הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנה

9.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54652

⸱

23 בנובמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים את ההכנה והשימוש תחקיר מבוססי פעילות (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] carbamate) המאפשר איתור וכימות של צורה פעילה של amidase החומצה המעודד דלקת אנזים N -acylethanolamine (NAAA), הוא במבחנת vivo לשעבר.

תקציר

פרופיל חלבון מבוסס פעילות (ABPP) הוא שיטה לזיהוי של אנזים של עניין proteome מורכב באמצעות בדיקה כימית שמכוונת את האתר הפעיל של האנזים. תג כתב הציג לתוך החללית מאפשר זיהוי של האנזים שכותרתו ידי סריקת קרינה-ג'ל, כתם חלבון, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, או ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית. כאן, אנו מתארים את ההכנה ושימוש של ARN14686 המתחם, כימיה לחץ פעילות מבוססת בדיקה (CC-ABP) באופן סלקטיבי מזהה אנזים N -acylethanolamine חומצת amidase (NAAA). NAAA הוא hydrolase ציסטאין שמקדם דלקת ידי השבתת peroxisome אנדוגני קולטן proliferator המופעל (PPAR) אגוניסטים -alpha כגון palmitoylethanolamide (PEA) ו oleoylethanolamide (OEA). NAAA הוא מסונתז כקובץ proenzyme באורך מלא פעיל, אשר מופעל על ידי autoproteolysis ב- pH חומצי של ליזוזום. מחקרי לוקליזציה hותעיף הראה כי NAAA מתבטא בעיקר מקרופאגים ותאי מונוציטים נגזרות אחרים, וכן לימפוציטים מסוג B. אנו מספקים דוגמאות כיצד ניתן להשתמש ARN14686 כדי לזהות ולכמת פעיל NAAA vivo לשעבר ברקמות מכרסמים על ידי כתם חלבון מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

מבוא

בשימוש נפוץ שיטות לחקור את דפוסי הביטוי, אינטראקציות, ופונקציות של חלבונים, כולל פלטפורמות ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזליות לניתוח רובה 1,2, שמרים שיטות שני היברידיות 3,4, ו ב מבחני חוץ גופייה, מוגבלות שהם לא ניתן להעריך את הפעילות של חלבונים במצב הטבעי שלהם. פרופיל חלבון מבוססי פעילות (ABPP) שניתן להשתמש בהם כדי למלא את הפער. לפי גישה זו, מולקולות קטנות בוחנות מסוגלות מחייב קוולנטית אל האתר הפעיל של אנזים אינטרסים מצומדות לקבוצת כתב המאפשרת איתור היעד. באמצעות כימיה לחץ (CC), הכתב ניתן לשלב את החללית או יכול להיות מוצג לאחר אירוסי היעד התרחשו 5,6. ההליך האחרון מחייב שימוש בדיקות המכילות קבוצות כימיות מתאימות, כגון אלקין או תזיד מסוף, אשר יכול להיות שונה עם מספר ריאגנטים כתב דרך תגובות ביו-מאונך such כמו Cu (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cycloaddition 7-9 או Staudinger קשירת 10,11.

לאחרונה, אנו חשפנו את ARN14686 המתחם כמו ABP הראשון עבור במבחנת איתור vivo של hydrolase ציסטאין, 12 NAAA. NAAA מזרז את שחרור משרות והידרוליזה של FAES רווי בלתי רווי, כולל oleoylethanolamide (OEA) ו palmitoylethanolamide (PEA), שהן אגוניסטים אנדוגני של רצפטור גרעיני אנטי דלקתיות PPAR-alpha 13-15. NAAA מתבטא בעיקר מקרופאגים ותאי מונוציטים הנגזרות אחרים, כמו גם ב-לימפוציטים 14,16, דבר המצביע על תפקיד בוויסות התגובה החיסונית המולדת. האנזים הוא מסונתז reticulum endoplasmic המחוספס בצורה פעילה מופעל בתאים החומצית של התא על ידי מנגנון autoproteolytic 17. מחשוף autoproteolytic יוצר ציסטאין חדש N -terminal (C131 בעכברים וחולדות, C126 בבני אדם), כי הוא אחראי נוקלאופיל עבור FAE הידרוליזה 18,19. עיכוב תרופתי פעילות NAAA משנה את איזון FAE סינתזה / שפלה לטובת רמות תאיים מרובות יותר של 16,20,21 FAES. כמה נגזרים β-lactone ו β-לקטם הוכחו לעכב פעילות NAAA עם עוצמה גבוהה סלקטיביות 16,22-26. מעכבים אלה פועלים באמצעות S -acylation של ציסטאין קטליטי 16,27,28.

