מאמר שיטה

איתור של הפעילות תלויה pH של

DOI:

10.3791/54527

⸱

23 באוקטובר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר טכניקות biophysical, ביוכימיים ומולקולריים לאפיין את הפעילות המלווה של Escherichia coli HdeB בתנאי pH חומצי. שיטות אלו יושמו בהצלחה עבור מלוות חומצה-מגן אחרות כגון HdeA והוא יכול להיות שונה כדי לעבוד עבור מלווים אחרים בתנאי עקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים נחשפים לעתים קרובות לשינויים סביבתיים, כגון שינויים ב- pH, טמפרטורה, מצב חיזור, חשיפה לאור או כוח מכני. הרבה מהמקרים האלה לגרום חלבון התגלגלות בתא ויש להם השפעה מזיקה על ההישרדות של האורגניזם. קבוצת מלווים שאינם קשורים, מולקולריים ספציפי לחץ הוכחה לשחק תפקידים חיוניים להישרדותה של תנאי הלחץ הללו. בעוד מקופל מלא מלווה-פעיל לפני לחץ, החלבונים האלה להתפתח במהירות ולהיות מלווה-פעיל בתנאי קיצון ספציפי. הופעל פעם אחת, מלווה סדר המותנה אלה נקלטות על ידי מספר רב של חלבוני צבירה נוטה שונים, למנוע הצבירה שלהם במישרין או בעקיפין להקל חלבון refolding עם שיבת תנאים שאינם מתח. הגישה העיקרית להשגת הבנה מפורטת יותר על המנגנון של הכרת הפעלת הלקוח שלהם כרוכה הטיהור subsequenאפיון t של חלבונים אלו באמצעות מבחני מלווה במבחנה. מעקב מבחני לחץ vivo חיוני לחלוטין כדי לאשר את שהושג באופן עצמאי בתוצאות חוץ גופייה.

