מאמר שיטה

איתור מדד-צבע של חיידקים באמצעות מבחן לקמוס

9.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54546

⸱

17 בספטמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי קולורימטרי של E. coli באמצעות בדיקת לקמוס שונה המנצלת DNAzyme, אוראז וחרוזים מגנטיים.

תקציר

ישנן דרישות הולכות וגדלות לשיטות פשוטות אך עדיין יעילות שניתן להשתמש בהן כדי לזהות פתוגנים ספציפיים עבור יישומי נקודת טיפול או שדה. שיטות כאלה צריכות להיות ידידותיות למשתמש ולהפיק תוצאות אמינות שניתן לפרש בקלות על ידי מומחים ולא מקצועיים כאחד. בדיקת הלקמוס ל-pH היא פשוטה, מהירה ויעילה מכיוון שהיא מדווחת על ה-pH של דגימת בדיקה באמצעות שינוי צבע פשוט. פיתחנו גישה לנצל את מבחן הלקמוס לזיהוי חיידקים. השיטה מנצלת DNA חוצץ RNA ספציפי לחיידק כדי להשיג שתי פונקציות: זיהוי חיידק מעניין ומתן מנגנון לשליטה בפעילות האוראז. באמצעות שימוש בחרוזים מגנטיים המשותקים עם מצומד DNAzyme-urease, נוכחות חיידקים בדגימת בדיקה מועברת לשחרור אוראז מחרוזים לתמיסה. האוראז המשוחרר מועבר לתמיסת בדיקה להידרוליזה של אוריאה לאמוניה, וכתוצאה מכך עלייה ב-pH שניתן לדמיין באמצעות בדיקת הלקמוס הקלאסית.

מבוא

פתוגנים חיידקיים הם אחד הגורמים העיקריים לתחלואה ותמותה עולמית. התפרצויות מזיהומים שנרכשו בבתי חולים, פתוגנים הנישאים במזון ומזהמים חיידקיים בסביבה מהווים איומים חמורים ומתמשכים על בריאות הציבור ובטיחותו. כדי למנוע התפרצויות אלה, יש צורך בכלים יעילים המאפשרים זיהוי פתוגנים בזמן במגוון מסגרות. בדיקות פשוטות אך עדיין יעילות, ניידות וחסכוניות, נחשקות מאוד, במיוחד באזורים הרגישים להתפרצויות אך אינם יכולים להרשות לעצמם מתקני בדיקה יקרים. 1-3 למרות שקיימות שיטות רבות לאיתור חיידקים, רבות מהן אינן מתאימות ככלי סינון או בדיקה באתר מכיוון שהן דורשות זמני בדיקה ארוכים, מכשירים יקרים והליכי בדיקה מסובכים.

בדיקות קולורימטריות אטרקטיביות במיוחד עבור יישומי נקודת טיפול או שטח מכיוון שניתן לזהות בקלות שינויי צבע בעין בלתי. בדיקת הלקמוס ל-pH היא פשוטה, מהירה ויעילה. למרות שמדובר בטכנולוגיה ישנה מאוד, היא עדיין נמצאת בשימוש נרחב כיום בגלל הפשטות והיעילות שלה. באופן מפתיע, בדיקה פשוטה זו מעולם לא שונתה כדי להשיג זיהוי של אנליטים אחרים לפני שפיתחנו לאחרונה גישה של שינוי בדיקה זו לבדיקת E. coli. 4

בדיקת הלקמוס המורחבת לאי קולי משתמשת בשלושה מרכיבים נוספים: DNA מבקע RNA המופעל על ידי E. coli (EC1), 5 אוראז וחרוזים מגנטיים. DNAzymes מתייחסים למולקולות DNA סינתטיות חד-גדיליות בעלות פעילות קטליטית. 6 ניתן לבודד אותם ממאגרי DNA ברצף אקראי באמצעות ברירה במבחנה. 7,8 הם יציבים ביותר וניתן לייצר אותם בצורה חסכונית באמצעות סינתזת DNA אוטומטית ביעילות גבוהה. 9 מסיבות אלה, DNAzymes, במיוחד DNAzymes מבקעי RNA, נבדקו באופן נרחב עבור יישומי חישה ביולוגית. 6,10,11 חיישני DNAzyme חודרי RNA פותחו לאיתור יוני מתכת,12-16 מולקולות קטנות,17,18 פתוגנים חיידקיים5,19-21 ותאים סרטניים. 22 בהתחשב בזמינות הגדולה של DNAzymes מבקעי RNA המושרים על ידי מטרה, ניתן להרחיב כל בדיקה המשתמשת ב-DNAzyme כדי לזהות מגוון רחב של אנליטים.