ARN14686 המתחם תוכנן בהתבסס על המבנה הכימי של פעיל מערכתית, נגזר-סרין β-לקטם NAAA מעכב, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] carbamate) 16. קבוצת 4-בוטיל-cyclohexyl של ARN726 הוחלפה שרשרת אליפטיות רווי C9 נושאות תג אלקין מסוף נטיית CC הבאה עם תג עיתונאי יזיד נושאות. בחרנו לעצב ABP שני שלבים כדי minimally לשנות את מבנה הפיגום המקורי, ובכך שמירה על הזיקה של החללית עבור NAAA. יתר על כן, הימנעות כניסתה של תגים מגושמים, בדיקה כזו יכולה להיות מתאימה יותר לטיפול in vivo מאשר ABP ישיר. ARN14686 מעכב NAAA עם עוצמה גבוהה (hNAAA IC 50 = ננומטר 6, rNAAA IC 50 = 13 ננומטר) על ידי יצירת adduct קוולנטיים עם ציסטאין הקטליטית של האנזים 12. ניסויים בחולדות חיים הראו כי החללית היא סלקטיבית לכידה NAAA לידי ביטוי ריאות. חומצה ceramidase, אחר ציסטאין amidase שחולקת זהות 33-34% עם NAAA, זוהה גם כמטרה בעלת זיקה נמוכה בעת שימוש בריכוזים גבוהים בדיקה (10 מיקרומטר במבחנה, 10 מ"ג / מ"ל תוך ורידי, iv) 12. יש לנו גם השתמשתי ARN14686 ללמוד בנוכחות NAAA הפעיל ברקמות עכברוש מודלקות לאחר נטילה של אדג'ובנט של שלמה פרוינד (CFA) 29.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור preparatiעל של ARN14686 (איור 1) ויישומה לחקירת ההפעלה NAAA vivo לשעבר. כדוגמה, אנו מתארים הליך הניסוי לדמיין NAAA בכפות עכברוש לאחר מתן CFA. בניסוי זה, חלבונים המחולצים רקמות כפה לאחר ההזרקה iv של החללית, ואת proteome שכותרתו ABP הוא נתון סמ"ק עם-אזיד ביוטין. דגימות Biotinylated מועשרות באמצעות חרוזי streptavidin, וכתמי חלבון מבוצעים. ביישום אחר, אנו מתארים את הלוקליזציה של NAAA הפעיל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתוך ריאות עכבר מעכברים שטופל חללית. במקרה זה, הרקמה מחולקת וחתכים חשופים CC עבור בנוסף rhodamine. ערכת עבודה מתוארת באיור 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

זהירות: כל תגובות הכימיה צריכות להתבצע במנדף מאוורר ועם השימוש חלוק מעבדה, כפפות, משקפי מגן. התגובות צריכות גם להתבצע בסביבת חנקן.

הצהרה אתית: הנהלים שלנו מעורבים בעלי חיים מבוצעות בהתאם לתקנות האיטלקית להגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות ניסיוניים אחרים (DM 116,192), ותקנות הקהילה האירופית הכלכלית (OJ של EC L 358/1 1986/12/18 ).

הערה: סינתזה של [(3 S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] אמוניום אצטט מתואר על תשואות בקנה מידה גדול (50 גרם של N -Cbz-L-סרין), אבל זה יכול להיות scaled למטה בקלות.

סינתזה 1.

הערה: ראה איור 1 עבור ערכת סינתזת התגובה.

