מאמר שיטה

לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית Intravital בריאה עם חלון הדמיה מיוצב אבק

13.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54603

⸱

6 באוקטובר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיה מולטיפוטונית לביצוע הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה של תא בודד של הריאה השלמה בזמן אמת באמצעות חלון הדמיה מיוצב ואקום.

תקציר

גרורה לאתרים משניים כגון ריאות, כבד ועצמות הוא אירוע טראומטי עם שיעור תמותה של כ 90% 1. האתרים הללו, הריאה הוא קשה ביותר על מנת להעריך באמצעות דימות אופטי intravital בשל העמדה הסגורה שלו בתוך הגוף, הטבע עדין התפקיד חיוני בשמירת פיזיולוגיה נכונה. בעוד שיטות קליניות (טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), הדמיית תהודה מגנטית (MRI) וטומוגרפיה ממוחשבת (CT)) מסוגלות לספק תמונות לא פולשנית של רקמה זו, אין להם את הרזולוציה צורכת לדמיין את אירועי זריעה המוקדמים, עם פיקסל בודד המורכב מכמה אלפי תאים כמעט. דגמים נוכחיים של קביעת זריעת ריאות גרורתי שאירועים רק לאחר הגעתו של תאים סרטניים הם דטרמיניסטיים להישרדות והצמיחה הבאה. משמעות הדבר היא כי כלי הדמיה intravital בזמן אמת עם רזולוציה תא בודד 2 נדרשים על מנת להגדיר את פנוטיפים של cel זריעהls ולבדוק מודלים אלה. בעוד הדמיה אופטית גבוהה ברזולוציה של הריאה שבוצעה באמצעות הכנות vivo לשעבר שונות, ניסויים אלה הם בדרך כלל מבחני פעם אחת נקודות והם רגישים חפצי מסקנות אפשריות שגויות בשל הסביבה שינתה באופן דראמטי (טמפרטורה, שפע, ציטוקינים וכו ' וכתוצאה מכך) מהסרת מחלל החזה ומערכת הדם 3. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי הדמיה אופטית intravital זמן לשגות של הריאה השלמה אפשרי באמצעות ואקום התייצב 2,4,5 חלון הדמיה עם זאת, פעמי הדמיה טיפוסיות היו מוגבלות כ -6 שעות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לביצוע הדמיה זמן לשגות intravital לטווח ארוך של הריאה ניצול חלון כזה על פני תקופה של 12 שעות. רצפי הזמן לשגות התמונה שהושגו באמצעות שיטה זו לאפשר להדמיה לכמת תאי תאי אינטראקציות, דינמיקת הממברנה זלוף וסקולרית הבריאה. בנוסף, אנו דescribe טכניקת עיבוד תמונה שנותנת תצוגה ברורה וחסר תקדים על נימי הדם זעירות ריאות.

מבוא

הדמיה ברזולוציה גבוהה אופטית intravital הוכיחה להיות חיוני להבנת תהליכים ביולוגיים רבים, ומאפשרים פרמטרי תא בודד ואת המשנה הסלולר להימדד לכמת. בחקר הסרטן, הדמיה intravital של תאים סרטניים ואת סטרומה הובילה לגילוי של אינטראקציות microenvironmental רבים 6-11 שנמצאים רק החיה בשלמותה.

תגליות על microenvironments הקשורים intravasation והפצת תאים סרטניים בסרטן השד באמצעות דימות אופטי ברזולוציה תא בודד in vivo אף הביאה סמנים חדשניים הפרוגנוזה ועל התגובה לטיפול בחולי סרטן השד 12-16. טכנולוגיות ההדמיה הטובות ביותר הזמינות לצפייה עמוקה בתוך האיברים חיוניים הפנימיים שלמים הן השיטות הקליניות (MRI, PET, CT) אשר מציעות נופים מצוינים של האיבר כולו והוא יכול לחשוף פתולוגיות עוד לפני שהם מייצרים סימפטומים קליניים. הם אינם מסוגלים, however, כדי לחשוף את השלבים המוקדמים של גרורות ואת המנגנונים התאיים נהיגת התקדמות גידול בשל חוסר ברזולוצית תא בודד. עד גרורות סרטני בריאות גלויות באופנים אלה, הם מבוססים היטב התרבה. נוכח ההערכה כי 90% של תאים סרטניים שהפיץ מגיעים אל הריאות או אינם שורדים 17 או בתחילה להישאר רדומים 18, ואת התצפית כי הם מגיעים הרבה יותר מוקדם מהצפוי בעבר 19, הדמיה השלבים המוקדמים ההגעה והישרדות הופך קריטי הבנת התהליך של זריעה והישנות גרורתי של גידול באתרים מרוחקים.

ביצוע תצפיות אלה הריאה הוכיח קשה מאוד עם זאת; הרוב המכריע של מחקרי הדמיה נצל הכנות vivo לשעבר או explant 20-23, אשר רק לתת תצוגה לתוך הריאות בנקודות פעם אחת. בעוד הכנות אלה מספקות מידע שימושיrmation, הם לא נותנים הבנה מלאה של אינטראקציות, יחסי סיבה ותוצאה, ודינמיקה המתרחשות בין הרכיבים השונים של microenvironment. עדר מערכת דם תקין (וחוסר איזון קשור של הומאוסטזיס) ואת הניתוק משאר המערכת החיסונית של הגוף עושה את זה שוקק כדי לאמת את המסקנות כי ההכנות האלה ליצור ברקמת שלמי in vivo.

