקמות סעיף מודבק לעלות על (איור 3 א) הדבק. השתמש בזהירות רבה כדי למנוע מלכודת של בועות.
    4. לאחר שכל המקטעים ממוקמים בשקופית, להטות את השקף על אחד הקצוות הארוכים שלו ולגרור chitosan המוגזם לקצה התחתון באמצעות מלקחיים.
    5. מניחים שקופיות בכיוון הזה על גבי מגבת נייר בתוך קופסת שקופיות. כוח המשיכה לגרום chitosan עודף ליפול על מגבת, מניב שכבה שטוחה ואחידה של chitosan.
    6. PlaCe בתיבת שקופיות עם המכסה שלה שנפתח במקרר O / N לאפשר chitosan להתייבש.
      הערה: ראה טבלת 1 עבור השוואה בין שתי השיטות דבקות.

4. בקשה של סמני הפניה ל'מצגות

  1. כן פתרון סמן הפניה ידי המסת 50 μl של ירוק 50 μl של microspheres האדום 100 μl של מים. אחסן את הפתרון בחושך על 4 מעלות צלזיוס.
  2. מניחים 10 μl או 20 μl טיפ pipet לתוך התמיסה microsphere. הוסף טיפה קטנה של פתרון microsphere לכל קטע סמוך לאזור של עניין (איור 3 ג). היזהר שלא לקבל את microspheres בתוך האזור של עניין.
  3. יבש את השקופיות ב RT (מוגן מפני אור) למשך 30 דקות אם עיבוד השקופיות באותו יום. אם לא, במקום שקופיות בתיבת שקופיות ב 4 ° C.
    הערה: כל עוד הפתרון microsphere מתייבש לפני לחות השקופיות, MIcrospheres יישאר דבקה השקופיות במהלך סבבים רבים של מכתים / הדמיה.

5. סבבים רבים של מכתים

הערה: על ידי בחירת רצף תואם של הדמיה, מכתים, וצעדי reimaging, אפשר לזהות ושיתוף בתרגום אותות ביולוגיים רבים על אותו קטע הרקמה. כל סיבוב של reimaging הדמיה / מכתים / יש שיפותח עבור השאלה היסטולוגית בפרט. הדמיה / מכתים / רצף reimaging כרוך בדרך כלל רכישת אותות ניאון אנדוגני (למשל, ה- GFP הסלולר, צבעי מינרליזציה, in vivo בדיקות הדמיה) על הסיבוב הראשון של הדמיה ואחריו immunostaining מרובב פלורסנט סבבים רבים של כתמים הפעילות האנזימטית. לבסוף, בחלק ניתן מוכתמים באמצעות צבעים chromogenic (למשל, H & E, toluidine כחול, safranin O, וכו ') כדי להדגיש את מבנה רקמה. המוצגות בסעיף זה הם שיטות מותאמות אישית מותאמותפרוטוקולים זמינים מסחרי.

