מאמר שיטה

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות

DOI:

10.3791/54488

⸱

28 בנובמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Center for Quantitative Sciences, Vanderbilt University School of Medicine, 3Department of Cancer Biology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והכימות של רנ"א קטן של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המגוון של RNAs ללא קידוד קטן (Srna) היא מתרחבת במהירות ותפקידיהם בתהליכים ביולוגיים, כולל ויסות הגנים, הם מתעוררים. הדבר המעניין ביותר, sRNAs הם גם מצאו מחוץ לתאים ו נמצאים ביציבות בכל נוזלים ביולוגיים. ככזה, sRNAs התאי מייצג סוג רומן של סמנים ביולוגיים למחלות קרובות לוודאי מעורב איתות תא ורשתות תקשורת בין תאית. כדי להעריך את הפוטנציאל שלהם לשמש כסמנים ביולוגיים, sRNAs ניתן לכמת בפלסמה, בשתן, ונוזלים אחרים. אף על פי כן, כדי להבין את ההשפעה מלאה של sRNAs תאי כאותות האנדוקרינית, חשוב לקבוע אילו ספקים מעבירים והגנה אותם הנוזלים ביולוגיים (למשל, פלזמה), אשר תאים ורקמות לתרום ברכות Srna תאיות, ותאים ורקמות מסוגלות קבלה וניצול Srna התאי. כדי להשיג מטרות אלו, חשוב לבודד אוכלוסיות טהורות מאוד של ספקים תאייםעבור פרופיל וכימות Srna. אנחנו הוכחנו בעבר כי ליפופרוטאינים, במיוחד ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL), להעביר מייקרו RNA הפונקציונלי (מירנה) בין תאים ו- HDL-miRNAs הם שינו באופן משמעותי מחלה. כאן, פרט לנו פרוטוקול חדש אשר מנצל בידוד HDL בד בבד עם ultracentrifugation צפיפות שיפוע (DGUC) ומהר-חלבון נוזלי כרומטוגרפיה (FPLC) להשיג HDL טהור מאוד עבור פרופיל במורד וכימות של כל sRNAs, כולל miRNAs, הן באמצעות גבוהה רצף -throughput וגישות PCR בזמן אמת. פרוטוקול זה יהיה משאב יקר ערך עבור החקירה של sRNAs על HDL.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA הקטן ללא קידוד התאי (sRNAs) מייצג סוג חדש של סמנים ביולוגיים למחל מטרות טיפוליות פוטנציאליות להקל סביר תא אל תא תקשורת 1. הסוג למד הנרחב ביותר של Srna הוא מייקרו-רנ"א (מירנה) שהם כ 22 nts באורך מעובדים מצורות מבשרות עוד תעתיק עיקרי 2. miRNAs הודגם שלאחר יעתיק לווסת ביטוי גנים באמצעות דיכוי תרגום חלבון והאינדוקציה של שפלת mRNA 2. אף על פי כן, miRNAs הוא רק אחד מסוגים רבים של sRNAs; כמו sRNAs ניתן ביקע מן tRNAs הורה (sRNAs הנגזרות tRNA, TDR), RNAs גרעיני קטן (Srna הנגזרות sRNAs, sndRNA), RNAs nucleolar קטן (snoRNA הנגזרות sRNAs, snRNA), RNAs ריבוזומלי (rRNA הנגזרות sRNAs, RDR RNAs, Y) (yDR), ו RNAs השונה אחרת 1. הנה כמה דוגמאות של sRNAs הרומן האלה דווחו לתפקד דומה miRNAs; לעומת זאת, פו הביולוגיnctions של רבי sRNAs אלה עדיין לא נקבע, אף תפקידי ויסות גנים צפויים 3-6. הדבר המעניין ביותר, miRNAs ו sRNAs אחרים נוכחים ביציבות בנוזלי תאיים, כולל רוק, פלזמה, שתן, ומרה. sRNAs התאי מוגן סביר מן RNases דרך התקשרותן עם שלפוחית ​​תאית (EV), ליפופרוטאינים, ו / או מתחמי ribonucleoprotein תאיים.