אוראז נבחר בשל יכולתו להידרוליזה של אוריאה לאמוניה,23,24 וכתוצאה מכך עלייה ב-pH. אוראז הוא גם יעיל ביותר, יציב וניתן לצימוד לביומולקולות אחרות. לכן, הנחנו שצימוד של DNA מחשוף RNA עם אוראז יאפשר שימוש בבדיקת לקמוס לזיהוי מטרות אחרות. 5

פעולת ה-DNAzyme המבקע RNA מועברת לעלייה מתווכת שתן של pH באמצעות שימוש בחרוזים מגנטיים המשותקים עם מצומד ה-DNAzyme-urease. מכיוון שפעילות ה-DNAzyme הנחקרת תלויה אך ורק ב-E. coli, נוכחותו של חיידק זה בתמיסת הבדיקה תביא לשחרור אוראז מהחרוזים המגנטיים לתמיסה, אשר לאחר מכן נלקח ומשמש להידרוליזה של אוריאה בתמיסת מדווח המכילה צבע רגיש ל-pH. התוצאה הסופית של הליך זה היא שינוי צבע שניתן לדווח עליו בנוחות על ידי נייר הצבע או ה-pH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים חוצצים

  1. 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)
    1. בכוס 2 L, להוסיף EDTA 186.1 גרם ל -800 מ"ל מים מזוקקים deionized (DDH 2 O). התאם את ה- pH של התמיסה ל 8.0 באמצעות כדורי NaOH. הוסף DDH 2 O לנפח סופי של 1.0 L ולהעביר הפתרון בקבוק זכוכית autoclavable עבור מעוקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. 10 × טריס- borate EDTA (10x TBE)
    1. בכוס פלסטיק 4 L, להוסיף 432 גרם טריס בסיס, 200 גרם חומצת בור, 80 מ"ל של 0.5 EDTA M (pH 8.0) ו DDH 2 O לנפח סופי של 4 מיקס ל באמצעות בר ומערבבים עד שכל הרכיבים הם מומסים. מעבירים את הפתרון בקבוקי זכוכית 1 ליטר עבור מעוקר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. 10% denaturing polyacrylamide במלאי
    1. בכוס פלסטיק 4 L, להוסיף 1681.7 אוריאה גרם, 400 מ"ל 10x TBE, 1 ליטר של 40% acrylamide / bisacrylamide (29: 1) פתרון DDH 2 O עד fנפח Inal הוא 4 ל מערבב בעזרת בר ומערבב עד האוריאה נמסה. מעבירים את הפתרון עד 1 L בקבוקי זכוכית ענבר ולאחסן ב 4 ° C..
  4. ג'ל 2x טעינת חוצץ (2x GLB)
    1. בתוך כוס זכוכית 200 מ"ל, להוסיף 44 גרם אוריאה, 8 סוכרוז גרם, 10 מ"ג bromophenol כחול, 10 מ"ג FF קסילן cyanol, 400 μl של סולפט dodecyl נתרן 10%, ו -4 מ"ל של 10 × TBE. הוסף DDH 2 O לנפח סופי של 40 מיליליטר ו לפזר את הרכיבים עם חימום קל על 50 מעלות צלזיוס תוך ערבוב עם בר ומערבבים מגנטי. העברת 1 מ"ל aliquot 1.5 מ"ל microfuge צינורות ולאחסן ב 4 ° C..
      הערה: שימוש לפני דורשת חימום קצר על 90 מעלות צלזיוס כדי redissolve כל מוצקים.
  5. 1 M טריס-הידרוכלוריד (Tris-HCl) (7.5 pH)
    1. בתוך בקבוק זכוכית, להוסיף 12.1 גרם של טריס-בסיס ו -70 מ"ל של DDH 2 O ומערבבים עד להמסה מוצק. התאם את ה- pH ל -7.5 באמצעות 1 חומצה הידרוכלורית M (HCl). הוסף DDH 2 O לנפח סופי של 100 מ"ל, החיטוי STOמחדש ב 4 ° C