פרוטוקול זה מתאר במבחנה שיטות vivo לאפיין את הפעילות המלווה של E. coli HdeB, גידול מלווה חומצה מופעלת. מדידות פיזור אור שמשו לקריאה מתוך נוח הקיבולת של HdeB למנוע צבירה הנגרמת חומצה של חלבון לקוח המודל הוקם, MDH, במבחנה. ניסויי ultracentrifugation אנליטית יושמו לחשוף היווצרות מורכבת בין HdeB ו LDH חלבון הלקוח שלה, כדי לשפוך אור לתוך גורל חלבוני לקוח עם שובי תנאים שאינם מתח. מבחני הפעילות האנזימטית של חלבוני הלקוח נערכו במטרה לפקח על תופעות של HdeB על איון הלקוח הנגרמת pH ו מחדש. לבסוף, מחקרים הישרדות שימשו Monitor השפעת פונקצית in vivo המלווה של HdeB.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סביבה טבעית משותפת שבה פתוגנים חיידקים לחוות תנאי התגלגלות חלבון חומצה הנגרמת היא בבטן היונקת (טווח pH 1-4), אשר pH חומצי משמש מחסום יעיל נגד פתוגנים שמקורן במזון 1. חלבון התגלגלות ומקבצים, אשר נגרם על ידי protonation שרשרת הצד של חומצות אמיניות, משפיעים תהליכים ביולוגיים, מבנים הסלולר ניזקים ולבסוף גורם מוות של תאי 1,2. מאז ה- pH של periplasm חיידקי equilibrates כמעט מיידי עם pH הסביבתי עקב דיפוזיה החופשית של פרוטונים דרך הממברנה החיצונית הנקבובית, חלבונים בממברנה periplasmic והפנימיים של חיידקי גרם שליליים הם מרכיבים התאיים הפגיעים ביותר בתנאי חומצה-מתח 3. כדי להגן proteome שלהם periplasmic מפני נזק חומצה בתיווך מהירה, חיידקים גראם שליליים לנצל את המלוות periplasmic המופעל חומצה HdeA ו HdeB. HdeA הוא מלווה מופרע על תנאים 4,5: ב- pH נייטרלי, HdeA קיים בתור דימר מקופל, המלווה-פעיל. עם שינוי pH מתחת pH 3, הפונקציה המלווה של HdeA מופעלת במהירות 6,7. הפעלת HdeA דורש שינויים מבניים עמוקים, כולל ניתוק שלה לתוך מונומרים, ואת חלקי התגלגלות של מונומרים 6-8. הופעל פעם אחת, HdeA נקשר לחלבונים הנפרשות בתנאים חומציים. זה מונע ביעילות הצבירה שלהם הוא במהלך הדגירה ב- pH הנמוך, כמו גם על נטרול pH. עם שובו ל- pH 7.0, HdeA מקל על refolding של חלבוני הלקוח שלו בצורה ATP-עצמאית וממיר בחזרה לתוך קונפורמציה שלה dimeric, בת הלוויה-פעיל 9. באופן דומה, HdeB המלווה ההומולוגי הוא גם לוויה-פעיל ב- pH 7.0. בניגוד HdeA, לעומת זאת, פעילות המלווה של HdeB מגיע המקסימלית שלה לכאורה ברמה של 4.0 pH, התנאים שבהם HdeB עדיין מקופלת ברובו dimeric 10. יתר על כן, עוד הורדת קאוס pHes איון של HdeB. תוצאות מראות כי למרות ההומולוגיה הנרחבת שלהם, HdeA ו HdeB שונים במצב שלהם הפעלה פונקציונלית ומאפשרת להם מכסי מגוון רחב pH עם פונקצית המלווה המגנה שלהם. מלווה אחר אחת כי היה מעורב התנגדות החומצה של E. coli הוא Hsp31 cytoplasmic, המופיע לייצב חלבוני הלקוח פרש עד משוחזרים תנאי נייטרלי. המצב המדויק של הפעולה של Hsp31, לעומת זאת, נותר 12 חידתי. בהתחשב בכך חיידקים וחיידק אחרים כגון סלמונלה חסרים את אופרון hdeAB, סביר מאוד כי מלוות periplasmic בלתי מזוהים אחרים אבל בכל זאת עלולים להתקיים כי הם מעורבים התנגדות חומצה של חיידקים אלה 11.

הפרוטוקולים שהוצגו כאן מאפשרים לפקח על הפעילות המלווה תלוי pH של HdeB במבחנה ובחי 10 וניתן להחיל לחקור מלווים אחריםכגון Hsp31. לחלופין, הרשת המורכבת של גורמי שעתוק השולטות ביטוי hdeAB יכולה להיחקר באופן פוטנציאלי על ידי assay מתח vivo. כדי לאפיין את תפקודם של חלבונים המלווים in vivo, setups הניסיוני השונה ניתן ליישם. מסלול אחד הוא ליישם בתנאי עקה התגלגלות חלבון phenotypically לאפיין זנים מוטנטים כי גם ביטוי יתר של הגן של עניין או לבצע מחיקה של הגן. ניתן לבצע מחקרי proteomic לזהות אילו חלבונים כבר לא המצרפי בתנאי קיצון כאשר המלווה הוא הווה, או את ההשפעה של מלווה על אנזים מסוים יכולה להיקבע במהלך בתנאי עקה באמצעות מבחני האנזימטית 14-16. במחקר זה, בחרנו overexpress HdeB ב זן מחיקת rpoH, אשר חסר את גורם סיגמא הלם חום 32. RpoH שולט הביטוי של כל א הגדולה מלווה coli והמחיקה שלו ידועה להגדיל sensitivity לתנאי עקה סביבתיים הגורמים חלבון התגלגלות 15. פעילות המלווה vivo של HdeB נקבע על ידי ניטור יכולתה לדכא את רגישות ה- pH של זן Δ rpoH. בסך הכל, הפרוטוקולים שהוצגו כאן לספק גישה מהירה וישירה לאפיין את הפעילות של מלווה חומצה מופעלת במבחנה וכן בהקשר vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי טיהור 1. של periplasmic HdeB

הערה: HdeB התבטאה E. קולי תאים מחסה פלסמיד pTrc- hdeB 10, וטיהר מן periplasm על תמוגה polymyxin.