בעבר, דיווחנו ליפופרוטאינים כי, כלומר ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL), miRNAs תחבורה בפלסמה 7. במחקר זה, HDL בודדו בשיטה סדרתית של ultracentrifugation צפיפות שיפוע (DGUC), כרומטוגרפיה נוזלית מהיר חלבון (סינון ג'ל כרומטוגרפיה בגודל הדרה, FPLC), ו כרומטוגרפיה זיקה (אנטי-אפוליפופרוטאין AI (apoA-לי immunoprecipitation) 7). שימוש בשני מערכים בצפיפות נמוכה בזמן אמת מבוססי PCR מבחני מירנה בודדים, רמות מירנה כומתו על HDL מבודד לרפאעמך ונושאים hypercholesterolemic 7. בגישה זו, הצלחנו פרופיל miRNAs ולכמת miRNAs הספציפי בהכנות HDL טהורות מאוד. מאז 2011, קבענו כי למרות כרומטוגרפיה זיקת משפר טוהרת HDL, רווית נוגדן מגבילה במידה ניכרת תשואה, והוא יכול להיות עלות אוסרני. נכון לעכשיו, הפרוטוקול שלנו ממליץ על שיטת טנדם רציפי שני שלבים של DGUC ואחריו FPLC, שיוצרים גם דגימות HDL באיכות גבוהה עבור בידוד RNA למטה זרם וכימות Srna. בשל ההתקדמות רצף תפוקה גבוהה של sRNAs (sRNAseq), למשל, miRNAs, והגברת המודעות של מעמדות אחרים שאינם מירנה Srna, sRNAseq הוא המדינה- of-the-art הנוכחי פרופיל מירנה Srna. ככזה, הפרוטוקול שלנו ממליץ miRNAs לכימות sRNAs אחר על דגימות HDL באמצעות sRNAseq. אף על פי כן, RNA הכולל מבודד HDL יכול לשמש גם לכמת miRNAs פרט sRNAs אחר או לאמת תוצאות sRNAseq באמצעות בזמן אמת PCRpproaches. כאן אנו מתארים בפרוטרוט פרוטוקול לאיסוף, טיהור, כימות, ניתוח נתונים, ואימות של sRNAs HDL טהור מאוד.

המטרה הכללית של מאמר זה היא להוכיח את ההיתכנות ואת תהליך של כימות Srna ב- HDL טהור מאוד מבודד מפלסמה אנושית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טיהור HDL (~ 5.5 ימים)