קבוצות רבות בצעו הדמית intravital של הריאה השלמה 2,4,5,24-33 עם Wearn וגרמנית להיות הראשון כמנתח לחשוף את שכבת פלאורלי 24 וטרי הראשון שניצלו את חלון הדמיה מושתל 25.

הדמיה ברזולוציה גבוהה הריאה מתעכבת מאוד על ידי התנועה המתמדת וטכניקות מספר של הריאות פותחו כדי להתגבר על מגבלה זו. ואגנר Filley 27 למד את התנועה הטבעית של הריאה כלביםועוצב הפרוטוקול כירורגית שלהם לאתר החלון המושתל שלהם מעל אזור יחסית נייח בעוד וגנר מנוצל ואקום כהכנה כירורגית חלונו כדי לשתק את הרקמות 28. מאז אותה תקופה, מגוון של טכניקות כבר נוצל לתדמית הריאה כולל: הידוק הסמפונות, דום נשימה רציפה הדמיה מגודרת, רכישת oversampled, הדבקה של אונת ריאת ואקום 34. לכל אלה היתרונות והחסרונות שלה ולא טכניקה אחת התפתחה כנעלה על 34 אחר. לדוגמא, clamping הסמפונות דום נשימה רציפה לשנות את חילופי דברים הרגילים של גזי הריאה ועלולים לגרום תמט ריאות. הדמיה מגודרת ורכישת oversampled אינן סובלות חסרון אלה אך דורשים במהירות גבוהה או ציוד הדמיה מיוחד לא נגיש לציבור רחב. לבסוף הוא דבק של הריאה ואת הטכניקה ואקום להימנע הם החסרונות שהוזכרו לעיל, אך עשויים להפגין פגיעה הנגרם כוח גזירה אם טיפול אינו taken. בשנים האחרונות, חלון הוואקום כבר מיניאטורי ומותאם לשימוש בעכברים באמצעות מיקרוסקופיה confocal multiphoton 4,5,33 ו הדמיה ברזולוציה גבוהה מעולה שהושג 2. טבלת 1 מסכמת היסטוריה עשירה זה ומדגיש את הניירות האלה המתארים רומן התקדמות בשימוש חלונות הדמיה ריאות intravital.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ intravital multiphoton המורחב זמן לשגות כדי גרורות תמונת הריאה החייה, השלמה עם החלטת subcellular הגבוהה ביותר האפשרית. תמונות נרכשות עבור עד 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton מצויד בעדשת מטרת צמצם המספרי גבוהה צינור מכפיל מרובה (PMT) גלאי. מודלים עכבר מהונדס מנוצלים מקרופאגים יליד תווית fluorescently יחד עם dextran משקל מולקולרי גבוה פלורסנט תאים סרטניים טרנספקציה פלורסנט חלבון (לתייג התאים בכלי הדם ואת הגידול respectively). בעוד שבחירה זו של תאים שכותרתו fluorescently מאפשרת הדמיה של אינטראקציות מקרופאג תא האנדותל תאים סרטניים ודינמיקה, פרוטוקול זה יעבוד עבור כל זן של העכבר פלורסנט או ללא ניאון. לאחר רכישה, תנועה להיסחף שיורית (אם בכלל) מסולקת באמצעות פיג'י תוסף 35,36 וממוצע זמן פקוד מאקרו מותאמת אישית בערוץ וסקולרית לחסל הבהוב הנגרם על ידי תאי דם במחזור ללא תווית.

בעוד פרוטוקול זה מתמקד גרורות הדמיה, הטכניקות החלות על תהליכים ביולוגיים רבים אחרים הנצפה עם הדמית תא בודד ברזולוציה גבוהה הריאה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים מתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות לשימוש בעלי חיים בעלי חוליות, כוללים אישור מראש על ידי ע"ש אלברט איינשטיין טיפול בבעלי חיים מוסדיים לרפואת ועדת שימוש.