  1. הכן תרבות לילה של E. קולי תאים מחסה פלסמיד pTrc- hdeB 10 ב 30 מ"ל LB המכיל 200 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין (AMP LB). לחסן ארבעה 1 תרבויות L של LB Amp לגדל אותם על 37 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד עד OD 600nm של 0.7 הוא הגיע. לאחר מכן, להוסיף 300 מיקרומטר IPTG להשרות את הביטוי של HdeB ולהפחית את הטמפרטורה הצמיחה עד 30 מעלות צלזיוס.
  2. אחרי 5 שעות של ביטוי חלבון ב 30 מעלות צלזיוס, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 8000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  3. שטפו את תא גלולה עם 100 מ"ל חיץ (50 מ"מ טריס / HCl, 50 mM NaCl, pH 7.5) ו צנטריפוגות שוב התאים ב 8000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C A.
  4. בהמשך לכך, גלולהתא גלול ב 80 מיליליטר הצפה, המכילה 1 מ"ג / סולפט polymyxin מיליליטר. עבור שיבוש יעיל של הממברנה החיצונית, בעדינות מערבבים את ההשעיה עבור שעה 1 ב 4 ° C.
  5. כדי להסיר את חלק cytoplasmic ופסולת תאית, צנטריפוגה ההשעיה עבור 20 דקות ב 15,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. התוצאה היא ~ 60 מיליליטר supernatant המכיל את HdeB המסיס.
  6. Dialyze את supernatant המכיל את תמצית periplasmic לילה נגד נפח 150x של חיץ B (20 מ"מ טריס / HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0) באמצעות קרום דיאליזה עם 6 kDa MW חתוכים. לרכז את החלבונים עד 15 מ"ל באמצעות יחידות צנטריפוגלי מסנן עם משקל מולקולרי חתוכים של 3 kDa. סנן את פתרון החלבון באמצעות מסנן נקבובי 0.2 מיקרומטר.
  7. החל את החלבון על טור כרומטוגרפיה אניוני (נפח עמודה 5 מ"ל) כי כבר equilibrated עם B חיץ 5 כרכים עמודה עם קצב הזרימה של 2.5 mL / min. לאחר החלבון נטען על הטור, לשטוף את העמודה עם החיץ B במשך 10 דקות בשיעור תזרים של 2.5 מ"ל / דקה. Elute HdeB עם שיפוע ליניארי 0 כדי 0.5 M NaCl חיץ B על פני פרק זמן של 50 דקות עם קצב הזרימה של 2.5 mL / min 6.
  8. לזהות שברים המכילים HdeB באמצעות SDS-PAGE 15%. מערבבים 20 מדגם μl עם 5 μl 5x חיץ טעינת מופחת SDS. טען 10 μl על ג'ל ולהפעיל חיץ טריס-גליצין (גליצין 14.4 גר '/ ל, 2.9 גר' / ל טריס, 1 גר '/ ל סולפט dodecyl נתרן, pH 8.3). הפעל את הג'ל על 150 V עד להקת bromophenol העבירה קרובה לתחתית הג'ל (~ 45 דקות).
  9. בריכת כל שברים HdeB המכילים, דיאליזה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 למאגר אחסון L HdeB (50 מ"מ טריס / HCl, 200 מ"מ NaCl, pH 8.0), ולהתרכז החלבון לכ 300 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים של 3 kDa. קבע את הריכוז של HdeB ב 280 ננומטר באמצעות 280nm ε מקדם הכחדה = 15,595 M -1 cm -1. כן 100 aliquots μl ופלאש ללאZE את aliquots בחנקן נוזלי.
    הערה: HdeB ניתן לאחסן ב -70 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים.

