מאמר שיטה

ראפיד רכישת תמונות 3D באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית episcopic

DOI:

10.3791/54625

⸱

21 בנובמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, The Second Affiliated Hospital & Yuying Children's Hospital, Wenzhou Medical University, 2Departments of Urology, Boston Children's Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול מפורט המשתמש במיקרוסקופיה אפיסקופית ברזולוציה גבוהה כדי לרכוש תמונות תלת מימדיות (תלת מימד) של עוברי עכברים. פרוטוקול משופר זה משתמש בשיטת הכנת רקמות שונה כדי לשפר את חדירת הצבע הפלואורסצנטי, ובכך מאפשר ניתוח מורפומטרי של דגימות קטנות וגדולות כאחד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיה מיקרוסקופית אפיסקופית ברזולוציה גבוהה (HREM) מאפשרת רכישה מהירה של נתונים מורפומטריים דיגיטליים נפחיים ותלת מימדיים (3D) ברזולוציה גבוהה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט להדמיית עובר העכבר כולו. הפרוטוקול מורכב מארבעה חלקים עיקריים: הכנת דגימה, הטמעה, רכישת תמונה ולבסוף, הדמיה תלת מימדית. הטכנולוגיה מחייבת להכתים דגימות בצבע פלורסנט, מה שעלול להיות בעייתי עבור דגימות גדולות או צפופות. כדי להתגבר על מגבלה זו, שיפרנו את הפרוטוקול הקיים כדי לשפר את חדירת הרקמה של הצבע על ידי טיפול מקדים בדגימה בתמיסה המכילה אוריאה ונתרן דודציל סולפט. הפרוטוקול משתמש רק בציוד מעבדה שגרתי וריאגנטים להתאמה קלה בתנאי מעבדה סטנדרטיים. אנו מראים כי תמונות התלת מימד ברזולוציה גבוהה המתקבלות מסכמות נאמנה את המאפיינים המורפולוגיים המפורטים של האיברים הפנימיים של עוברי עכברים, ובכך מאפשרות ניתוחים מורפומטריים. יחד, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ומשופר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי לרכישת תמונות תלת מימד ברזולוציה גבוהה של דגימות קטנות וגדולות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הופעתן של טכנולוגיות הדמיה תלת מימדיות פתחה את האפשרות לניתוח מערכתי של מאפיינים מורפולוגיים מפורטים במהלך התפתחות העובר. מגוון שיטות הדמיה תלת מימדיות זמינות כעת כוללות הדמיית תהודה מיקרו-מגנטית (מיקרו-MRI), מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת, אולטרסאונד בתדר גבוה, טומוגרפיה קוהרנטית אופטית, טומוגרפיה של פרויקט אופטי ומיקרוסקופיה אפיסקופית1-4. לכל שיטה יש תכונות ייחודיות משלה ברזולוציה, ניגודיות, מהירות, עלות, ביכולת הרחם ובזמינות.

לכידת תמונה פלואורסצנטית אפיסקופית (EFIC) ומיקרוסקופיה אפיסקופית ברזולוציה גבוהה (HREM) הן שיטות הדמיה של מיקרוסקופיה אפיסקופית4. כאן, תמונות סדרתיות ברזולוציה גבוהה נלכדות ברציפות מפנים הבלוק במקום מקטעי רקמות. התמונות המתקבלות משקפות נאמנה מאפיינים מורפולוגיים מפורטים עם עיוות רקמות מינימלי או ללא עיוות. הנתונים הנפחיים הנרכשים מומרים בקלות לתמונות תלת מימד ברזולוציה גבוהה המתאימות לניתוח מורפומטרי מדויק. בגלל העלות הנמוכה יחסית והרזולוציה הגבוהה, HREM ו-EPIC הפכו לחלופות המעולות להערכה מערכתית של מודלים עכבריים של מומים מולדים אנושיים2,4-8.