  1. הכנת קרבונט 2-pyridyl Undec-10-ynyl ו Undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-carboxylate
    1. בבקבוק מסביב לתחתית 50 מ"ל, לפזר 350 מ"ג של undec-10-yn-1-ol ב 3.5 מ"ל של dichloromethane יבש.
    2. כדי הפתרון ב 1.1.1, להוסיף 25 מ"ג של 4-dimethylaminopyridine (DMAP) ו- 530 מ"ג של 2-dipyridylcarbonate (DPC). מערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 16 שעות.
    3. הוסף 20 מ"ל של dichloromethane.
    4. מעבירים את התערובת לתוך משפך מפריד. הוסף 15 מ"ל מים, לנער אותו, ולאפשר לשני שלבים להפריד.
    5. פתח את השסתום, לאסוף את השלב האורגני (למטה), ולאחר מכן לסגור את הברז. הוסף 15 מ"ל של פתרון NaHCO 3 רווי. לנער את המשפך המפריד ולתת שני שלבים נפרדים. חזור על פעולה זו עוד פעמיים.
    6. ייבש את השכבה האורגנית עם Na 2 SO 4, לסנן דרך כותנה לתוך בקבוק מסביב לתחתית (ראשון הטרה), להתאדות עד יובש תחת לחץ מופחת (מאייד סיבובי).
    7. לשקול את הבקבוק ולקבל 600 מ"ג של שמן כי הוא תערובת של קרבונט 2-pyridyl undec-10-ynyl ו undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-carboxylate על יחס של 1.7: 1.
      1 H NMR (400 מגה-הרץ, DMSO- ד 6) מרכיב מרכזי δ = 8.39 (dd, J = 5.0, 2.0, 1H), 7.98 (TD, J = 7.9, 2.0, 1H), 7.40 (DDD, J = 7.2, 4.9, 0.9, 1H), 7.30 (ד, J = 8.2, 1H), 4.22 (t, J = 6.6, 2H), 2.73 (t, J = 2.4, 1H), 2.18 - 2.11 (מ ', 2H), 1.76 - 1.62 (מ ', 2H), 1.50 - 1.23 (מ', 12H).
      1 H NMR (400 מגה-הרץ, DMSO- ד 6) מרכיב קטן δ = 7.74 (dd, J = 7.2, 1.9, 1H), 7.47 (dd, J = 6.7, 2.3, 1H), 6.44 (ד, J = 9.4, 1H), 6.30 - 6.25 (מ ', 1H), 4.35 (t, J = 6.5, 2H), 2.72 (t, J = 2.4, 1H), 2.18 - 2.11 (מ', 2H), 1.77 - 1.60 (מ ', 2H ), 1.52 - 1.20 (מ ', 12H).
    8. השתמש השמן ללא כל פרדה או לטיהור נוספת.
  2. הכנת [(3 S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] אמוניום אצטט
    1. הכנת בנזיל N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4-methoxyphenyl) אמינו] -2-oxoethי.ל.] carbamate.
      1. בבקבוק 4-L מסביב לתחתית, לפזר 141.5 גרם של -anisidine p ב 1.5 ליטר של tetrahydrofuran ו -0.5 ליטר של dichloromethane.
      2. מצננים את הפתרון 0 מעלות צלזיוס באמבט קרח.
      3. הוסף 50.0 גרם של N -Cbz-L-סרין ו 43.9 גרם של N - (3-dimethylaminopropyl) - הידרוכלוריד -ethylcarbodiimide N '.
      4. מערבבים את התערובת עם פס מגנטי ב 0 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      5. הסר את הפתרון מהאמבטיה הקרח ומערבבים עם פס מגנטי ב RT במשך 16 שעות.
      6. לאדות את הממסים בלחץ מופחת (מאייד סיבובי).
      7. להוסיף 400 מ"ל של 1: 1 cyclohexane / אתיל אצטט, מערבבים עם מרית, למזוג.
      8. חזור על שלב 1.2.1.7 פעמים נוספות.
      9. ממיסים את שאריות דביק ב 500 מ"ל של אתיל אצטט ולשטוף עם 400 מ"ל של 0.1 פתרון M HCl (10 פעמים), עם 400 מ"ל של תמיסת NaHCO 3 רווי (2 פעמים), ועם 400 מ"ל של מי מלח.
      10. ייבש את השכבה האורגנית עם2 Na SO 4, לסנן את הפתרון דרך כותנה לתוך בקבוק מסביב לתחתית (ראשון טרה), להתאדות זה ליובש בלחץ מופחת (מאייד סיבובי).
      11. לשקול את הבקבוק ולקבל 61.4 גרם של מוצק לבן.
        1 H NMR (400 מגה-הרץ, DMSO- ד 6) δ = 9.86 (BS, 1H), 7.52 (ד, 2H, J = 9.0 הרץ), 7.42-7.25 (מ ', 6 שעות), 6.91-6.85 (מ', 2H) , 5.06 (ד, 1H, J = 12.9 Hz), 5.02 (ד, 1H, J = 12.9 Hz), 4.98 (t, 1H, J = 5.6 הרץ), 4.24-4.15 (מ ', 1H), 3.72 (ים, 3H), 3.70-3.57 (מ ', 2H).
    2. הכנת בנזיל N - [(S) -1- (4-methoxyphenyl) -2-אוקסו-azetidin-3-י.ל.] carbamate.
      1. ממיסים 58.6 גרם של N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4-methoxyphenyl) אמינו] -2-אוקסו-אתיל] carbamate ב 1.6 ליטר של N, N -dimethylformamide.
      2. מצננים את הפתרון 0 ° C עם באמבט קרח.
      3. הוסף 50.6 גרם של 1,1'-sulfonyldiimidazole ומערבבים עם פס מגנטי למשך 30 דקות.