2. Assay פעילות הורה מלווה שימוש תרמית התגלגלות dehydrogenase Malate (MDH)

הערה: השפעת HdeB מטוהר על צבירת תרמית התגלגלות dehydrogenase malate המיטוכונדריה החזירית (MDH) בערכי pH שונים הייתה פיקוח כמפורט להלן. כל ריכוזי חלבון המפורטים מתייחסים ריכוז מונומר.

  1. כדי להכין MDH, dialyze MDH ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 C חיץ L (פוספט אשלגן 50 מ"מ, 50 מ"מ NaCl, pH 7.5) ולרכז את חלבון כ 100 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים 30 kDa.
    הערה: דיאליזה זהירות של MDH נדרשת MDH מועבר כפתרון אמוניום סולפט.
  2. כדי להסיר אגרגטים, בצנטריפוגה חלבון במשך 20 דקות ב 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. קביעת ריכוז MDH ידי ספיגה ב 280 ננומטר (ε 280 ננומטר = 7,950 M -1 cm -1). הכן 50 aliquots μl של MDH ופלאש להקפיא את aliquots לאחסון.
  3. מניחים קובט קוורץ 1 מ"ל לתוך ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי מצויד מחזיקי מדגם מבוקר טמפרטורה בוחש. הגדר לשעבר λ / em ל -350 ננומטר.
  4. להוסיף כרכים המתאים של טרום התחמם (43 ° C) חיץ D (150 פוספט אשלגן מ"מ, 150 מ"מ NaCl) על ערכי pH הרצוי (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0, ו- pH 5.0) כדי קובט וערכת הטמפרטורה של בעל קובט ל -43 מעלות צלזיוס. ההיקף הכולל הוא 1,000 μl.
  5. להוסיף 12.5 מיקרומטר HdeB (או לחילופין באותו נפח של למאגר אחסון HdeB על בקרת חיץ) למאגר, ואחריו תוספת של MDH 0.5 מיקרומטר. מתחיל בבקרת פיזור אור. דגירת התגובה עבור 360 שניות כדי לאפשר מספיק התגלגלות של MDH.
  6. הרם את pH עד 7 על ידי הוספת נפח 0.16-0.34 מ -2 K unbuffered M 2 HPO 4 ולהמשיך מחדשcording פיזור אור עבור 440 אחר שניות.
  7. הגדר את מידת הצטברות MDH כי נרשמה בהעדר המלווה בנקודת זמן מוגדרת לאחר הנטרול (כאן אחרי 500 שניות, כאשר פיזור אור המקסימאלי של MDH נצפה) ל -100%. לנרמל פעילות HdeB לאות פיזור אור של MDH בהעדר HdeB בכל ערך pH מצוין.

3. איתור של גיבוש קומפלקס HdeB-LDH ידי אנליטית ultracentrifugation (AUC)

הערה: ניסויים מהירות שקיעה של HdeB לבד או בקומפלקס עם תרמית התגלגלות לקטט דהידרוגנאז (LDH) בוצעו באמצעות ultracentrifuge אנליטי.