שתי שיטות EFIC ו-HREM דורשות הטמעה של דגימות במדיום המתאים. EFIC מזהה אוטופלואורסצנטיות הנפלטת מהרקמה המוטמעת. בשל כך, הוא מוגבל לדגימות הפולטות רמות גבוהות של אוטופלואורסצנציה אך לא לאלה עם אוטופלואורסצנציה חלשה יחסית כמו עוברים בשלב מוקדם9. כדי להתגבר על התלות של אוטו-פלואורסצנטיות, הדגימות מוכתמות בצבע פלואורסצנטי כגון אאוזין להדמיית HREM. הבחירות של צבעים ושיטות צביעה גם הופכות את HREM לתואם יותר לזיהוי אותות מולקולריים בהקשר של ארכיטקטורת רקמות ומורפולוגיה4,10.

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול HREM משופר המתאים להערכת כל הגוף של עוברי עכברים בשלב מאוחר. כדי להקל על הצביעה, אנו כוללים שלב טיפול מקדים להגברת חדירת הרקמות, ובכך מאפשרים הדמיית HREM של עוברי עכברים מבוגרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השימושים חיים מאושרים על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש בבית החולים לילדים בבוסטון.

לדוגמא הכנה 1.

  1. הזדווגות מתוזמן
    1. מניחים זכר סוג בר C57BL6 ונקבה יחד באותו כלוב.
    2. בדוק להיווצרות פקק הזדווגות מוקדם למחרת בבוקר. תוספת ההזדווגות (aka, נרתיק או תקע הזדווגות) היא בתצהיר דביקות מוקשה שחוסם את הנרתיק.
    3. הגדר את התאריך תקע 0.5 היום העוברי (E0.5).
  2. בידוד של עוברי עכברים
    1. להרדים נשים בהריון בחנק CO 2.
    2. שים עכברים פרקדן על כרית ספיגה ולרסס באזור הבטן עם אתנול 70%.
    3. הרם את העור ולעשות חתך 5 מ"מ ראשוני באזור בטן הזנב באמצעות מספרי כירורגיות. גזור להסיר עור הבטן כדי לחשוף את האיברים הפנימיים מלא
    4. חותכים ליד vaג'ינה להסיר את הרחם כולו.
    5. חותך בין אתרי השתלה לאורך קרן הרחם. מגזר או conceptus כל צריך רק עובר אחד בפנים.
    6. שמור מגזרי הרחם בופר פוספט קר כקרח 1x (PBS).
  3. לנתיחה העובר
    1. מניחים כל conceptus בצלחת נפרדת עם קרים כקרח PBS תחת stereoscope.
    2. הסר רקמות רחם, שליה ואז ממברנות העובר ברצף באמצעות מלקחיים לנתח בסדר.
    3. מעביר את העובר גזור לצינור 50 מיליליטר עם קרח 1x PBS הקר בעזרת פיפטה העברה גדולה. הימנע להרים העובר ישירות עם מלקחיים כדי למזער את הנזק לרקמות.
  4. קיבוע
    1. תקן את העוברים הגזורים ב 10% פתרון פורמלין שנאגר ניטראלי ב 4 מעלות צלזיוס במשך יותר מ -24 שעות עם כרכים מדגמים 10 לפחות של מקבע.
  5. טיפול מקדים
    1. הכן את פתרון הסליקה: 4אוריאה M, 10% גליצרול, 4% נתרן Dodecyl סולפט (SDS) במים מזוקקים פעמיים.
    2. החלף את מקבע עם פתרון הסליקה.
    3. בעדינות לסובב את הדגימה על כיסא נדנדה בטמפרטורת החדר למשך 1 - 2 שבועות. להחליף את פתרון הסליקה פעם על השני וביום השלישי. הדגימה לאט מתבהרת שקופה.
    4. החזר את פתרון סליקה עם 10% פורמלין ולהשאיר על כיסא נדנדה עבור 2 ימים.
  6. התייבשות
    1. שטפו את דגימות pretreated עם 1x PBS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    2. מייבשים דגימות בסדרה אתנול עולה בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה עדין. עבור עוברי E15.5, השתמש סדרת אתנול עולה כולל 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ו -100% אתנול, 2 שעות כל צעד. עבור עוברים מבוגרים, זמן הדגירה צריך להיות מוגבר.
  7. הַכתָמָה
    1. כן הפתרון מכתים: להוסיף 0.1375 גרם Eosin Y Disodium מלח 0.0275 גרם של חמי acridine כתום (כלוריד אבץ) מלח 50 מ"ל של אתנול 100%. מערבבים עבור שעה 2. מסנן עם נייר סינון. אחסן בטמפרטורת החדר ולהימנע האור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום.
    2. עבר דגימת הפתרון המכתים במשך שעה 1.
    3. חלף עם פתרון מכתים טרי לילה כתם.
  8. הִסתַנְנוּת
    1. הכן פתרון הסתננות: לשלב 100 מ"ל של פתרון א 'ערכת הטבעה JB-4, 1.25 גרם של Catalyst C, 0.275 גרם של מלח Eosin Y Disodium ו 0.055 גרם של חמי acridine כתום מלח (כלוריד אבץ). מערבבים לערבב (200 סל"ד) בתוך דלי קרח במשך 2 שעות, ולאחר מכן לסנן עם נייר סינון.
    2. אחסן את פתרון ההסתננות ב 4 ° C ולהימנע אור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום.
    3. מעבירים את העוברים על הסתננות פתרון: פתרון מכתים (1: 1), ו דגירה במשך שעה לפחות 3 על כיסא נדנדה ב 4 ° C.
    4. מעבירים את העוברים על הסתננות פתרון דגירה במשך 3 שעותr על כיסא נדנדה בחדר קר.
    5. חלף פתרון הסתננות פעם אחת בכל יום, ולהשאיר בחדר קר על כיסא נדנדה עדינה במשך שלושה ימים נוספים.