  1. צפיפות-Gradient ultracentrifugation (DGUC, ~ 5 ימים)
    1. להוסיף 90 μL של 100x ואנטי אוקסידנטים עד 9 מיליליטר של פלזמה מבודדת דם ורידים טרי.
    2. התאם צפיפות פלזמה עם KBR מ 1.006 גרם / מ"ל ​​1.025 גרם / מ"ל ​​ידי הוספת 0.251 גרם KBR עד 9 מ"ל של פלזמה משלב 1.1.1 (0.0278 גרם / פלזמה מ"ל KBR). Rock the פלזמה עד שכל מלח מתמוסס בטמפרטורת החדר ומעבירים ultracentrifuge צינורות ולהבטיח את כל הבועות עליית הדף.
    3. לכופף את קצה מחט 18-G 90 ° 1 ס"מ מהקצה, הצד שיפוע כלפי מעלה. באמצעות מזרק ואת המחט 18-מד, למקם בזהירות 3 מ"ל של תמיסת כיסוי # 1 על פלזמה (טבלה 1).
      הערה: המחט הכפופה מבטיחה כל VLDL / IDL, LDL, HDL ו מוסרים ללא ערבוב עם שכבת העל.
    4. הסר את רוב הבועות בחלק העליון, עוזב 2 - שטח מ"מ 3 מ המניסקוס לחלק העליון של הצינור carefully ומקום צינורות דליי SW-40Ti.
    5. לשקול אחד מהסלים (עם כמוסות) על שיווי משקל, בדיוק לאזן עם הדלי ההפוך (דלי + כובע): # 1 עד 4 #, # 2 עד 5 # ו- # 3 עד 6 #.
      הערה: דליים אלה חייבים להיות מאוזנים מתאימים בכל העת.
    6. מניחים הרוטור ultracentrifuge (רשימת חומרים). צנטריפוגה ב 274,400 XG במשך 24 שעות ב 4 ° C עם בלם ביניים 4 #.
    7. מוציאים בזהירות דליים מן הרוטור את הצינורות מן הדליים.
    8. מוציא בזהירות 2 מיליליטר מן השכבה העליונה של השכבה באמצעות מזרק ומחט מכופף. זה יהיה חלק VLDL / IDL אשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס.
    9. לאחר הסרת חלק VLDL / IDL, לאסוף את הנותרים 7 מ"ל של המדגם (פלזמה) ולמקם אותו לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. תביאו את הנפח של המדגם עד 9 מ"ל עם # 2 פתרון כיסוי (טבלה 1).
    10. התאם את צפיפות מדגם מ 1.025 גרם / מ"ל ​​1.080 גרם / מ"ל ​​עם KBR באמצעותכ 0.746 גרם KBR במדגם 9 מ"ל או 0.0828 גרם / מ"ל ​​KBR של המדגם. נער בעדינות את המדגם עד שכל KBR נמס (כ 20 דקות) ומעבירים ultracentrifuge צינור תוך בועות הבטחת עליית הדף.
    11. עם מזרק ומחט, למקם בזהירות 3 מ"ל של תמיסת כיסוי # 3 על המדגם (טבלה 1). השאיר 2 - 3 מ"מ שטח מ המניסקוס לחלק העליון של הצינור.
    12. הסר את רוב בועות הנותרות בראש הצינור ומקום צינורות ultracentrifuge ומלאו בזהירות בדליי SW-40Ti.
    13. לשקול אחד מהסלים (עם כמוסות) על שיווי משקל, בדיוק לאזן עם הדלי + כובע הפוך, כמו 1.1.5.
    14. מניחים הרוטור ultracentrifuge (ראה רשימה של חומרים). צנטריפוגה ב 274,400 XG במשך 24 שעות ב 4 ° C עם בלם ביניים 4 #.
    15. מוציאים בזהירות דליים מן הרוטור את הצינורות מן הדליים.