  1. כדי להכין LDH, dialyze LDH ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 L חיץ C (50 פוספט אשלגן מ"מ, 50 מ"מ NaCl, pH 7.5) ולרכז את חלבון כ -200 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים 30 kDa.
    הערה: דיאליזה זהירות של LDH נדרשת LDH מועבר כפתרון אמוניום סולפט.
  2. כדי להסיר אגרגטים, LDH צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. קביעת ריכוז LDH ידי ספיגה ב 280 ננומטר (ננומטר = ε 280 43,680 M -1 cm -1). הכן 50 aliquots μl של LDH ופלאש להקפיא את aliquots לאחסון.
  3. דגירה 3 LDH מיקרומטר בנוכחות והיעדר HdeB 30 מיקרומטר במאגר D (pH 4 ו -7, בהתאמה) במשך 15 דקות ב 41 מעלות צלזיוס.
    הערה: דגירה של LDH לתוצאות טמפרטורות גבוהות ב הצבירה המוחלטת שלה, ואין שפעה מלווה של HdeB ניתן לצפות.
  4. תנו דגימות להתקרר לטמפרטורת החדר. ואז, דגימות עומס לתוך התאים המכילים במגזר סטנדרטי בצורת 2 ערוצים מסידורי עם 1.2 ס"מ אורך הדרך. טען את התאים לתוך ultracentrifuge לאזן ל -22 מעלות צלזיוס למשך לפני 1 שעה לפחות כדי שקיעה.
  5. ספין דגימות ב 22 ° C ו- 167,000 XG ב הרוטור בהתאמה במשך 12 שעות, ולנטר את sedimentation של חלבון ברציפות ב 280 ננומטר. כפי שתואר קודם לכן, יחס האות לרעש הוא השתפר כאשר עוצמת האור המועברת של כל ערוץ נמדדת ולא ספיג. זה גם משפר את איכות הולם נתונים עקב.
  6. לבצע ניתוח נתונים עם SEDFIT (15.01b גרסה, דצמבר 2015), באמצעות ג הרציף מודל ההפצה (הים) 17. הדרכה המתאר כיצד להשתמש SEDFIT ניתן למצוא התייחסות 18.
    1. הגדר את רמת הביטחון להסדרת ME (מקסימום אנטרופיה) 0.7.
  7. חישוב צפיפות חיץ וכן צמיגות באמצעות SEDNTERP 19. כדי לאמוד את כמות חלבון הלקוח מצטבר, השווה את אינטגרלים של LDH משקע ב pH 4 ל- pH 7 כהפניה.
    הערה: שילוב של מגרשי הפצת השקיעה יכול להיעשות ישירות SEDFIT. תוכנות חלופיות כדי לנתח נתונים מהירים שקיעה ניתן למצוא בביקורתם אחרונה 20.

4. ניטור MDH איון והפעלה מחדש בנוכחות HdeB

הערה: השפעת HdeB מטוהר על refolding של pH-פרש MDH נקבעה על ידי ניטור פעילות MDH על הניטרול.

  1. דגירה 1 MDH מיקרומטר במאגר D על ערכי pH הרצוי (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0, ו- pH 5.0) במשך שעה 1 ב 37 ° C בהעדר או בנוכחות HdeB 25 מיקרומטר. לאחר מכן, להעביר את הטמפרטורה ל 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: אין refolding MDH נצפתה אפילו בנוכחות של HdeB כאשר MDH הודגר בטמפרטורות גבוהות מ -37 מעלות צלזיוס.
  2. כדי ליזום refolding של MDH מפוגל חומצה, לנטרל את דגימות ה- pH 7 על ידי תוספת של נפח 0.13-0.42 של 0.5 M פוספט נתרן, pH 8.0.
  3. לאחר דגירה עבור שעה 2 ב 20 מעלות צלזיוס, לקבוע פעילות MDH על ידי ניטור ירידה של NADH ב 340 9 ננומטר.
    הערה: MDH מזרז את הירידה תלויה-NADH של oxaloacetate לתוך L-Malate.
    1. מערבבים 50 μl של התגובה הדגירה עם 950 μl של חיץ assay (פוספט נתרן 50 מ"מ, pH 8.0, 1 מ"מ oxaloacetate, ו -150 מיקרומטר NADH).
      הערה: הריכוז הסופי של MDH למאגר assay צריך להיות 44 ננומטר.
    2. לפקח על השינוי ספיג באמצעות ספקטרופוטומטר, מצויד בלוק בקרת טמפרטורת פלטייה מוגדר 20 ° C.
    3. דווח על יחסי פעילות MDH ל -44 ננומטר יליד MDH כי נשמר ב- pH 7.0.

5. השפעת HdeB התבטאות יתר על E. coli הישרדות תחת מתח חומצה

הערה: E. coli MG1655 הדנ"א הגנומי היה מבודד באמצעות פרוטוקול שפורסם 21.