      4. מצננים את הפתרוןל -20 מעלות צלזיוס עם אמבט קרח / NaCl ולהוסיף 10.2 גרם של הידריד נתרן (60% שמן מינרלים) חלק חכם.
      5. מערבבים את התערובת ב -20 ° C למשך שעה 1, ולאחר מכן להרוות עם 2 מ"ל של מתנול 1 ליטר של מים.
      6. אבק לסנן את המשקע, לשטוף עם 200 מ"ל מים, ויבש תחת ואקום.
      7. השג 42.2 גרם של מוצק לבן.
        1 H NMR (400 מגה-הרץ, DMSO- ד 6) δ = 8.08 (ד, 1H, J = 8.5 הרץ), 7.42-7.28 (מ ', 5H), 7.30 (ד, 2H, J = 8.9 הרץ), 6.95 (ד , 2H, J = 8.9 הרץ), 5.06 (ים, 2H), 4.86 (DDD, 1H, J = 8.5, 5.6, 2.6 הרץ), 3.90 (t, 1H, J = 5.6 הרץ), 3.73 (ים, 3H) , 3.55 (dd, 1H, J = 5.6, 2.6 הרץ).
    3. הכנת בנזיל N - [(S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] carbamate.
      1. להשעות 9.0 גרם של בנזיל N - [(S) -1- (4-methoxyphenyl) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] carbamate ב 500 מ"ל של אצטוניטריל ו -400 מ"ל מים.
      2. מצננים את הפתרון 0 מעלות צלזיוס באמבט קרח.
      3. הוסף 45.4 גרם של קריחלק מבחינת אמוניום חנקתי ג מעל 45 דקות ומערבבים עם פס מגנטי ב 0 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
      4. הוסף 500 מ"ל של תמיסת NaHCO 3 רווי בזהירות, ולאחר מכן להוסיף 500 מ"ל של אתיל אצטט.
      5. סנן את המשקע ולשטוף עם 200 מ"ל של אתיל אצטט.
      6. הפרד את הפתרון biphasic ולשטוף את השכבה המימית עם 200 מ"ל של אתיל אצטט (3 פעמים).
      7. ייבש את השכבה האורגנית עם Na 2 SO 4, להוסיף 5 גרם של פחם פעיל, מסנן באמצעות כרית של סיליקה diatomaceous, להתאדות עד יובש תחת לחץ מופחת (מאייד סיבובי).
      8. הוספת אתר diethyl ומערבבים במרית.
      9. סנן את המוצק להשיג 4.85 גרם של מוצק אוף-וויט.
        1 H NMR (400 מגה-הרץ, DMSO- ד 6) δ = 7.97 (ד, 1H, J = 8.7 הרץ), 7.94 (BS, 1H), 7.42- 7.30 (מ ', 5H), 5.05 (ים, 2H), 4.67 (DDD, 1H, J = 8.7, 5.4, 2.7 הרץ), 3.40 (t, 1H, J = 5.4 הרץ,), 3.09 (dd, 1H, J = 5.4, 2.7 הרץ).
    4. הכנת [(S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] -ammonium אצטט.
      1. ממיסים 0.93 מ"ל של חומצה אצטית ב 245 מ"ל של אתיל אצטט. סמן כדואר "השמנת פתרון."
      2. ממיסים 3.28 גרם של benzyl- N - [(R) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] carbamate ב 298 מ"ל של אתנול.
      3. הוסף 14.1 מ"ל של cyclohexadiene ו 3.27 גרם של פלדיום 10% על פחמן.
      4. מערבבים את ההשעיה על RT במשך 12 שעות, ולאחר מכן עובר דרך המסננת של כרית קצר של כדור הארץ diatomaceous. יוצקים את הנוזל משחררי ישירות לתוך התמיסה השמנה.
      5. להתאדות הממס בלחץ מופחת (מאייד סיבובי), שמירה על הטמפרטורה מתחת ל -35 מעלות צלזיוס.
      6. Triturate מוצק שהושג עם tetrahydrofuran ולקבל 1.72 גרם של מוצק לבן.
        1 H NMR (400 מגה-הרץ, DMSO- ד 6) δ = 7.68 (BS, 1H), 3.99 (DDD, 1H, J = 5.2, 2.4, 1.2 הרץ), 3.32 (t, 1H, J = 5.2 הרץ), 2.79 (dd, 1H, J = 5.2, 2.4 הרץ), 1.90 (ים, 3H).
  3. הכנת Undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] carbamate
    1. בבקבוק מסביב לתחתית 10 מ"ל, לפזר 60 מ"ג [(3 S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] אמוניום אצטט ב 2 מ"ל של dichloromethane יבש.
    2. מצננים את הפתרון 0 מעלות צלזיוס באמבט קרח ולהוסיף 81 μl של N, ירידה מבחינת -diisopropylethylamine N.
    3. ממיסים 350 מ"ג של תערובת גולמי המכיל undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-carboxylate ב 2 מ"ל של dichloromethane יבש, להוסיף אותו הפתרון, ומערבבים ב RT במשך 15 שעות. להתאדות הממס ליובש בלחץ מופחת (מאייד סיבובי).
    4. לטהר ידי כרומטוגרפיה בעמודה (ג'ל סיליקה) באמצעות מנגנון כרומטוגרפיה בעמודה אוטומטי:
      1. ספוג את המדגם על ג'ל סיליקה, לאזן את העמודה עם cyclohexane, ו לטעון את המדגם לתוך המחסנית.
      2. Elute עם אצטט cyclohexane / אתיל מ 100: 0 עד 0: 100 ולאסוף פסגות על מבחנות.
      3. להתאדות הממס של השברים המתאימים למתחם ליובש בלחץ מופחת (מאייד סיבובי) ולקבל 40 מ"ג של מוצק לבן.

