מאמר שיטה

נביגה יעילה של שמר האפייה בתוך פורמט 96 multiwell

DOI:

10.3791/54584

⸱

17 בספטמבר 2016

 , 
1Department of Biology, University of Massachusetts Boston

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, נבגים של Saccharomyces cerevisiae מתבצעים בפורמט מרובה בארות 96.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתקופות של לחץ תזונתי, Saccharomyces cerevisiae עובר גמטוגנזה, המכונה נבגים. תאי שמרים דיפלואידים הרעבים לחנקן ופחמן יתחילו את תהליך הנבגים. תהליך הנבגים כולל מיוזה ואחריה היווצרות נבגים, כאשר הגרעינים ההפלואידים נארזים בנבגים עמידים לסביבה. פיתחנו שיטות לנבגים יעילים של שמרים ניצנים ב-96 צלחות מרובות בארות, כדי להגדיל את התפוקה של תאי שמרים מסננים לפנוטיפים של נבגים. שיטות אלו תואמות להקרנה עם שמרים המכילים פלסמידים הדורשים בחירה תזונתית, כאשר נעשה שימוש במדיה מינימלית מתאימה, או עם סינון שמרים עם שינויים גנומיים, כאשר נעשה שימוש במשטר קדם נבגים עשיר. אנו מוצאים כי עבור שיטה זו, אוורור במהלך נבגים הוא קריטי להיווצרות נבגים, ופיתחנו טכניקות להבטחת אוורור מספיק התואמות לפורמט הצלחת הרב-בארית 96. למרות ששיטות אלו אינן משיגות את רמת הנבגים האופיינית ~80% שניתן להשיג בניסויים מבוססי בקבוק בנפח גדול, שיטות אלו ישיגו באופן אמין כ-50-60% רמת נבגים בצלחות מרובות בארות בנפח קטן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נביגה ב השמרים ניצני נחקרה לספק תובנות היבטים רבים של הביולוגיה, כולל שליטה על הפרדה כרומוזום במהלך המיוזה 1, מנגנוני שחלוף 2, שליטה של פיתוח על ידי התא איתות 3, שליטה התזונתי של פיתוח 4, תעתיק הסדרת פיתוח 5, ובחינת יצירת הנבגים 6. יצירת נבגים כוללת אירוע חלוקת תא רומן מעורב ההיווצרות של תאי קרום חדשים בתוך תא אמא ואחריו בתצהיר של קיר נבג מגן 6. מחקרים אלה הבוחנים תאים sporulating מנצלים לעתים קרובות זן שמרים sporulating במהירות sK1, אשר יכול לעבור תהליך של נביגה בערך 24 שעות בצורה יעילה יחסית 7,8. למרות אופטימיזציה של תנאי נביגה בשביל נבגי שמרים תוארו 9-13, אלה לביצוע הניסויs בחן נביגה על התקשורת מוצק או נוזלי בתרבויות בקנה מידה גדול יותר שבו נביגה מתבצעת באמצעות צינורות תרבות או צלוחיות.

כאן אנו מתארים שיטה sporulating שמרים במתכונת צלחת multiwell 96. אנו מוצאים כי בשיטה זו, אוורור הוא קריטי עבור נביגה סינכרוני ויעיל, פיתחו טכניקות כדי להבטיח נביגה מספיק בפורמט multiwell קטן-נפח. Sporulating במתכונת צלחת multiwell 96 מאפשר לתאים להיות מוקרנים באמצעות טכניקות תפוקה גבוהה ריאגנטים מותאם במיוחד בפורמט צלחת multiwell, הקרנה כזה מדכאי גבוהה עותק באמצעות ספריית רעפים 14-16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנות לקראת נביגה

הערה:. התקשורת המתוארת בפרוטוקול זה מבוצע באמצעות 13,17 מתכונים ושיטות תקן הטבלה 1 נותנת את הניסוח עבור 1 ליטר של התקשורת השונה בשימוש בפרוטוקול זה.

bacto Peptone תמצית שמרים bacto אגר דקסטרוז אשלגן יצטט גליצרול DDH 2 O
צלחות YPG 20 גרם 10 גרם 20 גרם - - 30 מ"ל 970 מ"ל
צלחות YPD 20 גרם 10 גרם 20 גרם 20 גרם - - 1,000 מ"ל
נוזלי YPD 20 גרם 10 גרם - 20 גרם - - 1,000 מ"ל
נוזל YPA 20 גרם 10 גרם - - 20 גרם - 1,000 מ"ל
תקשורת נביגה - - - - 10 גרם - 1,000 מ"ל

טבלה 1:. ניסוחים מדיה סכומים ניתנים 1 ליטר של התקשורת. פרטים על תקשורתניתן למצוא מרכיבים של חומרי הטבלה.