  1. להגביר hdeB מ E. MG1655 coli על ידי PCR באמצעות hdeB פריימרים - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT GTC CAA ATT CGG ו hdeB - Ecor I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC ג
  2. הגדר את תגובת PCR ב 50 μl כדלקמן: 10 μl חיץ פולימראז 5x, 200 מיקרומטר dNTPs, 0.5 מיקרומטר פריימר JUD2, 0.5 מיקרומטר פריימר JUD5, 150 ng MG1655 הדנ"א הגנומי, 0.5 DNA פולימרז μl, להוסיף DDH 2 O עד 50 μl.
  3. בצע הגברה של hdeB כדלקמן: שלב 1: 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, 1 מחזור; צעד 2: 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 55 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס, 40 מחזורים; שלב 3: 10 דק 'ב 72 מעלות צלזיוס.
  4. Clone וכתוצאה מכך שבר PCR לתוך האתרים Ecor אני BamH לי של פלסמיד pBAD18 באמצעות שיטות סטנדרטיות עבור שיבוט אתר הגבלה. לטהר את הפלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד פי הוראות היצרן. בדוק את הפלסמיד שהתקבל על ידי רצף 10.
  5. להפוך את הפלסמיד להביע HdeB או pBAD18 בקרת וקטור ריק לתוך BB7224 זן (Δ rpoH) (גנוטיפ: F -, λ -, E14 -, [araD139] B / [r6; (argF-לאק) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 ארד + rpoH :: kan +; 16) באמצעות תאים מוסמכים כימי.
    הערה: זן זה הוא רגיש לטמפרטורה.
  6. לאחר 45 שניות-הלם חום על 42 מעלות צלזיוס ולפני הציפוי, דגירת תאים ב 30 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד. בצע פס-outs מושבה אחת של שיבוטים חיובי דגירה לילה בשעה 30 ° C. הכן תרבות הלילה ב 50 מ"ל LB Amp ולטפח את התאים ב 200 סל"ד ו -30 מעלות צלזיוס.
  7. לדלל תרבויות לילה פי 40 ל -25 מ"ל LB Amp ולגדול החיידקים בנוכחות 0.5% arabinose (Ara) על 30 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד ל 600nm OD = 1.0 להשרות ביטוי חלבון HdeB.
  8. עבור ניסויי משמרת pH, השתמש LBAmp + ערה לדלל את התאים OD 600nm של 0.5 ולהתאים לערכי pH בהתאמה (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0) על ידי הוספת כמויות מתאימות של 5 M HCl.
  9. לאחר שהוחלט על נקודות זמן המצוינות (pH 2, 1 דקות; pH 3, 2.5 דקות, pH 4, 30 דק '), לנטרל את התרבויות על ידי תוספת של הכרכים המתאימים של 5 M NaOH.
  10. לפקח על הצמיחה של התרבויות לנטרל בתרבות הנוזלית במשך 12 שעות ב 30 ° C באמצעות מדידות OD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HdeA ו HdeB הם הומולוגיים E. חלבונים coli, ידוע להגן חלבונים periplasmic נגד בתנאי עקה חומצה 10. העבודה שלנו גילתה כי בדומה HdeA, HdeB מתפקד גם בתור חומצה מופעלת מלווה מולקולרי. עם זאת, בניגוד HdeA, פונקציות HdeB ב- pH כי הוא עדיין פוטנציאל bactericidal, אך גבוה משמעותית מאשר אופטימלית pH של HdeA 6,9,10,22. כדי לחקור את אופטימלית pH של פעילות המלווה של HdeB במבחנה, יליד MDH דוללה לתוך מחומם מראש (43 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת ללמוד את המנגנון של הפעלה מלווה פונקציה של HdeB, כמויות גדולות של HdeB צריכים לבוא לידי ביטוי ו מטוהר. מספר מערכות וקטור ביטוי זמינים לייצור רמות גבוהות של חלבון המטרה, כולל וקטורים pTrc או pBAD, אשר שניהם שימשו במחקר זה. היזמים נגישים בקלות עבור E. RNA פולימראז coli ובכך ביטוי מאפשר שהוגבר בחום של HdeB בכל E. זן coli. היבט זה רלוונטי במיוחד עבור מחקר ביטוי יתר in vivo של HdeB בתנאי קיצון חומצה, שבו זן -deficient rpoH

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר קלאודיה Cremers עבור עצתה המועילה על מבחני מלווה. קן וואן הוא הודה לקבלת הסיוע הטכני שלו טיהור HdeB. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הרפואי של הווארד יוז (כדי JCAB) לבין המכון הלאומי לבריאות מענק RO1 GM102829 כדי JCAB ו UJJ-UD הוא נתמך על ידי מענק מחקר בתר-דוקטוריאלי מסופק על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
NEB10-beta E. coli תאיםניו אינגלנד ביולאבסC3019I
AmpicillinGold BiotechnologyA-301-3
LB תערובת מרק, LennoxLAB Express3003
IPTGGold BiotechnologyI2481C50
נתרן כלוריפישר סיינטיפיקS271-10
Trisאמרסקו0826-5 ק"ג
EDTAפישר סיינטיפיקBP120-500
פולימיקסין B סולפט ICN ביומדיקל בע"מ
0.2 ומיקרו; מסנן מזרק סטרילי נקבוביקורנינג431218
HiTrap Q HP (CV 5 מ"ל)GE Healthcare Life Sciences17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%Bio-Rad4561046
מלאט דהידרוגנאז (MDH)Roche10127914001
אשלגן פוספט (מונובסיסי)Fisher ScientificBP362-500
אשלגן פוספט (דו-בסיסי)פישר סיינטיפיקBP363-1
F-4500 ספקטרופוטומטר פלואורסצנטיהיטאצ'יFL25
אוקסלואצטטסיגמאO4126-5G
NADHסיגמא N8129-100MG
נתרן פוספט מונו-בסיסיסיגמא S9390-2.5KG
נתרן פוספט דו-בסיסיסיגמא S397-500
לקטט דהידרוגנאז (LDH)Roche10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I אולטרה-צנטריפוגה אנליטיתבקמן קולטר392764
סנטרפיס, 12 מ"מ, 306493
AN-50 Ti Rotor, אנליטי, 8 מקומותBeckman Coult363782
Wizard Plus Miniprep KitPromegaA1470המשמש לטיהור פלסמיד (פרוטוקול 5.1)
L-arabinoseGold BiotechnologyA-300-500
GlycineDOT Scientific IncDSG36050-1000
קובטת תא פלואורסצנטיHellma Analytics119004F-10-40
אוליגונוקלאוטידיםInvitrogen
Phusion נאמנות גבוהה DNA פולימראזניו אינגלנד BiolabsM0530S
dNTP סטInvitrogen10297018
חומצה הידרוכלוריתפישר מדעיA144-212
נתרן הידרוקסידפישר מדעיBP359-500
Amicon Ultra 15 מ"ל 3K NMWLMilliporeUFC900324
צנטריפוגה Avanti J-26XPIבקמן קולטר393127
Varian Cary 50 ספקטרופוטומטרAgilent Tech
Spectra/Por 1 קרום דיאליזה MWCO: 6 kDaSpectrum Laboratories132650
Amicon יחידות סינון אולטרה צנטריפוגליות 30KMilliporeUFC803024
SDSFisher Scientificbp166-500
Veriti 96 בארות Thermal CyclerThermo Fisher4375786
100565 בקמן קולטר במילוי פחם אפוןer

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).
  3. Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  4. Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  5. Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).
  6. Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).
  7. Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).
  8. Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
  9. Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).
  10. Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).
  11. Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).
  12. Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).
  13. Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
  14. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  15. Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).
  16. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).
  17. Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  18. Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. , Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
  19. Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. , Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
  20. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  21. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
  22. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
  23. Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
  24. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).
  25. Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
  26. Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HdeBin vitroin vivo

מאמרים קשורים