2. הכנת ריאגנטים CC

  1. הכנת 5 מ"מ Stock פתרון של מולקולות Tag-אזיד
    1. ממיסים 1.5 מ"ג של אזיד-PEG3-פלואוריד 545 ב 0.5 מ"ל של sulfoxide דימתיל (DMSO). הפוך aliquots ב 0.5 מ"ל צינורות microcentrifuge וחנות ב -20 ° C.
    2. ממיסים 1.1 מ"ג של אזיד-PEG3-ביוטין 0.5 מ"ל של DMSO. הפוך aliquots ב 0.5 מ"ל צינורות microcentrifuge וחנות ב -20 ° C.
  2. הכנת פתרון במלאי 50 מ"מ של טריס (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)
    1. ממיסים 14.3 מ"ג של TCEP ב 1 מ"ל של מים, ולהפוך אותו טרי בכל פעם.
  3. הכנת 50 מ"מ פתרון של CuSO 4 · 5H 2 O
    1. בקבוקון זכוכית, לפזר 12.48 מ"ג של CuSO 4 · 5H 2 O ב 1 מ"ל מים. חנות ב RT במשך עד חודש.
  4. הכנת 83.5 מ"מ Stock פתרון של טריס [(1-בנזיל-1H-1,2,3-triazol-4-י.ל.) מתיל] אמין (TBTA)
    1. בקבוקון זכוכית, לפזר 8.85 מ"ג של TBTA ב 200 μl של DMSO. חנות ב RT במשך עד חודש.
  5. הכנת 1.7 מ"מ עבודה פתרון של TBTA (מיד לפני השימוש)
    1. הוסף 20 μl של 83.5 מ"מ TBTA בקבוקון זכוכית לדלל עם 180 מ"ל של DMSO.
    2. להוסיף 800 μl של טרט -Butanol מערבולת.

3. ניתוח ביטוי NAAA רקמות Paw של חולדות שטופלו CFA

הערה: השתמש זכר Sprague-Dawley חולדות, במשקל 175-200 גרם, ולבצע את כל הנהלים בהתאם להנחיות לשימוש מוסרי לחיות. חולדות בית בכלובים מאווררים על אור 12-hr / חושך מחזור ולתת להם גישה חופשית למזון ומים. בשביל הפרוטוקול של CFטיפול, עיין במאמר שפרסם Bonezzi et al. 29 חיות השתמש 7 ימים לאחר מתן CFA.