  1. Calcein כתמים כחולים על מינרלים שנצבר
    הערה: כתמי כחולי Calcein מניב משטח מינרליים עקבי כי ניתן ניתוח תמונה אוטומטית בניגוד בניגוד התערבות darkfield או הפרש הדמיה (DIC). הבעיה עם כתמים כחולים calcein הוא שהספקטרום פלורסנט חופפת טטרציקלין וסימון demeclocycline. לכן, אם המדגם מכיל תוויות מינרלים אלה, תמונה תוויות בסיבוב הראשון של הדמיה לפני צביעה עם כחול calcein.
    1. אם האותות אנדוגני בתוך הרקמה הם צילמו לפני צעד מכתים זה, להטביע את שקופיות מסבב הדמיה הקודם בצנצנת coplin מלא 1xPBS עד תלושי לכסות ליפול הרחק השקופיות. הסר ולייבש את תלושי לכסות.
    2. הכן 30 מ"ג / מ"ל של תמיסת כחול calcein ב 2% 3 NaHCO (מיוצר על ידי המסת 2 גרם NaHCO 3 ב 100 מ"ל H 2 O ולהתאיםing ל- pH של 7.4 עם HCl). Aliquot ולאחסן את הפתרון ב -20 ° C.
    3. לטבול את השקופיות בצנצנת coplin המכילות 1X PBS במשך 15 דקות כדי ללחלח את הסעיפים, אם לא כבר hydrated מן הסיבוב הקודם.
    4. הסר את השקופיות ולייבש אחורי וקצוות עם מגבת נייר.
    5. להחיל 100 - 500 μl של פתרון כחול calcein לכל שקופית דגירה במשך 10 דקות בתא לחות ב RT.
    6. יש לשטוף את השקופיות ב 1x PBS במשך 10 דקות עם 3 שינויים.
    7. החל ~ 200 μl של גליצרול 50% ב 1x PBS על כל שקופית הר להחליק את המכסה.
    8. הסר גליצרול עודף ולייבש התחתון של השקופיות.
  2. Tartrate עמיד phosphatase חומצה (TRAP) מכתים הפעילות האנזימטית
    הערה: TRAP מתבטאת סוגי תאים מרובים בשושלת hematopoietic כולל osteoclasts. מכתים TRAP המוצג כאן משתמש מצע phosphatase צהוב ניאון החומצה. אותות ניאון מסוימים יהיו overlap עם סט מסנן צהוב מותאם אישית כולל תוויות מינרליזציה טטרציקלין / demeclocycline, calcein כתם כחול, counterstain DAPI.
    1. לצלול שקופיות מסבב הדמיה הקודם בצנצנת coplin מלא PBS 1x עד תלושי לכסות ליפול הרחק השקופיות. הסר ולייבש את תלושי לכסות.
    2. הכן הצפת 1 על ידי המסת 9.2 גרם של נטול מים אצטט נתרן 11.4 גרם של מימית dibasic tartrate נתרן במים והבאת נפח סופי 1,000 מ"ל. התאם את ה- pH ל -4.2 עם חומצה אצטית קרחונית מרוכזת (~ 1.5 - 2 מיליליטר). אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד 12 חודשים.
    3. כן ההצפה 2 על ידי המסת 40 מ"ג של סודיום ניטריט במים והבאת הנפח הסופי עד 1 מיליליטר. אחסן את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס עד 1 בשבוע.
    4. ביום מכתים, להכין את החיץ התגובה על ידי ערבוב 7.5 מ"ל של חיץ 1 ו 150 μl של חיץ 2.
    5. החל למאגר התגובה בלי המצע לשקופיתים במשך 10 - 15 דקות כדי לאזן את הרקמה על pH הנמוך.
      הערה: ההיקף הטיפוסי הוא ~ 200 μl אבל צריך להיות גדול מספיק כדי לכסות את כל החלקים.
    6. לדלל את מצע phosphatase חומצת ניאון הצהוב בין 01:50 ו -1: 100 במאגר התגובה.
      הערה: דילול יהיה מוכתב על ידי פעילות TRAP בתוך המדגם.
    7. יוצקים את מאגר התגובה הנחה של שקופיות ולהחיל למאגר התגובה עם המצע ניאון צהוב על השקופיות.
    8. מניחים את השקופיות תחת אור שחור UV עבור ~ 5 דקות כדי להפעיל את המצע.
      הערה: זמן דגירה עשוי להשתנות בהתאם לפעילות TRAP בתוך המדגם.
    9. יש לשטוף את השקופיות ב 1x PBS במשך 10 דקות עם 3 שינויים.
    10. החל ~ 200 μl של גליצרול 50% ב 1x PBS על כל שקופית הר להחליק את המכסה.
    11. הסר גליצרול עודף ולייבש התחתון של השקופיות.
      הערה: מאגר TRAP חומצי יהיה decalcify הסעיפים. היתרון הנוסף של decalcification הוא כי צבעים מסוימים יהיו זמינים שוב מכתימים במורד זרם (למשל, תוויות מינרליזציה). לדוגמה, כתמים כחולים calcein יוסרו במהלך מכתים TRAP. לכן, DAPI counterstain ניתן הדמיה באפיק זה במהלך סבב שלאחר מכן.