    16. מוציא בזהירות 2 מיליליטר מן השכבה העליונה של השכבה באמצעות מזרק ולהיותמחט NT. זה יהיה חלק LDL אשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס.
    17. לאחר הסרת חלק LDL, לאסוף את דגימת המשוער 7 מ"ל של הנותרים (פלזמה) ולמקם אותו לתוך צינור חדש 15 מ"ל חרוטי. תביאו את הנפח של המדגם (פלזמה) עד 9 מ"ל עם 1.080 גרם / מ"ל פתרון # 4 (טבלה 1).
    18. התאם את צפיפות מדגם מ 1.080 גרם / מ"ל ​​1.30 גר '/ מ"ל ​​עם KBR באמצעות 3.33 גרם KBR ב 9 המדגם מ"ל (פלזמה) או 0.37 גרם KBR לכל מ"ל של המדגם. רוק או מעט להתסיס את המדגם עד שכל KBR (מלח) הוא מומס ולהעביר ultracentrifuge צינור.
    19. עם מזרק ומחט, למקם בזהירות 3 מ"ל של תמיסת כיסוי # 5 על המדגם (טבלה 1).
    20. הסר את רוב בועות הנותרים בראש הצינור, והשאיר חלל 2- 3 מ"מ המניסקוס לחלק העליון של הצינור ובזהירות והמקום צינורות ultracentrifuge מולא בדליים SW-40Ti.
    21. לשקול אחד מהסלים (עם כמוסות) על שיווי משקל, בדיוק לאזן עם הדלי + כובע הפוך, כמו 1.1.5.
    22. מניחים הרוטור ultracentrifuge (ראה רשימה של חומרים). צנטריפוגה ב 274,400 XG במשך 48 שעות ב 4 ° C עם בלם # 4.
    23. מוציאים בזהירות דליים מן הרוטור את הצינורות מן הדליים.
    24. מוציאים בזהירות כ 2 מ"ל מן השכבה העליונה של שכבת באמצעות מזרק ומחט מכופף. זהו חלק HDL, אשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: בעקבות HDL DGUC ניתן dialyzed להסיר את פתרונות high-מלח.
    25. כדי dialyze, למקם את החלק היחסי HDL שנאסף בתוך שרוול דיאליזה אטומה (10,000 מגוואט חתוכים) ו dialyze לילה ב 1 ליטר 1x PBS. חיץ דיאליזה שינוי (PBS 1x) 3 פעמים 24 שעות. הפרעות עדינות של PBS עם ומערבבים ברים מגנטי תשפרנה דיאליזה.
    26. קביעת ריכוז החלבון של DGUC-HDL בשיטת BCA 8.
  2. Fast-חלבון נוזלי Chromatography (FPLC) או כרומטוגרפיה בגודל הדרה (~ 6 שעות)
    1. סנן 1.2 מ"ג DGUC-HDL (החלבון הכולל) בשנת 500 μL דרך פילטר 0.22 מיקרומטר מיקרו-צנטריפוגלי (ראה רשימה של חומרים), מיד לפני ההזרקה.
      הערה: כרטיס סינון נוסף של מדגם DGUC-HDL דרך פילטר 0.45 מיקרומטר מיקרו-צנטריפוגלי לפני המסנן 0.22 מיקרומטר עשויה להידרש כמה דוגמאות.
    2. אסוף מדגם DGUC-HDL המסונן, לטעון את מזרק הזרקת FPLC (מילוי), ולהבטיח שאין בועות בתוך המזרק לפני ההזרקה לתוך FPLC.
    3. הגדר את קצב זרימת FPLC 0.3 mL / min עם הגבלת לחץ על 2.6 מגפ"ס. לאזן עמודות עם 0.2 כרכים עמודה (כ 15 מ"ל) של חיץ, לפני לדגום ההזרקה. להזריק את המדגם עם 3 מ"ל של חיץ לתוך המכשיר FPLC (לולאה הזרקה) ולהתחיל את הריצה. אסוף 1.5 שברי מיליליטר עבור סכום כולל של 72 שברים.