Embedding 2.

  1. שמור פתרון B ו- הסתננות פתרון על הקרח.
  2. הפוך פתרון והטבעה (01:25 של פתרון B ו- פתרון הסתננות) מיד לפני ההטבעה.
  3. אוריינט הדגימה בתוך תבנית הטבעה, ואז לשפוך פתרון והטבעה קר לתוך תבנית ההטבעה בעדינות. Re-אוריינט בסיכה במידת הצורך.
  4. בעזרת מערוך כדי לבדוק אם פתרון והטבעה הוא התגבש. לדחוף את גוש הדגימה, וקוצצים אותו במידת הצורך.
  5. כיוון מחדש של גוש הדגימה באמצעות עובש נפרד להשיג אוריינטציה צלב.
  6. שים בעל בלוק על גבי עובש הטבעה. בעדינות יוצקי פתרון והטבעה לתוך התבנית עד העובש בעל לחסום שקוע ידי הטמעת פתרון.
  7. שמור את הדגימה במיכל משני ולהשאיר אותהעל קרח למשך 3 - 4 שעות במנדף.
  8. אחסן את הדגימות הקרושה בתוך 4 ° C..
  9. לקלף את עובש הטבעה. מכניס את הגוש תחת סטראו עם תאורה עקיפה לבדוק עמדה של הדגימה בבלוק. על פניו בלוק, קווי רשת סימן סביב הדגימה.
  10. חתוך את הבלוק כדי להסיר גישת כמות הטבעת חומר באמצעות קווי רשת המסומנים אזכור.