  3. Phosphatase אלקליין (AP) פעילות אנזימטית מכתים
    הערה: סוגי תאים מרובים מעורב עם מינרליזציה כולל osteoblasts ו chondrocytes mineralizing להביע AP. המצע האדום המהיר בשימוש בפרוטוקול זה מעורר אות אדומה אדומה chromogenic פלורסנט שניהם. בגלל זה, המצע chromogenic יהיה להרוות אותות ניאון באזורים בהם המצע משקעים. לכן, עדיף לעשות את הכתם הזה לאחר הדמית אותות הניאון כי ניתן רווה ידי מצע AP.
    1. לצלול שקופיות מסבב הדמיה הקודם בצנצנת coplin מלא PBS 1x עד תלושי לכסות ליפול הרחק השקופיות. רמתיve ולייבש את התלושים לכסות.
    2. כן 1 M טריס ידי המסת 12.1 גרם של טריס ב 100 מ"ל מים. התאם ל- pH 9.5 עם 1 M NaOH.
    3. כן 1 M MgCl 2 hexahydrate ידי המסת 20.33 גרם של MgCl 2 ב 100 מ"ל מים ללא יונים.
    4. הכן 2 M NaCl ידי המסת 11.68 גרם NaCl ב 100 מ"ל מים ללא יונים.
    5. הכן 100x (20 מ"ג / מ"ל) פתרון המניות של מלח TR האדום מהיר על ידי המסת אבקת 1 גרם ב 50 מ"ל של מים ללא יונים. הפוך 100 aliquots ולאחסן μl ב -20 ° C.
    6. הכן 100x (10 מ"ג / מ"ל) Naphthol פתרון מניות פוספט AS-MX ידי המסת אבקת 500 מ"ג ב 50 מ"ל של N, dimethylformamide N. הפוך 100 aliquots ולאחסן μl ב -20 ° C.
    7. ביום מכתים, להכין את החיץ AP על ידי הוספת 1 ​​מ"ל של 1 M טריס, 0.5 מ"ל של 1 M 2 MgCl, 0.5 מ"ל של 2 M NaCl ולהביא את נפח סופי 10 מ"ל באמצעות מים ללא יונים (ריכוזים הסופי: 100 מ"מ טריס, 50 מ"מ MgCl 2, 100 מ"מ NaCl).
    8. מניחים ב APuffer על כל שקופית הדגירה בתא לחות במשך 10 דקות ב RT.
    9. הכן חיץ המצע AP ידי דילול 100x מניות של מלח TR האדום מהיר Naphthol AS-MX כדי 1x במאגר AP.
    10. יוצקים AP חיץ הנחה של שקופיות ולהחליף עם חיץ המצע AP. דגירה שקופיות עבור 5 - 10 דקות בתא לחות ב RT.
      הערה: זמן דגירה יהיה מוכתב על ידי פעילות AP של המדגם.
    11. לשטוף מחליק 3x ב 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    12. כיסוי הר מחליק עם פתרון counterstaining DAPI (1: 1,000 דילול DAPI ב 50% גליצרול ב PBS 1x).
  4. O toluidine כחול (TB) מכתים chromogenic
    הערה: בגלל כל השלבים הקודמים הם צלמו תחת הרכבה מימית זמנית 50% גליצרול / פתרון PBS, צעד chromogenic גם צלם בתנאים מימיים. עם זאת, הפתרון המכתים עשוי נוטה לדלוף החוצה במשך זמן. לכן, הוא הציע כדי שזה יקלוט את toluidine הכחול בהקדם האפשרי לאחר צביעה.
    1. לצלול שקופיות מסבב הדמיה הקודם בצנצנת coplin מלא מים ללא יונים עד תלושי לכסות ליפול הרחק השקופיות. הסר ולייבש את תלושי לכסות.
    2. לאחר הסרת מכסה מחליק, להחליף עם מים מתוקים דגירה השקופיות במשך 10 דקות לפחות כך מלחים PBS מוסרים מספיק מן הרקמה.
    3. כן פתרון TB 0.025% במי deionized.
    4. מניח את שקופיות פתרון TB עבור 1 - 5 דקות.
      הערה: זמן הדגירה תלוי העדפת המשתמש אבל צריך להישמר עקבי לאורך כל הדגימות.
    5. מקום שקופית לתוך צנצנת coplin עם מגלשות מים לשטוף deionized 3x עבור 5 דקות כל אחד.
    6. להחליק את המכסה הר עם 30% גליצרול מומס במים ללא יונים (NOT 1X PBS כמו זה יגרום הכתם ליץ החוצה מן הרקמה). הערה: הרכבה בינונית גליצרול ניתן להחליף עם סירופ פרוקטוז, אשר מסייע למנוע דיפוזיה של הכתם מן הרקמה. למכינים את הסירופ פרוקטוז, לפזר 30 גרם של פרוקטוז ב 10 מ"ל של מים וחום deionized ל -60 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה.