2. RNA קטנים תפוקה גבוההרצף (sRNAseq, ~ 9 ימים)

  1. בידוד RNA (~ 1 יום)
    1. זהה את שברי FPLC המתאימים DGUC-HDL ידי קביעת רמות כולסטרול כלליות באמצעות ערכת colorimetric פי הוראות היצרן. שימוש זה הגדרת FPLC, מצפה למצוא 6 - 7 שברים FPLC המכיל DGUC-HDL.
    2. לאסוף את כל נפח (כ 8 -1 0 מ"ל מאגר של 1.45 כרכים מ"ל שבריר) מתוך שברים DGUC-HDL FPLC ולהתרכז באמצעות 10 kDa MW חתוכים יחידות מסנן צנטריפוגלי ב 4000 XG עבור 1 ש 'ב 4 מעלות צלזיוס או עד להתרכז HDL הוא כ 100 μL.
    3. אסוף את תרכיז HDL ולכמת ריכוז החלבון הכולל HDL בשיטת BCA 8.
    4. קבע את הריכוז הגבוה ביותר של חלבון הכולל HDL, עד 1 מ"ג, שניתן aliquoted מכל מדגם במערכה. לדוגמה, לבודד RNA מאותה כמות החלבון הכולל HDL עבור כל דגימה.
    5. בצע בידוד RNA באמצעותפרוטוקול שונה (ראה רשימה של חומרים).
      1. להוסיף 10x היקף מגיב תמוגה פנול (ראה רשימה של חומרים) מדגם ו מערבולת דקות 1.
      2. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      3. הוספת כלורופורם (20% של נפח מגיב תמוגה פנול המשמש בשלב 2.1.5.1) ולנער במרץ למשך 15 שניות.
      4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 - 3 דקות.
      5. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C בצנטריפוגה בקירור.
      6. מעבירים את השלב מימית העליון לצינור חדש, הימנעות הביניים.
      7. הוספת נפח 1.5x של אתנול 100% עד שלב המערבולת המימי דקות 1.
      8. חנות דגימות עבור 1 שעות לפחות או לילה ב -80 ° C.
      9. המשך עם פרוטוקול בידוד RNA באמצעות עמודות מיניות ספקו.
      10. Elute עם 30 μL של RNase ללא H 2 O. ראשית להוסיף 15 μL של H 2 O ישירות frit, ספין במהירות נמוכה (2,000 XG) במשך 2 דקות, ולאחרואז לסובב במהירות גבוהה (מקסימום) עבור 1 דקות. חזור על פעולה זו עם 15 μL נוסף של H 2 O.
    6. מיד להמשיך לדור או חנות הספרייה Srna ב -80 מעלות צלזיוס.
  2. דור הספרייה (~ 6 שעות)
    1. הכן ספריות cDNA Srna באמצעות פרוטוקול ערכת הספרייה הדור Srna, לפי הוראות היצרן עם שינוי אחד הגברה PCR כמפורט להלן.
      1. הכן את mastermix PCR על הקרח המכיל 0.5 μL DNase / RNase ללא H 2 O, 15 μL PCR מיקס (PML) ו 1 μL RNA PCR פריימר (RP1) לדגימה (כולל% נוספים 10 pipetting שגיאה).
      2. להוסיף 16.5 μL של PCR לערבב מדגם (cDNA).
      3. הקצאת מספר ברקוד מדד / מדגם עבור ריבוב ולהוסיף 1 מדד μL PCR פריימר (למספר המקביל) המדגם.
      4. בצע סיבוב מהיר באמצעות microfuge.
        הערה: נפח בסך הכל צריךעכשיו להיות 30 μL לדגימה.
      5. בצעו את תנאי רכיבה על אופניים הגברה PCR כמפורט בלוחות 2 ו -3.
  3. גודל בחר Srna הספרייה להסיר מתאם: מתאמים (~ 1.5 שעות)
    1. בצע גודל בחירת ספרייה באמצעות בורר גודל DNA אוטומטית לפי הוראות יצרן עם פרמטרי הגודל הבאים: יעד: 156 נ"ב, התחל: 135 נ"ב, סוף: 177 נ"ב, טווח דגל: Broad.
  4. DNA Clean Up (~ 0.5 שעות)
    1. לנקות שנבחר גודל Srna cDNA פי הוראות היצרן.
    2. Elute נקי ומרוכז cDNA Srna עם 2 x 7 μL DNase / RNase ללא H 2 O.
  5. לכמת ולהעריך Srna cDNA הספרייה היבול ואיכותו (~ 1 שעות)
    1. להעריך Srna cDNA הספרייה איכות וגודל באמצעות שבב DNA רגישות גבוהה על bioanalyzer (רשימת חומרים) לפי manufactההוראות של urer.
    2. לכמת את ריכוזי הספרייה Srna cDNA בודדים באמצעות assay DNA רגישות גבוהה (רשימת חומרים), לפי הוראות היצרן.
      הערה: מומלץ לקיים את כל דגימות עם מדדים שונים שיופעל על אותו נתיב של התא זרימה במידת האפשר. אם יותר נתיב אחד נדרש, לערבב דגימות במקרה ובקר כראוי.
  6. תפוקה גבוהה רצף Srna (~ 7 ימים)
    1. פרט ברכה באינדקס ספריות Srna מבוסס על ריכוזי equimolar.
    2. מסך ונקווה ספריות Srna עבור איכות באמצעות שבב DNA רגישות גבוהה על bioanalyzer ולקבוע ריכוז ה- DNA ספריה כמו 2.5.1 - 2.5.2.
    3. בצע PCR כמותי (qPCR) של תוכן מתאם כדי להבטיח עומק רצף המתאים באמצעות ערכת כימות qPCR הספרייה הייצור כפי לפי הוראות היצרן (רשימת חומרים).
    4. בצע רצף באמצעות קריאה אחת, 50 בפרוטוקול עמ 'כדי להגיע לעומק של כ 20 - 25 M קורא / המדגם, לפי הוראות היצרן.