1. במודל עכבר היצירה שכותרתו fluorescently תאים סרטניים

  1. הכן 100 מ"ל של 0.1% (w / v) אלבומין בסרום שור / בופר פוספט (BSA / PBS) חיץ על ידי ערבוב 0.1 גרם של BSA עם 100 מ"ל של PBS.
  2. כן תאים סרטניים שכותרתו fluorescently ידי transfection היציב.
    הערה: כאן אנו משתמשים בתאי E0771-LG, נגזרים גרורתי מאוד של תאי אדנוקרצינומה חלב E0771 עכבר 37 כי בודדו גרורות שפותח הריאה של עכבר C57BL / 6 מוזרק לוריד עם תאי E0771 הורים 38.
    1. 24 שעות לפני transfection, צלחת 1 x 10 5 תאים EO771-LG על צלחת בתרבית רקמה 60 מ"מ על 2 מ"ל של antibioFBS חינם 10% טיק (בסרום שור עוברי) DMEM (בינוני הנשר השונה של Dulbecco) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    2. בזמן transfection, דגירה 2 מיקרוגרם של וקטור חלבון פלואורסצנטי עם 10 μl של מגיב transfection למשך 30 דקות לפני הוספת 190 μl של התקשורת סרום מופחת.
    3. EO771-LG לשטוף תאים עם בופר פוספט של Dulbecco (D-PBS) פעם ומוסיפים את תערובת transfection בעדינות.
    4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 6 שעות.
    5. שוטפים את התאים והתרבות transfected ב 2 מ"ל של DMEM מלאה (10% FBS, פירובט 1 מ"מ, 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין) עבור 2 ימים.
    6. שטפו תאים עם 2 מ"ל של PBS סטרילי, להוסיף 500 μl של 0.25% טריפסין- EDTA דגירה במשך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    7. אסוף השעית תא ומערבב עם 1 נפח לפחות של DMEM המלא ומסובב ב 280 x ז.
    8. Resuspend התאים 1 מ"ל של DMEM מלאה ולהרחיב את תרבית תאים לתוךצלחת בתרבית רקמה 10 ס"מ.
    9. התחל בחירה של תאים transfected על ידי הוספת 700 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אנטיביוטיקה סלקטיבית G418 8 מ"ל של DMEM מלאה והתרבות במשך שבוע, שינוי בינוני כל שלושה ימים.
  3. להעשיר את האוכלוסייה פלורסנט מתאי transfected שהיו תחת סלקציה G418 ידי מיון התא המופעל פלואורסצנטי (FACS) 39,40.
    1. שטפו תאים עם 5 מ"ל של PBS ולהוסיף 1.5 מ"ל של 0.25% טריפסין.
    2. דגירה של 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ומערבב עם של DMEM המלא אחת נפח לפחות.
    3. אסוף ההשעיה תא ספין למטה ב 280 XG מחדש להשעות התאים 1 מ"ל של 0.1% סטרילי (w / v) חיץ BSA / PBS.
    4. סנן את ההשעיה התא דרך רשת 40 מיקרומטר ולהתאים את עוצמת הקול עד 1 מ"ל עם 0.1% BSA / PBS חיץ למיון.
    5. FACS-למיין את האוכלוסייה המבריקה 10% בהתבסס על ספקטרום קרינה באמצעות סדרן FACS 41.
    6. תרבות התאים מסודרים לעוד שבוע uמבחר nder (700 מיקרוגרם / מיליליטר G418 ב DMEM המלא).
    7. לבחור מחדש fluorescently תאים שכותרתו ידי זרימת cytometry ידי חזרה על שלבים 1.3.1 עד 1.3.6 שוב.
    8. לאחר סיבוב שני של בחירה, trypsinize, לסנן מחדש להשעות תאי BSA 0.1% / PBS כמתואר (צעדים 1.3.1-1.3.4). ולהתאים הריכוז 2 x 10 6 תאים / מ"ל עבור תא בודד מיון לתוך 96 צלחות היטב באמצעות סדרן FACS.
    9. כן 3-5 96 צלחות גם עם 100 μl של DMEM המלא לאיסוף. כדי לשפר את ההישרדות לאחר המיון, להוסיף 100 μl של מדיום תרבות המסונן מן המנות שבו תאי EO771-LG גדלו 42.
    10. לאחר מיון התאים לתוך 96-גם הצלחות, לחזור תאים לתרבות עבור 2 ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
    11. זיהוי בארות עם שיבוטים אחד קיימא על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה 5x.
    12. Trypsinize ולהרחיב שיבוטים קיימא ולהקפיא תאים עבור גיבוי.
      1. לשטוף בארות עם GRבשל שיבוטים עם 100 μl של PBS סטרילית. הוסף 50 μl של 0.25% w / v טריפסין דגירה 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 50 μl של שלמה DMEM ולהעביר V-תחתונה או עגולה סטרילי צלחת 96-היטב מלמטה ספין למטה ב 280 XG במשך 5 דקות.
      2. תאי Resuspend ב 100 μl של 700 מיקרוגרם / מיליליטר G418 DMEM מלא צלחת כל שיבוט ב 12 גם צלחות. להוסיף 400 μl של DMEM להשלים עם G418 והתרבות עד ומחוברות.
      3. לשטוף בארות עם 500 μl של PBS, להוסיף 100 μl של טריפסין 0.25% ו דגירה 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוספת 100 μl של DMEM המלא ומסובבים במשך 5 דקות ב g 280 x. Resuspend התאים 100 ul של DMEM להשלים עם תאי G418 צלחת ב 6 צלחות היטב עד ומחוברות.
      4. לאחר ומחוברות, תאים trypsinize, ספין למטה גלולה ב 10% DMSO ב FBS להקפיא מניות התא.
      5. שמור 1/10 של המתלים תא בתרבות ידי ציפוי אותם במנות בתרבית רקמה 100 מ"מ להערכת פוטנציאל גרורתי שלהם.
  4. בחן את הפוטנציאל גרורתי של שיבוטים שנבחרו.
    1. Trypsinize מחדש להשעות התאים מלוחים לריכוז של 2.5 x 10 6 תאים / מ"ל ו להזריק 200 μl לתוך C57BL / 6 עכברים לווריד דרך וריד הזנב.
    2. לאחר 2 שבועות, לאסוף רקמת ריאה כפי שתואר לעיל 23 ולכמת ניטל גידול לפי ספירת משטח או שיטת stereological 43. בחר שיבוטים עם פוטנציאל גרורתי גבוהה הדמיה intravital.
  5. תרי MacBlue (אמרגן ספציפי מיאלואידית נהיגת חלבון פלואורסצנטי ציאן (ביטוי CFP) (Csf1r -GAL4VP16 / כטב"מ-ECFP 16)) עכברי כתב 44.
    הערה: בדרך כלל, עכברים בין 8 ל 12 שבועות משמשים, אבל עכברים מוקדם ככל 7 ו מאוחר ככל 20 שבועות נבדקו כדי לעבוד גם כן.