  1. אם כל תאי Sporulating יהיו גנוטיפ הזהה, בצע הליך זה:
    1. זן שמרים ההפשרה לשמש לצלחת YPG (YPGlycerol). לגדול שמרים במשך 12-16 שעות על 30 מעלות צלזיוס. חשוב לציין, תאי sK1 עומדים גם sporulate, כך זני sK1 אסור להשאיר יותר מדי זמן על צלחות YPG, או שהם עשויים sporulate על הצלחת.
      הערה: זן טרי מופשר גדל על YPG הוא העדיף, כמו ניצול של גליצרול כמקור פחמן דורש זרחון חמצוני, ובכך בוחר עבור תאים בעלי הדנ"א המיטוכונדרי פונקציונלי. יש sK1 תאים נטייה לאבד הדנ"א המיטוכונדרי פונקציונלי ולהיות petites. הדנ"א המיטוכונדרי פונקציונלי דרוש נביגה.
    2. שמרים Streak מהצלחת YPG לצלחת YPD (YPDextrose) עבור מושבות אחת. לגדול שמרים על 24-28 שעות צלחת YPD על 30 מעלות צלזיוס.
    3. אחרי בערך 36-48 שעות של צמיחה על תקשורת המוצקה YPD, להתחיל 25 מיליליטר תרבות YPD באמצעות מושבה אחתמהצלחת YPD. לגדול בתרבות זו עד תאים על OD 600 = 4.0 ל -7.0. בצע פעולה זו על 30 מעלות צלזיוס לילה חממה רועד, רועד ב 220 סל"ד.
    4. מתרבות YPD, השתמש כמות מתאימה של תאים להתחיל 1,000 מ"ל של YPA (YPAcetate) תרבות הוא OD 600 = 0.1 עבור כל צורך בצלחת 96 באר בסעיף 2. לגדול השמרים 30 ° C רועד חממה (רועד ב 220 סל"ד) עד התרבות OD 600 היא בין 1.3 1.5.
      הערה: לחסן 100 מ"ל של תרבות YPA עבור 96 כל צלחת multiwell שיוקרנו בסעיף 2. לדוגמה, אם ההקרנה ארבע 96 צלחות multiwell, 400 מ"ל של תרבות YPA יהיה צורך. החל נפח תוספת 10% בתרבות YPA יש צורך להגן מפני איבוד מסת אוויר. בדרך כלל, זה ייקח בין 12-16 שעות עבור תאים להגיע OD המתאים 600; את משך הזמן עשוי להשתנות תלוי גנוטיפ של זן השמרים. YPA הוא התקשורת presporulation. Pregrowthב תצטט עוזר להשרות ביטוי של גנים (כגון IME1) דרושי נביגה יעיל סינכרוני 6.
    5. ספין 1,800 XG בצנטריפוגה בראש הטבלה במשך 5 דקות עד גלולה התאים הגדלים YPA. לשטוף את התאים 1X עם 0.5 נפח של מים ללא יונים autoclaved סטרילי. ספין שוב, וזורקים לשטוף. Resuspend תאי תקשורת נביגה נפח 1x. המשך לסעיף 2.
  2. אם באמצעות תאים עבור נביגה כי הם של גנוטיפים שונים, (כלומר, הפך עם פלסמידים שונים או המכילים מוטציות שונות, בדרך כלל מתקבל ומאוחסנים כמו מניות קפוא), תאי מערך של גנוטיפים שונים לפורמט multiwell 96. לאחר מכן, בצע את התהליך הבא:
    1. השתמש Frogger 96 שיניים סטרילי להעביר תאים ממניות קפוא מופשר ב 96 צלחת multiwell (ים) על גבי מדיה YPG מוצק. לגדול לילה שמרים על 30 מעלות צלזיוס.
    2. באמצעות Frogger 96 שיניים סטרילי, להעביר תאי תקשורת מוצקה YPG גבי מדיה מוצקה YPD או סלקטיביתתקשורת מוצקה (כלומר, תקשורת מינימאלית סינטתית חסרת חומצות אמינו, אם התאים מכילים פלסמידים הדורשים מבחר). לגדול שמרים ב 30 מעלות צלזיוס עד מושבות נוצרות עבור כל זן, בדרך כלל 1 יום על YPD ו -2 ימים אם התקשורת סלקטיבית היא הכרחית.
    3. Aliquot 1.2 מיליליטר של תקשורת הנוזלת YPD או תקשורת הנוזלת סלקטיבית לבאר כל צלחת multiwell 96 עמוק 2 מיליליטר. העברת תאים מן התקשורת מוצקה לתוך תקשורת נוזלית באמצעות פרוגר, מכסים עם מכסה פלסטיק מוחזק במקום על ידי קלטת, ולגדול לילה 30 ° C שייקר, רועד ב 220 סל"ד.
      הערה: כדי למזער זיהום, אטמים באמצעות מכסי הפלסטיק מתוך צלחת הפטר מלבני. החזק מכסה במקום באמצעות נייר דבק, כך זרימת האוויר מוגבלת מינימאלית.
    4. צלחות צנטריפוגה ב 1,800 XG במשך 5 דקות, באמצעות צנטריפוגות דלי מתנדנד עם מתאמים כדי להכיל 96 צלחות היטב. יוצקים את התקשורת מתאי; להוסיף 500 μl YPA זה היטב resuspend התאים pelleted ב YPA. כיסויעם מכסה פלסטיק מוחזק במקום על ידי קלטת.
    5. לגדל תאים עבור 15 שעות ב 30 מעלות צלזיוס חממה רועדת, רועד ב 220 סל"ד. המשך לסעיף 2.