3. ניתוח נתונים (~ 1 יום)

  1. השתמש bcl2fastq2, בהתאם להנחיות מדריך למשתמש, לקבצים fastq גלם preprocess של דגימות demultiplexed (רשימת חומרים).
  2. השתמש Cutadapt לקצץ מתאמי 9 ולהסיר קורא <16 נוקלאוטידים (NTS) באורך, בהתאם להנחיות מדריך למשתמש (רשימת חומרים).
  3. הסר רצפים זיהום נוכח ספריות Srna, כולל רצף להפסיק פתרון (STP: CCACGTTCCCGTGG) ומתאם ה- carry-over (CTACAGTCCGACGATC) באמצעות הפונקציה removeSequenceInFastq במסגרת NGSPERL, בהתאם להנחיות מדריך למשתמש (רשימת חומרים).
  4. בצע מדדי בקרת איכות על ידי FastQC באמצעות מרכז למדעי כמוני (CQS) כלים, בהתאם להנחיות מדריך למשתמש (רשימת חומרים).
  5. צור רשימה לא מיותרת של "זהה", נכתב (redunda קריסהNT כניסות) ומספרי שיא עותק באמצעות CQSTools, בהתאם להנחיות מדריך למשתמש (רשימת חומרים).
  6. יישר מקריא הגנום האנושי באמצעות Bowtie1.1.2 המאפשר 1 התאמה (אפשרויות: -a -m 100 --best --strata -v 1), בהתאם להנחיות מדריך למשתמש (רשימת חומרים).
  7. בצע לקרוא יישור, ספירה, ולגרום משימות סיכום באמצעות NGSPERL, לפי ההוראות במדריך למשתמש.
  8. המרת שולחן ספירה לייצא לקובץ גיליון אלקטרוני.
  9. לנרמל קורא של למחלקה מסוימת (למשל, miRNAs) למספר הכולל של קורא לשיעור כי (למשל, המספר הכולל של miRNAs כניסות) ואותות הדו"ח כפי קורא Per ממופים מירנה (RPMM). (למשל, RPMM = (Mir-X / # סך של מירנה כניסות) * 1,000,000).
  10. קלט מנורמל ספירת שולחן כמו טכנולוגיית צבע אחד הגנרית לתוך תוכנה עבור ברמה נמוכה הפרש ברמה גבוהה מנתח לפי הוראות במדריך למשתמש (רשימת חומרים).
    הערה: נכון לעכשיו, אין היטב מאופיין גני משק / sRNבאשר HDL-Srna. פקד ספייק-in ניתן להשתמש, אבל יכול להיות בעייתי. נרמול כדי HDL קלט החלבון הכולל או נפח מומלץ. והכי חשוב, זה מומלץ לאמת תוצאות רצף אחד של אסטרטגיות שונות כדי לכמת miRNAs ו sRNAs באמצעות PCR בזמן אמת או PCR כמותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זוהי סדרה של שיטות הוקמה מקושר יחד כדי לאפשר כימות של sRNAs על HDL טהור מאוד על ידי רצף תפוקה גבוהה או בזמן אמת PCR (איור 1). כדי להוכיח את ההיתכנות וההשפעה של פרוטוקול זה, HDL היה מטוהרים מפלסמה אנושית בשיטת טנדם DGUC ו FPLC. מקטעים שנאספים FPLC המתאים HDL (על ידי חלוקת כולסטרול) רוכזו ו- RNA הכולל היה מבודד 1 מ"ג של HDL (חלבון כולל). ספריות Srna נוצרו עם HDL שנאסף n = 4 בבני אדם בריאים. כל דגימות והדם / פלזמה נאספו תחת פ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה נועד לכמת miRNAs ו sRNAs אחרים על ידי רצף תפוקה גבוהה או בזמן אמת PCR על HDL טהור מאוד. כמו בכל גישה, שיקולים מיוחדים יש לתת לכל שלב בתהליך של HDL מטהר RNA ואז לכימות sRNAs. פרוטוקול זה מיועד פרויקטים החל ≥ 2 מ"ל של הפלזמה. אף על פי כן, ניתוחי RNA באיכות גבוהה ניתן להשלים בהצלחה עם HDL מטוהר מ קטן כמו 80 μL של מפלזמה אנושית או עכבר באמצעות כרומטוגרפיה זיקה; עם זאת, כרכי פלזמת מוצא גדולים לייצר נתונים טובים יותר באמצעות השיטות שהוצגו כאן. שיטות עיבוד והפקה לדוגמא י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מהמכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי ללב, ריאות ודם ל-K.C.V. HL128996, HL113039 ו-HL116263. עבודה זו נתמכה גם על ידי פרסים מאיגוד הלב האמריקאי ל-K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 ו-R.M.A. POST25710170.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אולטרה-צנטריפוגה בקמן קולטרA99839אופטימה XPN-80
רוטור אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר331362SW-41Ti
AKTA מערכת FPLC טהורהGE Healthcare29018224