  6. 5 כלוריד נתרן M (NaCl)
    1. בתוך בקבוק זכוכית, לפזר 58.4 גרם של NaCl ב -150 מ"ל של DDH 2 O. כוון את עוצמת הקול כדי 200 מ"ל עם DDH 2 O. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. DNA הצפת elution
    1. בתוך בקבוק זכוכית, לערבב 2.0 מ"ל של 1 M טריס- HCl (pH 7.5), 8.0 מ"ל של 5 M NaCl ו 0.4 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA (pH 8.0). כוון את עוצמת הקול כדי 200 מ"ל עם DDH 2 O, החיטוי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  8. 1 M 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7.4)
    1. בתוך בקבוק זכוכית, לפזר 2.38 גרם של HEPES ב -80 מ"ל של DDH 2 O. התאם את ה- pH ל -7.4 באמצעות 5 N NaOH ולהוסיף DDH 2 O לנפח סופי של 100 מ"ל.
  9. 1 מגנזיום כלוריד M (MgCl 2)
    1. בתוך בקבוק זכוכית, להוסיף 2.03 גר 'MgCl 2 -6H 2 O ולהביא את נפח 100 מ"ל עם DDH 2 O.
  10. מאגר תגובה (RB)
    1. בתוך צינור 50 מ"ל חרוטי, להוסיף 50 μl של 1 M HEPES (pH 7.4), 1.5 מ"ל של 5 M NaCl, 0.75 מ"ל של 1 M MgCl 2, ו -5 μl של Tween-20. הוסף DDH 2 O לנפח סופי של 50 מ"ל. מערבבים את הפתרון ולסנן לתוך צינור אחר חרוטי באמצעות מסנן מונחה מזרק (0.22 מיקרומטר) ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש.
  11. חיץ מחייב (BB)
    1. בתוך צינור 50 מ"ל חרוטי, להוסיף 500 μl של 1 M טריס- HCl (pH 7.5), 8.8 גרם של NaCl, 50 μl של 1 M של MgCl 2, ו -5 μl של Tween 20. להוסיף DDH 2 O לנפח סופי של 50 מ"ל. מערבבים את הפתרון ולסנן לתוך צינור אחר חרוטי באמצעות מסנן מונחה מזרק (0.22 מיקרומטר) ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש.
  12. פתרון המצע (SS)
    1. בתוך צינור 50 מ"ל חרוטי, להוסיף 5.8 גרם של NaCl, 3 מ"ל של 1 M 2 MgCl, 1.5 אוריאה ז, ו -40 מ"ל של DDH 2 O. התאם את ה- pH של התמיסה עד 5.0 באמצעות 10 מ"מ HCl. בגלל הפתרון אינו שנאגר, להתאים את ה- pH באמצעות HClבזהירות באמצעות התוספת של aliquots HCl הקטן. הוסף DDH 2 O לנפח סופי של 50 מ"ל.
    2. מערבבים את הפתרון ולסנן לתוך צינור אחר חרוטי באמצעות מסנן מונחה מזרק (0.22 מיקרומטר) ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש.
  13. לוריא Bertani (LB) מרק
    1. בכוס, לפזר אבקת 20.0 גרם LB ב 1 ליטר של DDH 2 O. מעביר בקבוק זכוכית, חיטוי, ולאחסן ב 4 ° C..
  14. אגר 1.5% LB
    1. בבקבוק 250 מ"ל, להוסיף אגר 1.5 גרם ו 100 מ"ל של מרק LB. חיטוי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  15. צלחות אגר
    1. Redissolve אגר LB במיקרוגל ומצננים הפתרון ~ 50 מעלות צלזיוס. יוצקים את הפתרון אל צלחות פטרי, מה שהופך ~ 5 צלחות ולאפשר להם לחזק.