2. multiphoton מיקרוסקופ להגדיר הכנה הדמיה

הערה: בעוד פרוטוקול זה יכול להתבצע על כל מטרמיקרוסקופ ultiphoton, המערכת בשימוש לרכוש את הנתונים המוצגים בפרוטוקול זה תואר בעבר בפירוט 45.

  1. הפעל את כל מרכיבי מיקרוסקופ ליזר כולל לייזרי שני פוטונים ואת הגלאי לפחות אחד קדימה שעה מן מועד ההדמיה הרצויה.
  2. רגע לפני הניתוח, למדוד את כוחו של קלט אור המיקרוסקופ על ידי הנחת הראש של מד הכוח האופטי בנתיב קרן ממש לפני מיקרוסקופ ולהתאים את ידיות במראה חלל סוף לייזר עד עוצמת האור המקסימלית ב -880 ננומטר הוא לקרוא על מד הכח האופטי.

3. מערכת אבק גדר

  1. מדביקים את coverslip לתוך חלון הדמיה (משלימה איור 1) עם cyanoacrylate. אפשר לפחות שעה 4 עבור דבק יבש לחלוטין.
    הערה: זה צעד יכול להיעשות גם לפני הזמן.
  2. חותך את קצה פיפטה 100 μl על השורה הראשונה של הפתח הקטן וחברתי את הקצה נימול אל v הדקצינור acuum.
  3. חבר את מערכת הוואקום פי איור 1 ו משלימים איור 2.
  4. עם ואקום על ואת הקצה הפתוח חסום, להתאים את הרגולטור ואקום <3 inHg.
    הערה: התאמה סופית של רמת הוואקום תבוצע על ידי תצפית של כלי הדם בגוף החי.
  5. למרוח שכבה דקה של גריז נפט לחלק התחתון של הצלחת ההדמיה כדי למנוע את מדיום טבילת עדשה האובייקטיבי מלהיות רשע משם על ידי צלחת ההדמיה.
  6. מניחים את הצלחת הדמיה על הבמה מיקרוסקופ.
    הערה: צלחת ההדמיה המותאמת אישית (משלימת איור 3) היא גיליון 1/8 "אלומיניום עבה במכונה הוא להשתלב במרחב כנס במה עם-חור במרכז להחזקת חלון ההדמיה.
  7. הכנס את חלון ואקום לתוך צלחת הדמיה עם coverslip למטה.
  8. לעקר את כל המשטחים ומכשירים כולל צלחת הבמה הדמיה, ולנצח הדמיהדאו עם 70% אתנול.
  9. חבר את הקצה החתוך של קצה פיפטה אל החלון ואקום ואת קלטתי את הצינור עד צלחת ההדמיה.
  10. תביא את הקרוב האובייקטיבי לחלון הדמית מקום טיפה גדולה של מים בין המטרה לבין coverslip.
  11. ודא שאין נזילות מן coverslip ידי חסימת הפתיחה המרכזית של חלון הוואקום והאימות כי טיפת המים בין המטרה לבין coverslip לא מקבלת aspirated.
    הערה: כדור עכבר מחשב בסגנון ישן ממוקם מעל החלון שימושי חוסם את הפתח המרכזי.