3. Image Acquisition

  1. הצמד את בלוק דגימת microtome ולקבל משטח טרי. סעיף עובי הגדר (למשל, e9.5-10.5, 1.5 מיקרומטר; e11.5-12.5, 2.0 מיקרומטר; e13.5-15.5, 2.5 מיקרומטר; E16.5-מבוגרים, 3 מיקרומטר). שמור את הדגימה / לחסום במיקום הבית של microtome.
  2. הר מיקרוסקופ זום סטריאו אופקי מול פני הבלוק של דגימה.
  3. הפעל את המחשב ואת מיקרוסקופ, ולהתחיל את תוכנת רכישת התמונה.
  4. דמיינו ולמקד את אופטיקה לבלוק הפניםתחת מצב "תצוגה חיה" של תוכנת הדמיה.
  5. יישר מיקרוסקופ microtome במידת הצורך כך פנים בלוק הוא במרכז הכוונת.
  6. התאם זום כך לחסום הפנים כולו בתוך העינית.
  7. בחר חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מסנן (עירור 470 ± 20 ננומטר, dichroic 495 ננומטר, פליטת 525 ± 25 ננומטר) ולמקד במידת הצורך.
  8. מדוד ולהגדיר את זמן החשיפה באופן ידני (למשל, 80 - 400 מינים שניות).
  9. לרכוש תמונות של פנים בלוק אחרי כל טריים ולשמור תמונות באופן אוטומטי במידת האפשר.
  10. שיא פרמטרים חשובים כוללים רזולוציה, עובי הסעיף וזום.
  11. לאחר שסיים את הדגימה כולה, ייצוא להמיר את כל קבצי תמונה בפורמט JPEG במידת הצורך.
  12. הפוך את כל התמונות המקוריות באמצעות תוכנת עיבוד הדמיה, ולהתאים את הבהירות והניגודיות.
  13. שמור את כל התמונות מעובדות בתיקייה נפרדת.

3D 4.רְאִיָה

  1. העלה את כל התמונות מעובדות תוכנה להדמית 3D ביצוע ההוראות.
  2. רזולוציית הקלט ועובי סעיף להמיר את כל התמונות כדי נתוני נפח (כלומר, voxel גודל) ולשמור את הקובץ 3D.
  3. יישר את כל התמונות באמצעות במצב האוטומטי. התאם תמונות בודדות באופן ידני במידת הצורך.
  4. שמור את התמונה מיושרת שם קובץ חדש.
  5. לנתח תכונות morphometric של הדגימה באמצעות תוכנת הדמיית 3D.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיווחנו תמונות HREM באיכות גבוהה של עוברי עכברים בין E9.5 ואת E13.5 8. איכות תמונה של העוברי מאוחר מבוים, לעומת זאת, נפגעת משמעותית בשל החדירה לרקמות המוגבלת של eosin צבע פלואורסצנטי. כדי להגביר את היעילות המכתימה, בדקנו מספר שיטות טיפול מקדימות תואמות הדמית ניאון 11. באופן ספציפי, עוברי עכברים E15.5 טופלו או Sca / e A2 12 או כל הגוף מעוקב 13. גם בדקנו את הנוסחה פשוטה, פתרון סליקה (4 אוריאה M, 10% גליצרול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שונה באמצעות ציוד מעבדה שיגרתי לרכוש תמונות HREM סדרתי תואמות להדמית 3D מהירה וניתוח morphometric של מבנים מורכבים. מכיוון התמונות ברזולוציה הגבוהה נלקחות ישירות מעל פני הבלוק במקום חלקים בודדים, תכונות מורפולוגיות בסדר נשמרות ושחזרו במהירות דיגיטלית בתכנית הדמיית 3D.