סינתזה 2. וטיהור של E. coli- תגובה DNAzyme EC1

  1. סינתזה של EC1 ידי תבנית מתווכת אנזימתי קשירה
    1. לטהר commercially מסונתז oligonucleotides BS1, DE1, ו- T1 (רצפים מופיע בלוח 1) על ידי 10% denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (dPAGE) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
    2. הכינו מלאי 100 מיקרומטר של BS1, DE1, ו- T1. חנות ב -20 ° C עד השימוש.
    3. בתוך צינור 1.5 מ"ל microfuge, להוסיף 38.5 μl של DDH 2 O, 5 μl של DE1, ו -5 μl של חיץ התגובה קינאז polynucleotide 10x T4 שמספק הספק אנזים (500 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 100 מ"מ MgCl 2, 50 מ"מ dithiothreitol (DTT), 1.0 spermidine מ"מ).
    4. הוסף 1 μl של אדנוזין אדנוזין (ATP) (100 מ"מ). הוסף 5 יחידות של קינאז polynucleotide T4 (10 U / μl). מערבבים על ידי pipetting את תערובת התגובה בזהירות.
    5. דגירת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    6. להרוות את התגובה על ידי חימום עד 90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    7. להוסיף 118 μl של DDH 2 O, 5 μl של BS1, ו -5 μl של T1. מחממים את התגובה עד 90 מעלות צלזיוס למשך 2 ק"מn ולאחר מכן להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    8. הוסף 20 μl של 10 × חיץ התגובה האנזים T4 DNA שמספק לו הספק אנזים (400 מ"מ טריס-HCl (pH 7.8), 100 מ"מ MgCl 2, 100 מ"מ DTT, 5 מ"מ ATP). הוספת 10 יחידות של ה- DNA האנזים T4 (5 U / μl) ומערבבים בזהירות על ידי pipetting.
    9. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
    10. הוסף 20 μl של 3 M נתרן אצטט (NaOAc) (5.2 pH), 500 μl של אתנול 100% קר. מערבבים את הפתרון על ידי vortexing ומניחים את הצינורית במקפיא -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    11. צנטריפוגה microfuge ב -20,000 XG במשך 20 דקות ב 4 °. מוציאים בזהירות את supernatant ידי pipetting.
    12. שטוף את הכדור עם אתנול ו צנטריפוגות 70% קרים שוב ב -20,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C. שוב להסיר את supernatant ומייבשים גלולה תחת ואקום במשך 10 דקות.
    13. Resuspend את ה- DNA עם 15 μl של DDH 2 O ולאחר מכן להוסיף 15 μl של 2x GLB.
    14. וורטקס במרץ וחום עד 90 מעלות צלזיוס במשך2 דק '. לטהר את הדנ"א באורך מלא על ידי 10% dPAGE כמתואר להלן.
  2. הגדרת 10% dPAGE
    1. נקיה שתי צלחות זכוכית (צלחת מלאה אחת מחורצים אחד), שני מפרידים עבים 0.75 מ"מ, מסרק 12 גם. נח צלחת זכוכית אחד על משטח שטוח עם שני מפרידים בכל צד ואת הצלחת מחורצים על העליונה. קליפ שני הלוחות יחד באמצעות ארבעה קליפים שמספק לו הספק.
    2. בכוס פלסטיק 150 מ"ל, יוצקים 40 מ"ל של 10% dPAGE, 40 μl של tetramethylethylenediamine (TEMED), ו -400 μl של persulfate אמוניום 10% (APS). מערבבים את המרכיבים ויוצקים הפתרון בין הלוחות לאט.
    3. הכנס את המסרק ולאחר מכן לאפשר את הג'ל לפלמר במשך 10 דקות. לאחר ג'ל הוא polymerized, לאט להסיר את המסרק ולשטוף את הבארות עם DDH 2 O.
    4. הר את הצלחות על מנגנון ג'ל אלקטרופורזה. השתמש בצלחת מתכת כדי לפזר חום שנוצר כדי למנוע התחממות יתר.
    5. יוצקים TBE 1x על תאי העליון והתחתוןולהבטיח כי הבארות שקועות היטב למאגר. לשטוף את הבארות עם TBE 1x בעזרת פיפטה או מזרק.
    6. הגדר את המנגנון לרוץ ב 35 mA וברח מראש במשך 15 דקות לפני דגימות טעינה.
  3. Elution של ligated EC1 מ -10% dPAGE
    1. בעקבות צעד 2.2.6, הפעל את הג'ל על 35 מילי-אמפר עד (כחול bromophenol) צבע התחתון מגיע לתחתית צלחת זכוכית. זה אמור לקחת בערך 1.5 שעות. כבה את הכוח להסיר את הצלחות מן המנגנון.
    2. הנח את הצלחות על כמה גיליונות של מגבות נייר ולהסיר את מפרידי בקפידה מתוך לוחות הזכוכית. מוציא בזהירות את צלחת הזכוכית העליונה ועוטף את הג'ל בניילון הנצמד.
    3. תהפכו את הג'ל על להסיר את צלחת הכוס השנייה ומכסים בניילון נצמד שוב. תשמרי על עצמך כדי למנוע קמטים של בניילון נצמד.
    4. דמיינו את המוצר ligated באמצעות UV הצללה (260 ננומטר), אשר תייצר 4 להקות ה- DNA נפרדות (EC1 ligated מלא, DE1, BS1, ו- T1).
    5. בלו הלהקה העליונה (EC1) עם סכין גילוח סטרילית והעביר צינור 1.5 מיליליטר microfuge. למחוץ את הג'ל עם קצה פיפטה סטרילית (200 גודל עצה μl) עד שהוא הופך למשחה עדינה. להוסיף 550 μl של חיץ elution DNA, לכסות את הצינור עם רדיד אלומיניום על מנת להגן על fluorophore המוטבע, ולנער במשך 15 דקות.
    6. צנטריפוגה הפתרון ג'ל ב -20,000 XG במשך 5 דקות ובזהירות להעביר 400 μl של supernatant כדי צינור 1.5 מ"ל microfuge אחר. הימנע משיכת חתיכות ג'ל במהלך pipetting.
    7. אל הצינור microfuge עם supernatant הועבר להוסיף 40 μl של 3 M NaOAc (pH 5.2), ו 1.0 מ"ל של אתנול 100% קר. מערבבים את הפתרון על ידי vortexing ומניחים את הצינורית במקפיא -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    8. צנטריפוגה microfuge ב -20,000 XG במשך 20 דקות ב 4 °. מוציאים בזהירות את supernatant ידי pipetting.
    9. שטוף את הכדור עם אתנול ו צנטריפוגות 70% קרים שוב ב -20,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C. שוב, להסיר אתsupernatant ומייבשים גלולה תחת ואקום במשך 10 דקות.
    10. קבע את הריכוז של EC1 על ידי מדידת ספיגת UV ב 260 ננומטר. הפוך מניה 10 מיקרומטר ולאחסן את המדגם ב -20 ° C עד השימוש.