6. טיולי הדמיה מרובים

  1. טען את השקופיות במגשי מיקרוסקופ (איור 3D).
    הערה: מגשי קפיץ.
  2. הכנס את המגשים לתוך ערימה מגש של המיקרוסקופ סריקת שקופיות (איור 3E).
  3. לחץ על רשימת הפרופיל לטעון פרופיל עבור כל שקופית עם זמני חשיפה מתאימים לכל fluorophore. הקש על שם שקופית לתת שם לכל שקופית באופן ידני או לקבל את התוכנה לקרוא את הברקוד הניתן על תווית השקופיות. לחץ על לחצן הסריקה מקדימה התחלה לקחת תמונת תצוגה מקדימה של השקופית.
  4. הגדר את האזורים של עניין באשף זיהוי הרקמות ולשמור אותם לסיבובים הבאים של הדמיה. לאחר כל שקופית מוגדרת, להתחיל את תהליך הסריקה על ידי לחיצה על הכפתור התחל סריקה.
    הערה: המערכת יכולה להכיל עד 100 SLIdes בכל פעם.
  5. לאחר ההדמיה סיימה, לייצא את התמונות כל סיבוב ערוץ והדמית פרט .tif או קבצי jpg להרכבת תמונה וניתוח.

7. תמונה האסיפה

  1. שיטה ידנית באמצעות פוטושופ (או תוכנת עריכת תמונה דומה מסוגלת לייצר תמונות שכבתיות).
    1. פתח כל תמונת ערוץ פרט מפני כל סיבוב הדמיה.
    2. הרכב את התמונות הבודדות כאילו שכבות בתוך תמונה אחת מרוכבים. לשם כך, לחץ על השכבה בתוך לוח שכבה מתמונה אחת. לאחר מכן גרר את השכבה גבי תמונה אחרת. בפעולת גרור ושחרר זו תיצור שכבה חדשה בתמונה. בצע פעולה זו עבור כל תמונות אחרות. לחלופין, להשתמש בסקריפט (File> Scripts> קבצים טען לתוך ערימה ...) כדי להפוך את התהליך הזה על ידי טעינת קבצי תמונה מרובים כשכבות אותה במערך התמונה.
    3. לאחר כל תמונה מופיעה כנדבך בודד התמונה המורכבת, לחיצה כפולה על שם השכבה כדי לשנות את שם layers לפי הצורך להבחין הערוצים השונים.
    4. כדי לראות דרך כל שכבה וליצור תמונה מורכבת באמת, לשנות את מצב תערובת לכל שכבה מן "רגיל" ל "מסך" בתוך לוח השכבה.
      הערה: כדי להאיץ את הצעד הזה, לשנות בשכבה אחת להקרין, ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על השכבה, בחר "העתק סגנון שכבה", ואז לסמן את כל השכבות האחרות ובחר "דבק סגנון שכבה" כדי להחיל את סגנון המסך לצד השני שכבות.
    5. אם תרצה, להקטין את (ערך שינוי עד 10 - 40%) אטימות השכבה chromogenic (כלומר, toluidine כחול) כדי להמחיש טוב יותר את האותות פלורסנט דרך שכבת chromogenic.
      הערה: מיקרוסקופ סורק הרעפים בשימוש בפרוטוקול זה מחזיק את השקופיות על 3 קצוות, ובכך לצמצם את כמות הסיבוב שיכול להתרחש לשקופית במהלך כל סיבוב של הדמיה. לכן, זה הרבה יותר קל עבור המשתמש כדי ליישר את התמונות באופן ידני מבלי לסובב תמונות נגזרומ סיבובים שונים של הדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עבודה כללית עבור התפוקה הגבוהה, רבה-תמונת Cryohistology