3x FPLC Superdex 200 הגדלת עמודות בשורהGE Healthcare2899094410/300 gl
SynergyMxBioTek Instruments7191000
שולחן צנטריפוגהThermo Scientific75004525Sorvall ST40R
צנטריפוגה מקוררתEppendorf226298675417R (נרכש דרך USA Scientific)
מיקרופוגה ארה"ב מדעי2631-0006
PippenPrepSage SciencePIP0001
2100 ביואנלייזר AgilentG2938B
רגישות גבוהה בדיקת DNAAgilent5067-4626
ספריית ריצוף qPCR ערכת כימותIlluminaSY-930-1010
ProFlex ThermalCycler Applied Biosystems4484073
QuantStudio 12k FlexApplied Biosystems4471134
EpMotion Robot Eppendorf9600001115070
צינורות צנטריפוגה ברורים במיוחדבקמן קולטר344059
אשלגן ברומידפישר כימיקליםP205-500
צינור חרוטי 15 מ"לThermo Scientific339650
מסננים מיקרו-צנטריפוגליים 0.45 ומיקרו; mMilliporeUFC30HV00
מסננים מיקרו-צנטריפוגליים 0.22 ומיקרו; mMilliporeUFC30GV00
miRNAAערכות בידוד RNA כוללותQiagen217004
Total Cholesterol colormetric KitCliniqa (Raichem)R80035
10,000 m.w. מסנן צנטריפוגה מנותקAmiconUFC801024נרכש באמצעות צינורות רצועת Millipore
PCRAxygenPCR-0208-Cנרכש דרך פישר
ערכת microRNA RTTechnologies4366597עבור 1000 תגובות
PCR מאסטר מיקסLife Technologies4440041בקבוק 50 מ"ל
ערכת Pierce BCAThermo Scientific23225
ערכת ניקוי וריכוזZymoD4014
צינורות דיאליזהSpectrum Labs132118נרכש דרך פישר
bcl2fastq2Illuminan/aSoftware
Cutadapthttps://github.com/marcelm/cutadaptn/aתוכנה
NGSPERLgithub.com/shengqh/ngsperln/aתוכנה
CQSToolsgithub.com/shengqh/CQS.Toolsn/aתוכנה
עניבת פרפר 1.1.2 http://bowtie-bio.sourceforge.netתוכנה
GeneSpringGX13.1.1Agilentn/aתוכנה
Life

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  3. Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
  4. Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
  5. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
  6. Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
  7. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
  8. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  9. Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8(2014).
  10. Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
  11. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
  12. Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164(2015).
  13. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  14. Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
  15. Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
  16. Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
  17. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
  18. Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
  19. McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
  20. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
  21. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
  22. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145(2011).
  23. Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
  24. Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360(2008).
  25. Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
  26. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  27. Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
  28. Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
  29. Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNAHDLBCA

מאמרים קשורים