הצמיד 3. באוראז DNA

  1. הכנת succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) במלאי
    1. ממיסים 1 SMCC מ"ג ב 676 μl של DMSO. וורטקס ומניחים על הקרח עד לשימוש.
  2. הכנת מאגר באוראז
    1. ממיסים באוראז 1 מ"ג 1 מ"ל של 1 × PBS (ללא Mg 2 + או Ca 2 +). מניחים על קרח עד לשימוש.
      הערה: התגבש באוראז איטית להתמוסס ערבוב עדין נדרש על מנת להימנע denaturation.
  3. סינתזה של באוראז-דנ"א (UrDNA)
    1. הוסף 10 μl של 100 מיקרומטר LD1 לצינור 2.5 מ"ל microfuge. להוסיף 140 μl של DDH 2 O, 40 μl של 10x PBS, ו מערבולת.
    2. להוסיף 80.5 μl של SMCC sטוק, 159.5 μl של DMSO, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה באמצעות צנטריפוגות benchtop.
    3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. למנוע התעבות תחת כובע microfuge.
    4. הוסף 200 μl של 1x PBS, 60 μl של 3 M NaOAc (pH 5.2), ו 1.5 מ"ל של אתנול 100% קר. מערבבים את הפתרון על ידי vortexing ו דגירה ב -20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
    5. צנטריפוגה הפתרון ב 20,000 XG במשך 20 דקות ב 4 °. הסר את supernatant ומייבשים גלולה תחת ואקום. הימנעו על-ייבוש.
    6. כדי גלולה יבשים להוסיף 400 μl של המניות באוראז דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 שעות.
    7. העבר 200 μl של המצומד גולמי טור מסנן צנטריפוגלי מראש שטף 100k MWCO. צנטריפוגה העמודה 14,000 XG במשך 5 דקות.
    8. מעבירים את המצומד 200 μl של גולמי הנותרים לעמודה צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות. הסר את העמודה ולמקם אותו במהופך בתוך שפופרת 2.0 מ"ל microfuge חדש ( "צינור איסוף").
    9. CentrifUge צינור האיסוף (עם הטור ההפוך) XG ב 1000 למשך 2 דקות. הסר את צינור איסוף ולהוסיף 30 μl של 1x PBS לעמודה צנטריפוגלי לשטוף את הממברנה להתאוששות נוספת של conjugates.
    10. שוב להפוך את העמודה ולמקם בחזרה לתוך צינור האיסוף. צנטריפוגה צינור האיסוף (עם הטור ההפוך) XG ב 1000 למשך 2 דקות. סר ולהיפטר הטור.
    11. אחסן את UrDNA ב 4 ° C עד השימוש.