איור 1 מייצג את זרימת העבודה הכללית המשמשת עבור טכניקה זו. היא כוללת מספר צעדים מן הקיבעון דרך מספר סבבי ההדמיה ולבסוף יישור תמונה / ניתוח. התהליך יכול לקחת קצת כמו בשבוע לצאת מן הקיבעון מדגם דרך 4 סיבובים של הדמיה, המהווה פחות זמן ממה שנדרש כדי decalcify אלה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן הצגנו פרוטוקול cryohistology מפורט לשתף למקם ולכמת כמה צעדים ביולוגיים על ידי יישור תמונות סבבים רבים של מכתים / הדמיה על קטע יחיד. השיטה התוותה באמצעות cryotape שימושית במיוחד כפי שהיא שומרת את המורפולוגיה של קשה רקמות סעיף (למשל, עצם וסחוס mineralized). בנוסף, רקמת מחולק היא דבקה בחוזקה לשקופית זכוכית, המאפשר סבבים רבים של מכתים / הדמיה של אותו סעיף; בניגוד לשיטות מסורתיות שם קטעי סדרה הם כל מוכתם בפרוטוקול אחר. באמצעות קטעי סדרה יכול להוות בעיה כאשר מנסים לשתף בתרג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחברים מבקשים להכיר במקורות המימון הבאים: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 ו-T90-DE021989.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% פורמלין ניטרליחומצי סיגמא אולדריץ'HT501128-4Lמספר ספקים זמינים. רעיל. ניתן להחליף ב-4% פרפורמלדהיד.
סוכרוזסיגמא אולדריץ'S9378מספר ספקים זמינים.
PBSSigma AldrichP5368מספר ספקים זמינים.
CryomoldsFisher ScientificFisherbrand #22-363-554ניתן להשתמש בגדלים שונים בהתאם לרקמה
CryomatrixThermo Scientific6769006ניתן להחליף בקריומטריה אחרת. עם זאת, שרפים מבוססי PVA/PEG עבדו הכי טוב בידיים שלנו.
2-מתיל-בוטאןסיגמא אולדריץ'M32631מספר ספקים זמינים.
CryostatLeica Biosystems3050sבמותגים/דגמים אחרים.
דיסק דגימהLeica Biosystems14037008587ניתן להחליף במותגים/דגמים אחרים.
להבי CryostatThermo Scientific3051835ניתן להחליף במותגים/דגמים אחרים.
CryotapeSection LabCryofilm 2C
RollerElectron Microscopy Sciences62800-46במותגים/דגמים אחרים.
שקופיות מיקרוסקופ פלסטיקמדעי מיקרוסקופ אלקטרונים71890-01ניתן להחליף במותגים/דגמים אחרים.
שקופיות מיקרוסקופ זכוכיתThermo Scientific3051ניתן להחליף במותגים/דגמים אחרים.
דבק אופטי נורלנד, 61דבק אופטי נורלנד אופטינורלנד, 61
אור שחור UVג'נרל אלקטריקF15T8-BLB
חומצה אצטית קרחוניתסיגמא אולדריץ'ARK2183מספר ספקים זמינים.
ChitosanSigma AldrichC3646מספר ספקים זמינים.
מיקרוסקופים אדומים InSpeckThermoFisher ScientificI-14787
InSpeck green microspheresThermoFisher ScientificI-14785
Calcein BlueSigma AldrichM1255מספר ספקים זמינים.
CalceinSigma AldrichC0875 מספר ספקים זמינים.
קומפלקס אליזריןסיגמא אולדריץ'A3882 מספר ספקים זמינים.
דמקלוציקליןסיגמא אולדריץ'D6140 מספר ספקים זמינים.
NaHCO3Sigma AldrichS5761מספר ספקים זמינים.
גליצרולסיגמא אולדריץ'G5516מספר ספקים זמינים.
ELF 97 מצע פוספטאז חומצה פלואורסצנטית צהובהThermoFisher ScientificE-6588
DAPIThermoFisher Scientific62247מספר ספקים זמינים. ניתן להחליף ב-Hoechst 33342 או בצבעים גרעיניים אחרים.
TO-PRO-3 (כתם נגד גרעיני Cy5)ThermoFisher ScientificT3605