4. ניתוח

  1. מכינים את אזור הניתוח סטרילי.
    1. שמים את כל המכשירים בהישג יד. לעקר את כל המשטחים ומכשירים כולל אזור הניתוח, וכלים כירורגית עם 70% אתנול.
  2. עניבה אורך 3 אינץ 'של 2-0 תפר את הקטטר, אינץ ¼ מעל התותב בקשר כפול.
  3. כן fol קטטר וריד זנבגעיית הפרוטוקול בהוצאה ואח Harney. 46.
  4. באמצעות מנורת חום אינפרא אדום (IR), לחמם את החיה בכלוב שלה עבור ~ 5 דקות כדי להגביר את זרימת הדם בווריד הזנב כדי לסייע בהכנסת קטטר. מומלץ לשמור על בעלי החיים חממו לטמפרטורות פיסיולוגיות לאורך ההליך הכירורגי או באמצעות מנורת חום או כרית חימום.
  5. להרדים את החיה עם isoflurane 5% ולוודא כי אין בתגובה קמצוץ הבוהן.
  6. החל משחת עיניים לעיניים של החיה.
  7. השתמשו בקרם ידיים מקריח במשך 10-30 שניות כדי להסיר שיער מהאגף השמאלי של החיה; מן קו האמצע של החזה כדי ¼ של הלוך מבית השחי עד מתחת החזה.
  8. נקה כל קרם עודף לעקר עור חשוף עם 70% אלכוהול.
  9. צרף מזרק סטרילי מלא PBS אל קטטר וריד הזנב וכנס קלטת במקום בעקבות הפרוטוקול בהוצאת Harney et al. 46. ודא הקלטת היא דבקה באופן מאובטח אל המחט עצמה אינה חופשית בפער בין הזנב ואת קלטת.
  10. לצנרר העכבר הבא או הפרוטוקול בהוצאת Das et al. 47 או על ידי DuPage et al. 48
  11. הפעילו את מכונת ההנשמה ולהגדיר אותו לספק 135 נשימות לדקה ו -200 μl של תערובת isoflurane חמצן.
  12. חבר את הקטטר קנה הנשימה אל הנשמה.
  13. הזז את העכבר אל אזור הניתוח. קח בזהירות רבה שלא לעקור את הקטטר.
  14. לקשור את תפר 2-0 סביב החוטם של העכבר תחת השיניים הקדמיות.
  15. קלטתי את הקטטר אל החוטם.
  16. קלטת את forelimb שמאל כדי הקטטר כדי לשמור אותו מחוץ את שדה הניתוח.
  17. מנמיך את הרדמת isoflurane לרמת תחזוקה של 2.5% ולאמת אין בתגובת קמצוץ בוהן.
  18. בעזרת מספריים חדים, להסיר 1 ס"מ 2 של העור מעל בית החזה השמאלי.
  19. רם tהוא חלב כרית שומן ולליבון כל כלי דם חשופים עם עט הכווייה.
  20. לכרות את כרית השומן על ידי חיתוך עם המספריים החדים.
  21. הסר את שכבת השריר למטה אל כלוב הצלעות על ידי חיתוך עם המספריים החדים. יש להיזהר שלא לחתוך את ריצת הווריד השחי בבסיס של forelimb.
  22. שימוש במלקחיים כדי לתפוס ולהרים את הצלעות 6 ה. בעזרת המספריים החדים שנערכו בזווית רדודה (~ 5 °) לחתוך את הצלעות ליד קצה הפתח בעור. קח בזהירות רבה שלא לגעת רקמת הריאה החשופה.
  23. להרחיב את הפתח בקיר החזה לחשוף את אונת הריאה כולו על ידי הסרת ארבע צלעות רצופות.
    הערה: שמור את הפתיחה במרחק של לפחות 5 מ"מ מעצם החזה כדי למנוע את הלב.
  24. רם בזהירות את העכבר תוך כדי אחיזת הקטטר הזנב קנה נשימה להזיז את העכבר על במת הדמית מיקרוסקופ.
  25. עם מעל ואקום, למלא את התא של חלון ואקום עם PBS.
  26. הפוך את העכבר ולמקם את חשופהריאות על חלון הדמית ואקום.
  27. לאט להפעיל את הוואקום בכ 3-5 אינץ 'כספית באמצעות שסתום הכדור.
  28. מניחים רתמו עשוי מנייר הדק מקופל לשתיים פעמים על החזה של עכבר הקלטת לצלחת הבמה כפי שמוצג משלים איור 2.
  29. קליפ חיישן הירך של oximeter הדופק אל החלק העליון של הירך של החיה ולהתחיל את התוכנה.
  30. מניח את החדר הסביבתי על הבמה ולהדליק את החום כדי לשמור על העכבר בטמפרטורה פיזיולוגית.
  31. להפחית את רמת isoflurane 1-1.5% כדי לשמור על הרדמה ולתחזק את זרימת הדם.