  1. עירוי לוריד של ARN14686
    1. ממיסים ARN14686 ברכב (PEG 15% ו -15% פתרון Tween מלוחים). חשב את הריכוז פתרון על פי משקל חולדה (במינון 3 מ"ג / ק"ג, נפח הזרקה 5 מ"ל / ק"ג).
    2. המשך עם iv זריקות בשלוש נאיבי שלושה עכברושים שטופלו CFA. מניח כל עכברוש מכשיר איפוק פלסטיק מתאים. ואז, במקום זנב-עכברוש במים חמים במשך 2-4 דקות, כדי לאפשר התרחבות, ולהזריק את iv המתחם דרך וריד הזנב.
    3. להזריק שלושה עכברושים (נאיבי CFA שטופלה) iv עם רכב בלבד.
  2. Paw איסוף Dissection
    1. להקריב את החולדות על ידי hr משאיפת 4 2 CO לאחר מתן בדיקה או רכב ולאסוף כפותיהם ידי חיתוכם 0.5 ס"מ מעל מפרק הברך באמצעות אזמל.
    2. מוציא בזהירות את העור על ידי לנתיחה בסיוע מספרית לנתח את רקמות רכות על ידי גירוד אותם מן העצם. מחק את העצמות לאסוף את הרקמות הרכות של הכפות. דגימות להקפיא צמד בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C.
  3. הכנת חלבון Paw המגון ו ליזוזומלית
    הערה: הימנע משימוש בחומרי ניקוי או מאגר המכיל אמין, כפי שהם יכולים לעכב את תגובת CC.
    1. שלב רקמות כפה מן 3 חולדות (שהושגו כמפורט בסעיף 3.2.1) ו homogenize אותם סוכרוז 4 מ"ל של 320 מ"מ ב פוספט שנאגרו מלוחים (PBS, pH 7.4) ו קוקטייל מעכבי פרוטאז (ראו טבלה חומר / מגיב); להשתמש באמצעי פיזור בעל ביצועים גבוהים (ראה טבלת חומר / מגיב).
    2. צנטריפוגה homogenate רקמות במשך 20 דקות XG ב 1000 ב 4 מעלות צלזיוס; להציל את supernatant.
    3. הוסף 2 מ"ל של סוכרוז 320 מ"מ ב- PBS ואת מעכבי פרוטאז קוקטייל על גלולה רקמותhomogenize פעם נוספת.
    4. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 1000 XG ב 4 ° C, ולהוסיף את supernatant אל אחד משלב 3.3.2.
    5. צנטריפוגה supernatants שנאספו במשך 30 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C..
    6. לשקול גלולה ו resuspend בשני כרכים של PBS (כלומר, 200 μl לכל 100 מ"ג של גלולה). מעבירים צינור 1.5 מ"ל אוסף ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    7. הפשרת הדגימות ולהקפיא שוב במשך שעה 1 ב -80 מעלות צלזיוס.
    8. חזור על מחזור ההקפאה / הפשרה עוד פעמיים.
      הערה: צעד זה נועד solubilize החלבון. להקפיא לילה במידת הצורך.
    9. צנטריפוגה במשך שעה 1 ב 100,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. אסוף את supernatant, אשר מכיל חלבונים ליזוזומלית מסיסים, וזורקים את הכדור. חנות ב -80 ° C או מיד להמשיך עם כימות חלבון.
    10. לכמת את תכולת החלבון באמצעות assay חלבון BCA 30 ערכה מסחרית (ראה חומר / לוח מגיב ), בעקבות הוראות היצרן.
    11. אחסן את דגימות ב -80 ° C עד השימוש.
  4. CC עם אזיד-PEG3-ביוטין
    הערה: הפרוטוקול של CC והעשרת חרוז streptavidin (שלבי 3.4-3.6) הם שונים מעט מן הפרוטוקול בהוצאת Speers ו Cravatt 31.
    1. הכן 500 μl (1 מ"ג / מ"ל, ב PBS) של חלבונים ליזוזומלית חולדות probe- ורכב שטופלו (נאיבי וחולדות שטופלו CFA).
    2. דגימות הפרקליר עם 40 μl של slurry 50% agarose streptavidin (לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS לפני השימוש) במשך שעה 1 ב 4 ° C. צנטריפוגות במשך 4 דקות XG ב 1000 ב 4 ° C ולקחת את supernatant.
    3. להוסיף 11.3 μl של המניה 5 מ"מ של אזיד-PEG3-ביוטין ו מערבולת.
    4. להוסיף 11.3 μl של המניה 50 מ"מ של המוכן טרי TCEP מערבולת.
    5. Premix 34 μl של פתרון עובד מוכן טרי של 1.7 מ"מ TBTA עם 11.3 μl של 50 מ"מ CuSO 4 · 5H 2 O המניות.