3D הדמיה מציעה יתרונות משמעותיים ביטוי חזותי והבנה תכונות מורפולוגיות מורכבות. רוב טכנולוגיות הדמיה 3D תלויים ציוד מיוחד <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר ייצ'ן הואנג, צ'ונמינג גואו וג'נפאנג ג'ואו על תמיכתם הטכנית. מחקר זה מומן על ידי NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) ואיגוד הלב האמריקאי (AHA, 13GRNT16950006, XL).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכבריםמעבדת ג'קסוןC57BL6
אתיל אלכוהולPharmco-Aaper111000200200 הוכחה, אבסולוטית, ACS/USP/כשר
כיתה פורמליןסיגמאHT501128-4L
אוריאהסיגמאU5128תמיסת ניקוי
גליצרולפישר מדעיG33-4תמיסת ניקוי
נתרן דודציל סולפטInvitrogen15525-017תמיסת ניקוי
Eosin Y דיסודיום מלחפישר BP241925 מדעיתמיסת הסתננות
אקרידין מלח המי כתום (אבץ כלוריד)SigmaA6014תמיסת הסתננות
ניירWhatman GE3030-153
JB-4 ערכת הטבעה - פתרון APolysciences, Inc.0226A-800של פתרון הסתננות
JB-4 - פתרון BPolysciences, Inc.0226B-30פתרון הטמעה
JB-4  ערכת הטבעה - CatalystPolysciences, Inc.02618-12תבניות הטמעת פתרון הסתננות
Polysciences, Inc.23185-116 x 8 מ"מ
תבניות הטבעה חדות של Peel-A-WayPolysciences, Inc.18986-122 מ"מ x 22 מ"מ מרובע, חתוך ל-12 מ"מ x 12 מ"מ
JB-4  מחזיקי בלוקים מפלסטיקPolysciences, Inc.15899
צינורות העברה חד פעמיים מדורגיםVWR414004-014
צלחת בנזיןVWR25384-088מלקחיים לדיסקציה של עוברים
קצה אינוקס  ROBOZRS-5015מלקחיים לרקמת Graefe לדיסקציה של עוברים
  ROBOZRS-5153דיסקציה של עובר
מספריים הפעלה עדין  ROBOZRS-6700דיסקציה לעובר
14 מ"ל פוליפרופילן צינורות תחתונים עגוליםפלקון352059
50 מ"ל צינורות חרוטיים מפוליפרופילןפלקון352098
מגע קרח Magic Touch Iceware International Corp.R19-343
100 מ"ל (3.4 אונקיות) סירות שקילה פוליסטירן אנטי סטטיותVWR89106-766
330 מ"ל (11.2 אונקיות) סירות שקילה פוליסטירן אנטי סטטיותVWR89106-770
נתרן כלוריMP ביו-רפואי102892תמיסת PBS
אשלגן כלוריסיגמאP0662PBS תמיסת
אשלגן פוספט מונו-בסיסיסיגמאP5405PBS תמיסת
נתרן פוספט דו-בסיסי הפטהידראטסיגמא-אולדריץ'S9390PBS תמיסת
מצלמה דיגיטליתHamamatsu PhotonicsC11440-10C
מיקרוטוםLeicaRM2265
תאורהCarl ZeissHXP 200C
מיקרוסקופ זום סטריאו פלואורסצנטיקארל זייסAxio Zoom.V16
מיקרוסקופ סטריאואולימפוסSZX16
מקור אור סיבים אופטייםLeicaKL 1500 LCD
חד פעמי Microtome להבVWR95057-832
מתקן קצה יחידPersonna62-0330-0000
ZENCarl Zeisspro 2012
PhotoshopAdobeCS6 v13.0
Amira 3D SoftwareVisage Imaging5.4
מחשבDell T7600, כונן קשיח SAS בנפח 2x900 ג'יגה-בתים וזיכרון DDR3 RDIMM בנפח 64 ג'יגהבייט
ערכת הטמעה דלי קרח שייקרים פלטפורמת נדנדה VWR 40000-304 בוחש פלטה חמה סטנדרטית VWR 12365-382 איזון אנליטי מטלר טולדו AB54-S

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
  2. Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
  3. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
  4. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
  5. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
  6. Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
  7. Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
  8. Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
  9. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
  10. Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
  11. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  12. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים