האינטראקציה בין ערוצי HCN ו למקטע העזר שלהם זוהה כיעד טיפולי הפרעת דיכאון מג'ורית. כאן, שיטת קרינה מבוססת קיטוב לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של אינטראקציה בין חלבונים זה, מוצגת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ערוצי נוקלאוטיד-מגודר מחזוריים מופעל hyperpolarization (HCN) באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף בכל רחבי המוח, שם הם מתפקדים להסדיר את הרגישות של נוירונים. חלוקת subcellular של הערוצים הללו עצב פירמידליים של האזור בהיפוקמפוס CA1 מוסדרת tetratricopeptide חלבון אינטראקציה חוזר המכיל Rab8b (TRIP8b), גידול למקטע עזר. נוקאאוט גנטי של HCN נקבובית להרכיב יחידות משנה או TRIP8b, הוא להוביל לעלייה בהתנהגות נגד דיכאון דמוי, דבר המצביע כי הגבלת הפונקציה של ערוצי HCN עשויה להיות שימושית כטיפול בהפרעת דיכאון מג'ורית (MDD). למרות עניין טיפולי משמעותי, ערוצי HCN באים לידי ביטוי גם בלב, שם הם מווסתים מקצב. כדי לעקוף בעיות מחוץ יעד הקשורים חסימת ערוצי HCN לב, במעבדה שלנו הציעה לאחרונה מיקוד האינטראקציה בין החלבונים בין HCN ו TRIP8b כדי להפריע לפעילות של ערוץ HCN במיוחד במוח.TRIP8b נקשר נקבובי HCN להרכיב יחידות משנה בשני אתרי אינטראקציה מובהקים, אף כאן הדגש הוא על האינטראקציה בין חוזרות tetratricopeptide (TPR) תחומים של TRIP8b ואת זנב C המסוף של HCN1. בפרוטוקול זה, תיאור מורחב של שיטה לטיהור TRIP8b וביצוע מסך תפוקה גבוהה לזהות מעכבי מולקולה קטנה של האינטראקציה בין HCN ו TRIP8b, מתואר. השיטה לסינון תפוקה גבוהה מנצלת קיטוב קרינה (FP) מבוסס assay לפקח על כריכה של שבר TRIP8b גדול על אחת עשר-tagged fluorophore אמינו פפטיד החומצה מתאים זנב מסוף HCN1 C. שיטה זו מאפשרת 'מכה' תרכובות כדי לזהות המבוססת על שינוי הקיטוב של האור הנפלט. מבחני אימות מבוצעים ואז לבטח 'מכה' תרכובות אינן artifactual.
מבוא
ערוצי נוקלאוטיד-מגודר מחזוריים מופעל hyperpolarization (HCN) באים לידי ביטוי על הלב ועל מערכת עצבים מרכזית, שם הם ממלאים תפקיד חשוב בויסות קרום רגישות 1. ערוצי HCN היו מעורבים בפתוגנזה של הפרעת דיכאון מג'ורי (MDD) 2, אשר הובילה מספר קבוצות להציע כי הגבלת פרמקולוגית פונקצית ערוץ HCN עשויה להיות יעילה כמו טיפול חדשני MDD 3. עם זאת, מיקוד HCN ערוצים ישירות אינו בת קיימא בגלל התפקיד החשוב שלהם פוטנציאל הפעולה של לב 4. Ivabradine, ה- FDA אישר רק אנטגוניסט ערוץ HCN, משמש לטיפול באי ספיקת לב לייצר אפקט bradycardic 5. ככזה, יש צורך הסוכנים תרופתיים המגבילים פונקצית ערוץ HCN בלע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
טיהור 1. TRIP8b (241-602) חלבון
- להפוך את פלסמיד המכיל TRIP8b (241-602) ב pGS21 וקטור ביטוי חלבון חיידקי 3 לתוך E. המוסמכת coli עבור ביטוי החלבון על פי הוראות היצרן. פלייט 300 μl של התרבות על לוריא מרק (LB) -agar עם 5 מיקרוגרם / מ"ל של Chloramphenicol ו אמפיצילין. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
- למחרת, פיק מושבה אחת לחסן 50 מ"ל LB עם 50 מיקרוגרם / מ"ל של Chloramphenicol ו אמפיצילין. דגירת התרבות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות (עם רעד). <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי למנוע בעיות זכויות יוצרים עם בפרסום הקודם שלנו, בדיקה מתויגת-טמרה HCN1 טמרה הייתה השתמשה כדי ליצור איורים 2 ו -3. שים לב החלפה זה לא עשתה הבדל ניכר בתוצאות, והפרוטוקולים זהים לאלה שתוארו לעיל עם HCN1 FITC. כדי להעריך את האינטראקציה עם HCN1 טמרה, TRIP8b (241-602) היה טיטרציה לתוך ריכוז קבוע של HCN1 טמרה באמצעות פרוטוקול התווה בשלב 2 (איור 2). הבא, הניס.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בגלל הפוטנציאל שלה כיעד טיפולי ב MDD 24, חלה התעניינות רבה בגישות תרופתיות כי להרגיז פונקצית ערוץ HCN במערכת העצבים המרכזית 4. עם זאת, מאמצים אלה היו עוכבו על ידי התפקיד החשוב של ערוצי HCN ב pacemaking לב ואת הסיכון של הפרעות קצב 25. סברנו כי לשבש את יחסי הגומלין בין HCN ו למקטע העזר הספציפי במוח שלה, 8 TRIP8b, עשוי להיות מספיק כדי לייצר אפקטים נגד דיכאון דמוי מבלי להשפיע ערוצי HCN לב 3. השערה זו נשענה על התצפית כי עכברים שחסר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות R21MH104471 ו-R01MH106511 (D.M.C.), הקרן לחקר המוח SG 2012-01 (D.M.C.), המכון למדעים קליניים ותרגומיים של אוניברסיטת נורת'ווסטרן 8UL1TR000150 (Y.H.), הקונסורציום הביו-רפואי של שיקגו HTS-004 (Y.H. ו-D.M.C.), ומענק המכונים הלאומיים לבריאות 2T32MH067564 (K.L.). חלק מעבודה זו בוצע על ידי הליבה לכימיה רפואית וסינתטית של אוניברסיטת נורת'ווסטרן (ChemCore) במרכז לחדשנות מולקולרית וגילוי תרופות (CMIDD), הממומן על ידי הקונסורציום הביו-רפואי של שיקגו בתמיכת קרנות סרל בקרן הקהילה של שיקגו ומענק תמיכה במרכז הסרטן P30 CA060553 מהמכון הלאומי לסרטן שהוענק למרכז הסרטן המקיף רוברט ה. עבודת המסך בתפוקה גבוהה בוצעה במעבדה לניתוח תפוקה ג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מפרט NTA אגרוז | Qiagen | 30210 | |
| קלטת דיאליזה | ThermoFisher | 66456 | |
| איזופרופיל b-D-1-thiogalactopyranoside | סיגמא-אולדריץ' | I5502 - 1 גרם | |
| צלחת שחורה 384 בארות | קורנינג | 3820 | |
| פרוקסיפלייט | פרקין-אלמר | ||
| חרוזים נגד GST | פרקין-אלמר | 6760603C | |
| ניכלאט | פרקין-אלמר | AS101D | |
| pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Coomassie Kit | ThermoFisher | 23200 | |
| רכז חלבון | ThermoFisher | 88527 | |
| Perkin Elmer Enspire קורא צלחות Multimode | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
| BL21 (DE3) תאים מוכשרים | 200131 |
מקורות
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
- Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (2....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