    6. הוסף 45.3 מ"ל של 4 premixed TBTA / CuSO · 5H 2 O פתרון מערבולת.
    7. דגירה התגובה על 25 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות (זמן הדגירה כבר אינו משפיע על התגובה). שים ממטרי חלבון בשלב זה. מערבבים לאחר השעה הראשונה של דגירה.
  5. הסרת ריאגנטים CC העודפים
    1. צנטריפוגה דגימות במשך 4 דקות ב 6,500 XG ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
    2. הוסף 750 μl של מתנול קר resuspend ידי sonication (5 שניות עם sonicator בדיקה).
    3. צנטריפוגה דגימות במשך 4 דקות ב 6,500 XG ב 4 ° C ולהסיר את supernatant באמצעות מזרק ומחט.
    4. חזור על שלב 3.5.2 פעמיים (sonication אינה נדרשת).
    5. לאחר לשטוף האחרון, להוסיף 325 μl של סולפט dodecyl נתרן (SDS) 2.5% ב PBS על 3x חלבון גלולה sonicate במשך 5 שניות.
    6. מחממים את הדגימות במשך 5 דקות ב 65 מעלות צלזיוס ו sonicateלְהַשִׂיג.
    7. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 6,500 XG ב RT ולשמור את supernatant.
    8. להוסיף 1.4 מ"ל של PBS על מנת לדלל את ריכוז SDS 0.5%. חנות ב -20 ° C או להמשיך עם העשרת streptavidin.
  6. עשרה streptavidin
    1. עם PBS, ולהביא את הנפח של הדגימות שהתקבלו בשלב 3.5.8 ל -4.2 מיליליטר. הוסף 40 μl של slurry 50% agarose streptavidin באמצעות קצה לחתוך-סוף (לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS לפני השימוש).
    2. דגירה עבור שעה 2 ב RT עם סיבוב ואז צנטריפוגות במשך 2 דקות ב g x 1,400.
    3. הסר את supernatant מבלי לייבש את החרוזים גלולים ולהשתמש supernatant שיורית להעביר את החרוזים על 1 מיליליטר ספין עמודה (ראה טבלת חומר / מגיב).
    4. לשטוף על ידי כוח הכבידה עם 3x 1 מ"ל של 1% SDS (PBS), 3x 1 מ"ל של 6 M אוריאה (PBS), ו 4x 1 מ"ל של PBS.
    5. השתמש 2x 500 μl של PBS להעביר את החרוזים כדי צינור 1.5 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 1400 XG ב RT. בעדינות לשאוב supernatant עם מזרק ומחט.
    6. Elute החלבונים הנכנס שרף על ידי הוספת 25 μl של חיץ elution (6 אוריאה M, 2 M thiourea, 2% SDS, ו ביוטין 6 מ"מ, כל PBS) במשך 15 דקות ב RT ואחריו 15 דקות ב 95 מעלות צלזיוס 32.
  7. כתם חלבון
    1. הוסף 5 μl של חיץ 6x Laemmli (עבור 9 מ"ל: 0.5 מ"ל של 1 M טריס- HCl pH 6.8, 5 מ"ל של 20% SDS, 5 מ"ג bromophenol כחול, 3 מ"ל גליצרול, ו- H 2 O עד 9 מ"ל) ולהוסיף 5% β-mercaptoethanol מיד לפני השימוש. בקצרה בצנטריפוגה דגימות XG ב 2000 עד גלולה שרף עומס 25 μl של supernatant המתקבל לג'ל polyacrylamide 4-12%.
    2. בצע ג'ל אלקטרופורזה והעביר חלבון על קרום סופג פי הוראות היצרן 33.
    3. להרוות את הקרום הסופג עבור שעה 1 עם 10 מיליליטר של חיץ חסימה (ראה טבלת חומר / מגיב) המכיל 0.1% Tween-20.הימנע משימוש חלב, כפי שהוא יכול להגדיל את הרקע.
    4. לשטוף את הממברנה עם 10 מ"ל של 0.05% Tween-20 ב PBS ולהוסיף 10 μl של streptavidin ניאון (ראה חומר / מגיב טבלה) מומס ב 10 מ"ל של חיץ חסימת בתוספת 0.1% Tween-20 עבור שעה 1 ב RT.
    5. לשטוף 4 פעמים עם 0.05% Tween-20 ב PBS ופעם עם PBS לבד (10 דקות כל אחד).
    6. השתמש סורק תמונה (ראה חומר / מגיב טבלה). הפעל את המכשיר ואת המחשב המחובר. מתן עד מוכן.
    7. הפעל את תכנית הרכישה ובחרת במצב הקרינה. בחר באזור הקרום ולבחור את תיקיית היעד עבור קבצים שמורים.
    8. הגדר את הפרמטרים רכישת הבאים: 680 אורך עירור ננומטר, מסנן BPFR700, 1,000 V צינור מכפיל (PMT) ערך (ערוץ 2), ו -25 מיקרומטר גודל פיקסל. רוכש את התמונה.