2. תאים Sporulating במתכונת 96 multiwell

  1. להוסיף אחד מהם 3 מ"מ חרוז זכוכית מוצקה סטרילי או בר ומערבבים מגנטי סטרילי 5 מ"מ x 2 מ"מ לבאר כל צלחת 96 גם עם 1.3 מ"ל בארות. (ראה תוצאות נציג להלן דיון בשאלה האם להשתמש חרוז או בר ומערבבים.)
  2. אם כל התאים שיוקרנו הם מאותו גנוטיפ, ללכת 2.2.1. אם תאים שיוקרנו הם של גנוטיפים שונים, ללכת 2.2.2.
    1. קח התאים משלב 1.1.5 ו aliquot 500 μl של תאים בתוספת התקשורת לבאר כל 96 הצלחת multiwell. מכסים עם מכסה פלסטיק מוחזק במקום על ידי קלטת. המשך 2.3.
    2. תאי ספין הנמצאים YPA מ 1.2.4 1,800 XG במשך 5 דקות, באמצעות צנטריפוגות דלי מתנדנד עם מתאמים כדי להכיל 96 צלחות היטב. יוצקים שלמדיה מתאי f. הוסף 500 μl של התקשורת נביגה זה היטב resuspend התאים pelleted בתקשורת נביגה. מכסים עם מכסה פלסטיק מוחזק במקום על ידי קלטת. המשך 2.3.
  3. אם באמצעות חרוז זכוכית, דגימות מקום חממה רועדת ב 30 ° C ולנער ב 220 סל"ד במשך נביגה. אם אתם משתמשים במכשיר בר ומערבבים מגנטיים, דגימות מקום בצלחת ומערבבים בתוך חממת 30 מעלות צלזיוס במשך נביגה.
    הערה: המהירות והמערבבים המדויקת עבור הברים ומערבבים המגנטיים אינה חשובה מאוד, כל עוד כל הברים נעים במרץ ואת התרבות מוגזים.
  4. כדי לעקוב אחר התקדמות דרך נביגה, לסגת דגימות מתרבות sporulating להדמיה, להוסיף 6 μl של תאים מן התרבויות sporulating 24 μl של התקשורת נביגה בצלחת coverslip 96 באר (1: 5 דילול). השאירו תאים להסתפק 5 דקות לפני בחינת התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.
    הערה: תאי sK1 סוג ברים, נבגים בוגרים קומפקטיים יהוו ידי 36 שעות לאחר העברת מדיה נביגה. התקדמות דרך נביגה ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ באמצעות סמנים ניאון, כגון סמן גרעיני (כלומר, Htb2-mCherry 18) לבחון את חלוקת meiotic או סמן קרום prospore (כלומר, G20 19) לבחון morphogenesis נבג. לחלופין, היווצרות נבגי refractile ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופ Nomarski דסק"ש החל כ -12 שעות לאחר העברה למדיה נביגה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להעריך בפרוטוקול זה, יעילות נביגה המתקבלת sporulating תאי צלחות multiwell (כמתואר לעיל) הושוותה תאים התנבג באמצעות כמויות גדולות יותר צלוחיות (טבלה 2). השימוש צלחות multiwell לא להשיג את היעילות הגבוהה לראות כאשר sporulating צלוחיות, שבו ~ 80% יעילות ניתן לראות באופן שגרתי. Sporulating צלחות multiwell עם אוורור נאה (המסופק על ידי חרוזי זכוכית או ברים ומערבבים) יכולה להשיג יעילות נביגה מספיק גדול מ -50%, עם התוצאות הטובות ביותר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול sporulating שמרים sK1 במתכונת multiwell 96. אוורור הוא מפתח עבור נביגה יעילה, אשר מחייבת שימוש או בר ומערבב או חרוז