5. הדמיה Intravital

  1. תביא את הצמצם מספרי 25 x 0.95 (NA) העדשה האובייקטיבית הקרוב coverslip ולהוסיף טיפה גדולה של מים ביניהם.
  2. שימוש במצב epifluorescence, להציג את ערוץ FITC ולהביא את רקמת הריאה אל המוקד.
  3. אם לא נעשה לפני הניתוח, אניתאים סרטניים nject באמצעות קטטר וריד הזנב.
    1. נתק את המזרק PBS מן קטטר זנב וריד.
    2. טען מזרק סטרילי עם 100 μl של השעיה תאים סרטניים (2 x 10 7 תאים / מ"ל ב המרבי PBS).
      הערה: שלב זה יכול להיעשות מראש ללמוד הגעת תאים סרטניים אל הריאות בנקודות זמן שונות.
    3. חברו את המזרק עם תאים סרטניים על קטטר וריד הזנב.
    4. לאט לאט להזריק את התאים הסרטניים לוריד הזנב.
    5. נתק את המזרק עם תאים סרטניים מן קטטר וריד הזנב.
    6. חבר מחדש את המזרק PBS על קטטר זנב וריד.
      הערה: זהה את המיקומים של כל תאי הגידול לפני הזרקת dextran כפי שהוא הופך להיות קשה להבחין בין התאים הסרטניים מן האות dextran דרך העינית לאחר הזרקה.
  4. אתר תאים סרטניים לתמונה
    1. הדמית תאים סרטניים בודדים, לאתר את כל תאי הגידול ולהקליט במיקום עם הלוח דואר מרובה של התוכנה.
      1. אתר בכל תחומי נוף לתדמית ידי התבוננות התאים הסרטניים ב עינית המיקרוסקופ.
      2. בתוך התוכנה, לעבור ללוח המרובה על ידי לחיצה על כפתור Multi-Point ולאחסן את המיקום של התא על ידי לחיצה על כפתור מצב הוספה.
    2. עבור הדמית פסיפס, לאתר את מקורו של הפסיפס ולהגדיר את קואורדינטות ההדמיה
      1. אתר עמדה בפינה השמאלית העליונה של המבנה כדי ליפול בפח.
      2. אפס את x, קואורדינטות y ו- z של הבמה על ידי לחיצה על הכפתור "אפס" על הבקר הבמה.
      3. לטעון את הרשימה המתאימה של קואורדינטות פסיפס ידי לחיצה על כפתור "טען" ובחירה ברשימה.
        הערה: כרטיס רשימה לדוגמא עבור פסיפס 2 x 2 עם חפיפה של 20% של שדה 500 מיקרומטר מבט תהיה: Pos.1 = (0,0), ממוצע. 2 = (400,0), ממוצע. 3 = (0400), ממוצע. 4 = (400.400).
  5. הסר את המזרק wה- i PBS הקטטר וריד הזנב ולהחליף עם מזרק המכיל את dextran.
  6. לאט לאט להזריק עד 100 μl של 20 מ"ג / מ"ל ​​155 kDa rhodamine-dextran מומס PBS לתוך העכבר באמצעות קטטר זנב וריד ואחריו הזרקת 50 μl של PBS סטרילי כדי לשטוף את הצינורית. אין להכניס כל בועות לתוך הקו. בעת הצורך, להזריק dextran לפחות שעה אחת לאחר ההזרקה תאים סרטניים, כך הנפח הכולל מנוהל על העכבר אינו עולה על 4 מ"ל / ק"ג / שעה.
  7. הגדרת פרמטרי הדמיה.
    1. Switch המיקרוסקופ למצב multiphoton.
    2. הגדר את הזום גורם של 2X על ידי לחיצה על כפתור אותות תזמון ועדכון בתחום פקטור זום.
    3. התאם את כוח הליזר כדי ~ 10% (~ 10-15 mW ב המדגם) על ידי לחיצה על כפתור גלאי ליזר ולאחר מכן התאמת מחוון כוח צונאמי ל -10.
  8. תמונה כל מיקום כדי לאמת את הנוכחות של תאים סרטניים ולדמיין את הזרימה ואת היושרה של vasculature.
    הערה: כלי צריך להיראות במצב perfused מלא עם אריתרוציטים זורמים dextran ניאון צריך להיות בתוך הכלי ללא דליפה אל מרחבי extravascular. כ 10 - 20 תאים סרטניים צפויים להיות בתוך הצמצם הברור של חלון הוואקום.
  9. לכוונן את עומק ההתחלה של כל מיקום להיות צלם.
    1. עבור כל מיקום, להתאים את מיקום z ידי סיבוב ידית התמקדות בקר הבמה לתמונה את החלק העליון של התאים הסרטניים.
    2. מקם את התא במרכז שדה הראייה.
    3. לחץ על כפתור Multipoint, לחץ על המיקום של שדה הראייה כדי לסמן אותו ולאחר מכן לחץ על הוסף ולאחר מכן על הלחצן Delete כדי להחליף את המיקום המאוחסן של התא ברשימה המרובה.
    4. מבחינה ויזואלית לבחון את הבהירות היחסית של התאים הסרטניים בכל עמדה.
  10. שמור את המיקומים החדשים של כל אחד מן התאים על ידי לחיצה על הלחצן 'שמור' פאנל Multipointd ציין שם קובץ.
  11. עבור הדמיה של תאים סרטניים בודדים, לקחת שלושה תאים של בהירות כ מקבילה ולמחוק כל מיקומים אחרים מהרשימה המרובה על ידי לחיצה על מיקומם ברשימה ולאחר מכן לחיצה על הכפתור מחק.
  12. לחץ על כפתור גלאי ליזר ולהתאים את המחוונים על רווח PMT של ערוצים הירוקים ואדום 45 כך האותות הם מתחת רוויה.
  13. הזז את המחוון עבור הערוץ הכחול 45 כך מקרופאגים להופיע ציאן.
    הערה: כל אות הרמונית שנייה תופיע רק בערוץ הכחול ניתן להפריד מקרופאגים ציאן ידי ביצוע הליך חיסור ערוץ שתוארה לעיל 45.
  14. הגדר את עומק התחלה Z- מחסנית ל -0 מיקרומטר ואת עומק קץ 24 מיקרומטר ידי הזזת הבמה z למיקום ולחיצה על התחל וכפתורים סוף בהתאמה.
    הערה: תאים בתוך עומק זה יהיה מדמיינים עם האות הטוב ביותררעש ורזולוציה.
  15. הגדרת גודל z צעד עד 3 מיקרומטר.
  16. הגדר את פרמטרי ההדמיה הבאים פרמטרים שתוארו לעיל 45,49.
    1. עבור הדמיה של תאים סרטניים בודדים, לחץ על לחצן אותות תזמון ולאחר מכן זן 4 V לתחום גורם זום (שווה ערך ל גורם זום של 1.5x), זן 3 לתחום ממוצעי מסגרת ולחץ על כפתור זמן לשגות וזן 10 לתחום זמן לשגות.
      הערה: הגדרות אלו תרכושנה 1 מסגרת כל 3 שניות.
    2. עבור הדמית פסיפס, לחץ על לחצן אותות תזמון וזן גורמים זום של 1.5 וולט (שווה ערך ל גורם זום של 4X), זן 3 במספר ממוצעי מסגרת ולחץ על כפתור הזמן לשגות וזן 10 לתוך הזמן- לפקוע שדה שהייה.
      הערה: הגדרות אלו תרכושנה 1 מסגרת כל 3 שניות.
  17. הפעל את מרובות, Z- מחסנית מצבי הדמיה t לשגות ידי לחיצה על הכפתורים שלהם.
  18. לחץ על כפתור ההקלטה לרכוש תמונות.
    לֹאE: רקמת ריאות היא מאוד עדינה רגישה צילום ניזק. אם לאחר זרימת דם הדמית הזמן לשגות מפסיקה בתחום ההדמיה, הליזר הוא הסיכוי טוב ביותר מדי גבוהת הדמיה ומאוחרת יותר של שדות אחרים חייב להיעשות בהספק נמוך.
  19. כל 30-45 דקות, להזריק לאט 50 μl של PBS או תמיסת מלח כדי לשמור על לחות של החיה.