4. האסיפה של EC1 ו UrDNA על חרוזים מגנטיים

  1. מערבבים את חרוז מגנטי (MB) המניה היטב ולהעביר 100 μl של השעיה MB לצינור 1.5 מ"ל microfuge. מניחים את הצינור microfuge על בעל מתלה מגנטי לבידוד MB.
  2. הסר את supernatant ידי pipetting ולהוסיף 150 μl של חיץ מחייב (BB) אל הצינור. הסר את הצינור מבעל ובזהירות לחץ על הצינור כדי resuspend MB לפתרון הומוגנית. הימנע מתיז ההשעיה אל tאופ של הצינור או כובע. אם זה יקר, השתמש בצנטריפוגה benchtop לסובב את השאריות בקצרה חזרה ההשעיה.
  3. חזור על שלב 4.2 פעמים נוספות.
  4. כדי השעיה זו להוסיף 10 μl של 10 מיקרומטר EC1. בזהירות ומערבבים ידי הקשה על הצינור.
  5. דגירה הפתרון עם רעד עדין למשך 30 דקות. לחץ על הצינור כל 2-3 דקות כדי למנוע את המשקעים של MB.
  6. מניחים את הצינור microfuge חזרה על השבכה מגנטי לבודד את MB ולהסיר את supernatant ידי pipetting. שטפו את MB שלוש פעמים עם 150 μl של BB (כמתואר בשלב 4.2).
  7. לאחר הכביסה תושלם, להשעות את MB ב סך של 150 μl של BB. לפתרון זה, להוסיף 15 μl של UrDNA ומחמם פתרון 45 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מצננים את הפתרון בטמפרטורת החדר דגירה במשך שעה 2.
  8. מניחים את הצינור microfuge חזרה על השבכה מגנטי לבודד את MB ולהסיר את supernatant ידי pipetting.
  9. הוספת 100 μl של חיץ התגובה (RB). הסר tהוא microfuge שפופרת מהמדף מגנטי ובזהירות resuspend את MB.
  10. לשטוף שלוש פעמים MB יותר על ידי חזרה על שלב 4.9.
    הערה: supernatant השטף ניתן לבדוק במהירות כדי לקבוע אם unhybridized UrDNA עדיין קיים, דבר אשר עלול לגרום איתות חיובית כוזבת. הבדיקה יכולה להיעשות על ידי הוספת 10 μl של 50 אוריאה מ"מ ו 10 μl של 0.04% פנול אדום לפתרון לשטוף. המשך לשטוף את MB עד הפתרון לשטוף אינו גורם שינוי צבע. ההשעיה 100 μl מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

5. הכנת תאים חיידקיים 20

  1. Culturing E. coli מ מניות
    1. פלייט E. coli K12 (MG1655) על צלחות אגר LB ממלאי גליצרול תחת להבה או בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    2. בעזרת קצה פיפטה סטרילית, לגעת בעדינות את המניות גליצרול בקלילות פס פני השטח של צלחת אגר כדי למנוע ניקוב אגר LB.
    3. הפוך את המפוספסותצלחת לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות.
    4. חותם את הצלחת עם Parafilm ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מקסימלית של 3 שבועות.
  2. Culturing E. coli עבור ספירת תאים
    1. בתוך צינור תרבות סטרילי 14 מ"ל, לוותר 2 מ"ל של מרק LB.
    2. בעזרת קצה פיפטה סטרילית, לקחת קולוניה אחת מהצלחת אגרה מפוספס המוכן בשלב 5.1 ולהעביר אותו אל צינור התרבות.
    3. דגירת התרבות ב 37 מעלות צלזיוס ולנער ב 230 סל"ד במשך 14 שעות.
    4. סדרתי לדלל את תרבית החיידקים במרווחים של פי 10.
    5. עבור כל דגימה בדילול מלא, צלחת שווה חמישה 100 aliquots μl על צלחות אגר נפרד LB. הפוך את הצלחות לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות.
    6. ספירת התאים של כל דגימה כדי לקבל את ריכוז התאים הממוצע של כל דילול.
      הערה: 10 7 תאים משמשים לעתים קרובות כדי להגדיר מבחן לקמוס התייחסות E. coli כמו זה ברמה של E. coli יכול לעורר צבע מהיר צ'אןGE. עם זאת, מבחן לקמוס מבוצע כהלכה יכול לזהות נמוך כמו 500 תאים, כפי שפורט בסעיף התוצאות.
  3. הכנת E. תאי coli לבחינות
    1. במשך השעית תא רצויה, להעביר 1 מיליליטר של מנייה תרבותית לצינור 1.5 מיליליטר microfuge.
    2. צנטריפוגה התאים ב 6000 XG במשך 10 דקות ב 4 °. מוציאים בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה התא.
    3. הוסף 10 μl של חיץ התגובה התא גלולה ו resuspend התאים. Sonicate השעית התא למשך 5 דקות. מעביר את השעית התא אל תיבת קרח למשך 5 דקות.
    4. Sonicate השעית התא למשך 5 דקות אחרות.
    5. צנטריפוגה ההשעיה תא 13,000 XG במשך 10 דקות ב 4 °. השתמש supernatant לבדיקה (10 μl).