זכוכית בכל טוב. כאשר תאים התנבג בצלחת multiwell 96 בתוך חממה רועדת בלי שאחד חרוז או ומערבבים ברים, תאים אינם sporulate ביעילות. רק עלייה קטנה יעילות נביגה נתפסת כאשר התאים התנבג מבלי שאיש חרוז או בר ומערבבים בתוך חממה רועד, לעומת להיות ב 30 מעלות צלזיוס ללא תסיסה (טבלה 1; 17% ב שייקר vs 10% להציב על ומערבבים צַלַחַת). באופן דו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ג'וזף פ הילי מאוניברסיטת מסצ'וסטס בבוסטון (LSH) ו R15 GM86805 מ- NIH (LSH). SMP הוא נתמך בחלקו על ידי עמיתי Sanofi-ג'נזיים באוניברסיטת מסצ'וסטס בבוסטון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Nunc 1.3 מ"ל צלחותDeepWellThermoScientific 260251המשמשות לנבגים
Nunc 2.0 מ"ל צלחות DeepWellThermoScientific278743המשמשות לגידול קדם נבגים, שלב 1.2.3
חרוז זכוכית 3 מ"מפישר11-312Aמשמש לנבגים
5 מ"מ x 2 מ"מ מוט ערבוב, חבילה של 12פישר14-511-82משמש לנבגים
96 ובכן froggerV& P ScientificVP407דרוש עבור
מכונת צילום ספרייהV& P ScientificVP381דרוש לשלב 1.2; לשימוש עם
צלחת פטרי מלבניתThermoScientific264728דרושה לשלב 1.2
דרושה211677בקטו פפטוןBD
תמצית שמריםBD212750דרושה למדיה
Bacto AgarBD212750דרושה למדיה
דקסטרוזפישרD16-3דרוש למדיה
אשלגן אצטטפישרP171-500דרוש למדיה
גליצרולפישרG33-500דרוש למדיה
שחור 96 באר צלחת תחתונה מזכוכיתMatTekPBK96G-1.5.5-Fדרוש לשלב 2.4
שלב 1.2 למדיה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  2. Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
  3. Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
  4. Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).
  5. Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
  6. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  7. Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
  8. Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
  9. McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
  10. Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
  11. Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
  12. Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
  13. Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
  14. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  15. Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836(2011).
  16. Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. , (2016).
  17. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  18. Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
  19. Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  20. Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Saccharomyces cerevisiae96

מאמרים קשורים