6. המתת חסד

  1. הגדל את isoflurane עד 5%.
  2. שמור את החיה תחת isoflurane 5% עד 30 שניות לאחר שתפסיק לנשום ולהסיר את החיה מן הבמה.
  3. בצע נקע בצוואר הרחם כדי להבטיח המתת חסד מוחלט.

ניתוח תמונה 7.

  1. בניסויים הדמיה תא בודד:
    1. טען תמונות לתוך פיג'י ועיצובם בתור hyperstack.
    2. עבור כל z-פרוסת hyperstack, להפעיל את סרט הזמן לשגות ולחפש תנועת XY שיורית. אם תנועת XY שיורית נמצאה, להחיל את התוסף בשם StackReg 36 אל הערימהלחסל את התנועה.
  2. בניסויים הדמיה פסיפס:
  3. טען תמונות לתוך פיג'י ותופר אותם על ידי פתיחת מאקרו תפירת הפסיפס (קובץ קוד משלימת תפירת פסיפס) ומידע הזנה על התמונות כגון הספרייה, שם בסיס הקובץ, מספר שדות x ו- y בפסיפס והמספר של פרוסות ונקודות זמן.
    הערה: בשל כיצד Java מפרש ספריות, שמות תיקיות חייבות להיות שני לוכסנים כמפרידי תיקיית משנה. בשל מגבלות של תפירת Pairwise תוסף המובנהית, שמות קבצי בסיס לא יכילו כל מקפים.
  4. כדי לקבל תצוגה ברורה של הגבולות של כלי הדם, ממוצע יחד את כל נקודות הזמן עבור ערוץ הדם לתוך תמונה אחת ולאחר מכן לשכפל את התמונה כרקע עבור כל מסגרת של הסרט של הערוצים האחרים.
    הערה: זה נעשה פשוט על ידי הפעלת ממוצעים דם בצע מאקרו (קובץ קוד משלימה בצע מיצוע דם).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להדגים את סוג התוצאות שניתן להשיג בשיטה זו, אנו מזריקים תאים סרטניים E0771-LG שכותרתו עם תלתן חלבון פלואורסצנטי לווריד הזנב של עכברים MacBlue 44 בשעה משתנים נקודות זמן לפני הניתוח. לאחר ניתוח, 155 dextran שכותרתו rhodamine KD הוזרק IV לציון ההדמיה בכלי הדם ואת הזמן לשגות בוצעה.

כאשר הדמיה עכברים 24 שעות לאחר ההזרקה, תאים בודדים גלויי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