Propidium IodideThermoFisher ScientificR37108מספר ספקים זמינים.
נתרן אצטט נטול מיםSigma AldrichS2889מספר ספקים זמינים.
נתרן טרטרט דו-בסיסי דיהידרט סיגמא אולדריץ'T6521מספר ספקים זמינים.
נתרן ניטריטסיגמא אולדריץ'S2252מספר ספקים זמינים.
TrisSigma Aldrich15504מספר ספקים זמינים.
MgCl2 hexahydrateSigma AldrichM9272מספר ספקים זמינים.
NaClSigma AldrichS7653מספר ספקים זמינים.
מהיר אדום TR מלחסיגמא אולדריץ'F8764מספר ספקים זמינים. ניתן להחליף גם בערכות מצע אחרות כגון Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX סיגמא אולדריץ'N4875מספר ספקים זמינים.
N,N dimethylformamideSigma AldrichD158550מספר ספקים זמינים.
טולואידין כחול OSigma AldrichT3260מספר ספקים זמינים.
Axio Scan.Z1Carl Zeiss AGAxio Scan.Z1ניתן להשתמש גם בסורקים ליניאריים או אריחים אחרים.
סט מסנני DAPIChroma Technology Corp.49000
סט מסנני CFPChroma Technology Corp.49001
סט מסנני GFPChroma Technology Corp.49020
סט מסנני YFPChroma Technology Corp.49003
סט מסננים צהוב מותאם אישית (ELF 97)Chroma Technology Corp.מנהג; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
TRITC סט מסנניםChroma Technology Corp.49004
Cy5 סט מסנניםChroma Technology Corp.49009
CryoJane מערכת העברת קלטותמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית62800-10מספר ספקים זמינים.
CryoJane קלטת חלונותאלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה62800-72מספר ספקים זמינים.
CryoJane דבק שקופיות אלקטרוניםמדעי מיקרוסקופיה62800-4Xמספר ספקים זמינים.
ניתן להחליף את ניתן להחליף את

מקורות

  1. Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
  2. Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
  3. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).
  4. Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
  5. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
  6. Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
  7. Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
  8. Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
  9. Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
  10. Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
  11. Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
  12. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
  13. Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).
  14. Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
  15. Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
  16. Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
  17. Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
  18. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חתכים קפואים מיוצבים בסרט דבקדבק להקשיה תחת UVדימוי של חתכים סדרתייםכימות אות פלואורסצנטימיקרוסקופ לסריקת שקופיותיישור סימני ייחוספנוטיפואינג בקיבולת גבוההניתוח רקמות של מערכת השלד והשרירים
תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.