6. מבחן לקמוס

  1. בתוך צינור 1.5 מ"ל microfuge, כביסה מוקדמת הצינור על ידי הוספה vortexing 100 μl של חיץ התגובה (RB) בצינור microfuge והשלכת למאגר.
  2. העברת 15 μl של EC1 התאספו (פרוטוקול 4) אל הצינור microfuge שטף.
  3. שטפו את החרוזים מגנטי על ידי הנחת צינור microfuge על מדף מגנטי. הסר את supernatant ידי pipetting. הסר את צינור microfuge מהמדף, להוסיף 100 μl של RB, ובזהירות resuspend החרוזים המגנטיים.
  4. שטוף את פעמי MB עוד שני על ידי חזרה על שלב 6.3.
  5. מניח את צינור microfuge חזרה על השבכה המגנטית, להסיר את supernatant ולהוסיף 10 μl E. מדגם coli מוכן משלב 5.3.
  6. מערבבים את החרוזים מדגם ומגנטיות בקפידה על ידי הקשה בעדינות על הצינור microfuge.
  7. דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
  8. כדי התגובה, להוסיף 90 μl של DDH 2 O ובמקום צינור microfuge על מתלה מגנטית.
  9. לאחר כ -3 דקות של הפרדה מגנטית, להעביר בזהירות 85 μl של supernatant לצינור 0.5 מ"ל microfuge. למשוך את supernatant לאטלמנוע איסוף כל חרוזים מגנטיים.
  10. אל הצינור microfuge מעל להוסיף 15 μl של פנול אדום 0.04%, ו -100 μl של פתרון המצע.
  11. לצלם בזמנים קצובים להקליט שינוי צבע.
    הערה: השינוי ב- pH יכול גם להיות במעקב באמצעות מד pH עם microelectrode. ה- pH מתחיל צריך להיות כ 5.2-5.5 (הפתרון הוא צהוב). אם לא, הפתרון יכול להיות מותאם על ידי תוספת של 1 מ"מ Acetate הצפת pH 5.0).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

העיקרון של הנייר לקמוס חיידקי מוסבר באיור 1 המבחן משתמש בשלושה חומרי מפתח:. DNAzyme ביקוע-RNA כי הוא מופעל על ידי חיידק ספציפי, באוראז וחרוזים מגנטיים. DNAzyme משמש כאלמנט הכרה המולקולרי להשיג זיהוי ספציפי מאוד של חיידק עניין. באוראז וחרוזי מגנטים משמשים להשגה הולכים אותות של פעילות RNA-המחשוף של DNAzyme. זה כרוך ביצירת חרוזים מגנטיים המכילים conjugates באוראז-DNAzyme. בנוכחות של חיידק היעד, הצמדת RNA שלו ודבק DNAzyme. פעולה זו מעל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התרגום של הפעולה של פעילות מחשוף RNA של DNAzyme חיידק-מגיב מבחן לקמוס מתאפשר באמצעות השימוש באוראז ופרדה מגנטית, כפי שמודגם על ידי איור 1. למרות ההפגנה של נייר לקמוס השונה לגילוי חיידקים היא נעשה עם E. coli תלוי RNA-ביקוע DNAzyme, 5,19,20 העיצוב יכול להתארך באופן כללי לכל DNAzyme ביקוע-RNA. בהינתן הזמינות הרבה של DNAzymes ביקוע-RNA עבור analytes שונים ומתודולוגיות שונות לבודד DNAzymes חדש ביקוע-RNA מבריכות אקראית רצף עבור מטרות חדשות, אנו מצפים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המימון לפרויקט מחקר זה סופק על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) באמצעות מענק גילוי ל-YL.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)VWR AMRESCO0105
כדורי נתרן הידרוקסיד (NaOH) BIOBASIC CANADA INC.SB6789
Tris-baseVWR AMRESCO0497
חומצה בוריתAMRESCO0588
אוריאהVWR AMRESCOM123
תמיסת 40% אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (29:1)BIO BASIC CANADA INC.A0007
סוכרוזביושופ קנדה בע"מSUC507
ברומופנול כחולביושופ קנדה בע"מBRO777
קסילנציאנול FFSIGMA-ALDRICHX-4126
10% נתרן דודציל סולפטביושופ קנדה בע"מSDS001
חומצה הידרוכלורית (HCl)מעבדות קלדון בע"מ6026
נתרן כלורי (NaCl)ביושופ קנדה בע"מSOD001
4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-חומצה סולפונית (HEPES)ביושופ קנדה בע"מ.HEP001
מגנזיום כלוריד (II) הקסהידרטVWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada inc.TW508
אדנוזין טריפוספט (ATP)אמרסקו0220
נתרן אצטט טריהידרט (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
אלכוהול מסחרי אתנולP016EAAN
טטרמתילן-אתילנדיאמין (TEMED)אמרסקו0761
10% אמוניום פרסולפט (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)CALEDON LABORATORIES803540
UreaseSIGMA-ALDRICHU0251
1x תמיסת מלח פוספט חוצץ (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0.04% פנול אדוםSIGMA-ALDRICHP3532
10x T4 מאגר תגובה פולינוקלאוטיד קינאזLucigen30061-1
10x T4 DNA ligase מאגר תגובהBio Basics קנדהB1122-B
T4 DNA ליגאז (5 U/μ l)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) מרקAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
T4 פולינוקלאוטיד קינאז (10 U/μ l)Lucigen30061-1
E. coli K12 (MG1655)ATCCATCC700926
CentrifugeBeckman Coulter, Inc.
392187 לוחות זכוכיתCBS מדעיngp-250nr
מרווחים בעובי 0.75 מ"מCBS מדעיVGS-0725r
מסרק 12 בארותCBS מדעיVGC-7512
מנורת UVUVP95-0017-09
ספקטרופוטומטר (NanoVue)GE HealthcareN/A
לוח מתכתCBS מדעיCPA165-250
מערבולתVWR International58816-123
מכשיר אלקטרופורזה ג'לCBS מדעיASG-250
צלחות פטריVWR International25384-342
100 kDa MWCO מסננים צנטריפוגלייםEMD MilliporeUFC510024
חרוז מגנטי (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
מתלה הפרדה מגנטיניו אינגלנד BioLabsS1506S
צינורות מיקרופוגהSarstedt72.69
מסנן מזרק (0.22 & #956; m)VWR International28145-501
צינור תרבית 14 מ"לVWR International60818-725
חממת תרבית תאיםEppendorf ScientificM13520000
Branson מנקה אולטרסאונדמצלמת ברנסוןN/A
(Canon Powershot G11)CanonN / A
צינור חרוטי 50 מ"לVWR International89004-364

מקורות

  1. Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
  2. Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).
  3. Turner, A. P. Biosensors: sense and sensibility. Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).
  4. Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).
  5. Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
  6. Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
  7. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  8. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  9. Breaker, R. R. Making catalytic DNAs. Science. 290, 2095-2096 (2000).
  10. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
  11. Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
  12. Li, J., Lu, Y. A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions. J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).
  13. Liu, J., Lu, Y. A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).
  14. Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
  15. Liu, J., et al. A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).
  16. Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides. Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).
  17. Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design. PLoS One. 2, e1224(2007).
  18. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).
  19. Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection. Biomolecules. 3, 563-577 (2013).
  20. Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).
  22. He, S., et al. Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe. Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).
  23. Sumner, J. B., Hand, D. B. Isoelectric point of crystalline urease. J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).
  24. Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. 70 Years of crystalline urease: What have we learned. Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).
  25. Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk. Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).
  26. Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef. J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).
  27. Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).
  28. Strachan, N. J., Ogden, I. D. A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom. FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).
  29. de Boer, E., Beumer, R. R. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).
  30. Gracias, K. S., McKillip, J. L. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food. Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAzyme RNAE colipHUrea

מאמרים קשורים