רזולוציה גבוהה הדמיה אופטית vivo בשילוב עם תגים תפקודיים שכותרתו fluorescently כגון חלבונים ונוגדנים יש עלה באופן משמעותי את הבנתנו של המפל גרורתי. זה איפשר להדמיה ישירה וכימות של תא בודד ופרמטרים המשנה הסלולר בתאי גידול, תאי המארח microenvironment שלהם. הדמיה זו בתוך הגידול הראשוני הובילה, למשל, כדי גילוי microenvironments הדיסקרטית, כי הם תומכים או של פלישת צמיחה או 6,7 הפצה. במקרה של פלישה, in vivo הדמיה חשפה את התפקיד המועדף של הזרמת שיתוף...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי NIH-CA100324, מענק התמיכה במרכז הסרטן של המכון הלאומי לסרטן איינשטיין P30CA013330, R01CA172451 ל-JWP ולתוכנית ההדמיה המשולבת. טכנולוגיה זו פותחה במרכז הביופוטוניקה ע"ש גרוס-ליפר ובתוכנית ההדמיה המשולבת במכללה לרפואה ע"ש אלברט איינשטיין. אנו מכירים בתמיכתם של מרכזים אלה בעבודה זו. המחברים מודים למייק רוטנקולבר, ריקרדו איבגון ואנתוני לג'יאדרו מחנות המכונות של איינשטיין על אומנותם המיומנת והמתוזמנת, למעבדה של מתיו קרומל על שיתוף נדיב של שרטוטי עיצוב החלונות שלהם, לקווין אליסיירי וג'רמי ברדפלדט על מומחיותם במיקרוסקופיה והמלצות המגבר שלהם ולאליסון הארני ובויאנה גליגורייביץ' על דיונים אינפורמטיביים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ווסת ואקום פליז מצופה ניקל 1/8 NPT נקבה, עם מד, 0 - 20 אינץ' כספיתואקום מקמאסטר קאר4172K12 ווסת ואקום
מתאם התאמת צינור פליז דוקרני עבור 1/4 אינץ' מזהה צינור X 1/8 אינץ' NPTF צינור זכרMcMaster Carr5346K13מתאם צינור ווסת ואקום
צלוחיות סינון מותג פיירקס עם צינורות; צוואר מעוצב לפקק גומי מס' 4; קיבולת: 50 מ"לCorning Life Sciences Glass5360-50בקבוק ואקום
כיסויי זכוכית עגולים עובי #1.5, 0.16 - 0.19 מ"מ קוטר 10 מ"מ טד פלה, בע"מ260368 תלושי כיסוי
צנתרים חד פעמיים של Exel International Safelet IV; 22 גרם x 1 אינץ' Exel International26746קטטר קנה הנשימה
PERMA-HAND תפרי משי קלועים שחורים, ETHICON LIGAPAK סליל חלוקה גודל 2-0VWR95056-992מחרוזת
, שקוף, 0.14 אונקיותHendel Corp.LOC1647358דבק ציאנו-אקרילט
טטרמתילרודמין איזותיוציאנט&ndash– DextranSigma-AldrichT1287-500MG155 kD
צינורות PVC שקופים של מעבדת Dextran, 1/16 אינץ' ID, 1/8 אינץ' OD, 1/32 אינץ' עובי קיר, 25 רגל אורךMcMaster Carr5155T12צינורות דקים & צינורות לצינורות
פוליאתילן עמידים בפני סדקים, 1/8 אינץ' ID, 1/4 אינץ' OD, 1/16 אינץ' עובי דופן, לבן, 50 רגל.מקמאסטר קאר5181K24 צינורות עבים
קרם השפלהNair-Micro
צינורות רפואיים 95 דורומטר LDPEScientific Commodities Inc.BB31695-PE/1צינורות לצנתר וריד הזנב
30 גרם x 1 אינץ'. BD PrecisionGlide NeedleBD305128 מחטים לצנתר וריד הזנב
Puritan Nonsterile Cotton-tippped Swabs פישר סיינטיפיק867WCNOGLUE
התאמת צינור דוקרבונט שקוף, צמצום ישר עבור 3/32 אינץ' x 1/16 אינץ' מזהה צינורMcMaster Carr5117k51מחברים בין צינורות
פקקי גומי עם חור אחדפישר סיינטיפיק14-135Fפקק לבקבוק ואקום
SHARP טיפים למחסום דיוק, עבור P-100, 100 ומיקרו; lדנוויל סיינטיפיק בע"מP1125קצה פיפטה
פישר סיינטיפיק159015R
Puralubeהנרי שיין בריאות בעלי חיים008897משחה אופטלמית
ערכת קוטרה תאומים מכשירהרווארד726067עט
גראף מיקרו מלקחיים; משונן; עקומה קלה; רוחב קצה 0.8 מ"מ; אורך 4 אינץ'Roboz כירורגיRS-5135 מלקחיים
מספריים מיקרו חיתוך עדינים במיוחד 4 "ישר חד / חד 24 מ"מRoboz כירורגיRS-5912מספריים חדים
מספריים מיקרו חיתוך 4 "ישר קהה /קהה Roboz כירורגיRS-5980מגבוני מספריים קהים
פישר סיינטיפיק06-666-A לרתום
מערכת PhysioSuite קנטסיינטיפיקPhysioSuiteVitals מוניטור
1 מ"ל מזרק, טוברקולין קצה החלקהBD309659מזרק
ציאנו אקרילטסיכותLOC1647358כיסוי דבק להחליק
ג'לי נפטפישר סיינטיפיק19-086291מחסום מים
Luer Cannulla 1.5 - 2.2 מ"ממכשירהרווארד734118מחבר קטטר
PhysioSuite עכבר אוקסימטר דופק STATקנט סיינטיפיקדופק אוקסימטר
איזואתזיה (איזופלורן)הנרי שיין בריאות בעלי חיים50033250 מ"ל
חמצןTechAirOX TM
1x PBSLife Technologies10010-023
שסתום כדור PVC, דחף לחיבור, 1/4בגריינג'ר3CGJ7שסתום ואקום
מאוורר בעלי חיים קטניםמכשיר הרווארד683חלופה זמינה מקנט סיינטיפיק: MouseVent
OptiMEM סרום מופחת בינוניThermoFisher Scientific31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermoFisher Scientific11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/Jעכברי מעבדת ג'קסון026051 
מיקרוסקופ מולטיפוטוןOlympusFluoview FV1000חלופה להיקף בנוי בהתאמה אישית
מארז סביבתיפלסטיק מדויקעבור FV1000חלופה למארז בנוי בהתאמה אישית
פוספט חוצץ מלחThermoFisher Scientific14190136
מד כוח לייזרקוהרנטיMaxIITOP
ראש מד כוח לייזרקוהרנטיPM10
pcDNA3-Clover וקטור חלבון פלואורסצנטיAddgene40259
G418 סולפט אנטיביוטיקה סלקטיביתThermoFisher Scientific10131027
MoFlo ממיין תאים פלואורסצנטיים בקמן קולטרXDP
טריפסין EDTA 1xקורנינג25-052-Cl
40 ומיקרו; m רשתפלקון352235
96 באר צלחתCostar3599
60 מ"מ צלחת תרבותקורנינג430196
10 ס"מ צלחת תרבותקורנינג353003
סרום בקר אלבומיןסיגמא-אולדריץ'A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered מלח 1xקורנינג21-031-CV
מעבדת ג'קסוןלעכבר C57BL/6J000664 
קים מגבוניםפישר סיינטיפיק06-666-A 
דבק סופר נוזלי סרט מעבדה מתאם תא שדה

מקורות

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124(2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483(2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112(2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562(2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. , Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042(2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318(2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7(2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294(2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Time LapseZ Stack

מאמרים קשורים