4. לוקליזציה של קטליטית Active NAAA עכבר הריאות על ידי הקרינה במיקרועותק

הערה: זכר השתמש 8 עד 10 שבועות בן עכברים ולבצע את כל הנהלים בהתאם להנחיות לשימוש מוסרי לחיות. עכברי בית בכלובים מאווררים על מחזור 12 שעות אור / חושך ולתת להם גישה חופשית למזון ומים.

  1. עירוי לוריד של ARN14686 עכברים
    1. ממיסים ARN14686 ברכב: 15% PEG ו -15% תמיסת מלח Tween-20. חשב את הריכוז פתרון על פי משקל העכבר (במינון 3 מ"ג / ק"ג, נפח הזרקה 5 מ"ל / ק"ג).
    2. המשך עם זריקת iv של 3 עכברים. מניח כל עכבר בהתקן ריסון פלסטיק מתאים. ואז, במקום זנב עכבר במים חמים במשך 2-4 דקות, כדי לאפשר התרחבות ולהזריק את iv המתחם דרך וריד הזנב.
    3. להזריק 3 iv עכברים עם רכב בלבד.
  2. אוסף ריאות והכנת פרוסה
    אזהרה: טפל paraformaldehyde בזהירות במנדף, וללבוש כפפות!
    1. להרדים עכברים עם Chloמימה RAL (400 מ"ג / ק"ג). אשר הרדמה עם קמצוץ הבוהן. בצע זלוף transcardial כדלקמן:
      1. באופן שטחי לחתוך את העור הגחון במספריים ולחשוף את משטחי קרום החזה ואת הצפק.
      2. באופן שטחי לחתוך את הקרום הצפק עם מספריים, ממש מתחת תהליך xyphoid, ולחשוף את הסרעפת ואיברים קרביים. היזהר שלא לקרוע כל כלי דם משמעותיים.
      3. פתח את חלל בית החזה על ידי חיתוך הסרעפת מהיבט לרוחב אחת לשנייה.
      4. הכנס את המחט 25 G מחובר משאבת מזרק אוטומטי להשרות 20 מ"ל של תמיסת מלח 0.9% ואחריו 60 מ"ל של 4% PFA חיץ פוספט (0.1 מ ', pH 7.4).
    2. לאחר זלוף יושלם, למשוך את הלב באמצעות מלקחיים ובזהירות לנתח את זה. אחוז קנה הנשימה עם מלקחיים ולחתוך לחלוטין דרך אותו במספריים. בעדינות מושך כלפי מעלה קנה הנשימה ולהסיר את הריאות מן כלוב הצלעות. לנתח את הרקמהלהפריד את הריאה הימנית משמאל.
    3. Postfix רקמות% paraformaldehyde 4 עבור שעה 1, דגימות הקפאת 2-methylbutane קר, ולאחסן אותם ב -80 ° C.
    4. אסוף 40 מיקרומטר חלקים באמצעות cryostat, לעגן אותן מיד בשקופיות (אחד ולכל חמישי), ולעבד אותם אימונוהיסטוכימיה כמפורט להלן.
  3. רקמות פרוסות Permeabilization וחסימה
    1. לשטוף עם PBS (2x למשך 5 דקות) ו permeabilize עם 0.1% Triton X-100 PBS במשך 15 דקות ב RT.
    2. לשטוף עם PBS (2x למשך 5 דקות) ולחסום עם אלבומין 3% שור (BSA) ב- PBS במשך 30 דקות ב RT.
    3. לשטוף עם PBS (2x למשך 5 דקות) ולהמשיך עם CC.
  4. CC עם אזיד-PEG3-פלואוריד 545 על בחתכי רקמה
    1. הכן פתרון על ידי ערבוב חומרים כימיים CC מוכן כמתואר בסעיף 2. 1 מ"ל פתרון, להוסיף: 2 μl של אזיד-PEG3-פלואוריד 545 (5 המניות מ"מ), 20 μl של TCEP (מוכן טרי 50 מ"מ stocיא), 58.8 μl של TBTA (מוכן טרי 1.7 הפתרון עובד מ"מ), 20 μl של CuSO 4 · 5H 2 O (המניה 50 מ"מ), ו -900 μl של PBS.
    2. להוסיף כ -400 μl של תמהיל CC אל בחתכי רקמה, אשר הוכנו על פי סעיף 4.2. שים לב כי ההיקף הנבחר של תמהיל CC מספיק לכסות את הפרוסות. דגירה במשך שעה 1 ב RT מוגן מפני אור.
    3. לשטוף עם PBS (1x במשך 5 דקות), מתנול קר (1x במשך 5 דקות), פתרון של 1% Tween-20 ו- 0.5 mM EDTA ב PBS (3x 2 דקות), ו- PBS (1x במשך 5 דקות).
    4. האוויר יבש, להוסיף טיפה של antifade mountant עם DAPI (ראה חומר / לוח מגיב), הדוק עם מכסה מחליק (הימנעות היווצרות בועה), ואת החותם עם לק. חנות ב 4 ° C עד הניתוח.
  5. רכישת תמונה
    1. שימוש במיקרוסקופ confocal מצויד 546 ננומטר ו -450 לייזרי עירור ננומטר (ראה חומר / לוח מגיב) הבאבמדריך למשתמש.
    2. בחר עדשה 60X אובייקטיבית עם NA = 1.40, והקפד לצפות בתצוגה מקדימה של וחלק הדרך העיני ולהתמקד על שטח של עניין.
    3. קבע את הפרמטרים הרכישה לפי תכונות מדגם וציוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ARN14686 תוכנן בהתבסס על הפיגום של ARN726 מעכב NAAA. קבוצת 4-בוטיל-cyclohexyl של ARN726 הוחלפה עם שרשרת אליפטיות רווי C9 נושאות תג אלקין מסוף (איור 1). תג אלקין הוצג על מנת לאפשר את השימוש של הליך תיוג שני שלבים להוסיף fluorophore או מולקולה ביוטין באמצעות CC. תכונה זו מבצעת רינדור ARN14686 כלי תכליתי מאוד לחקור NAAA במבחנה in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פעילות האנזים מוסדר דק ברמות שונות, כולל שעתוק RNA, סינתזת החלבון, טרנסלוקציה חלבון, שינוי שלאחר translational, ואינטראקציה בין חלבונים. לעתים קרובות, ביטוי האנזים אינו לבד חשבון עבור פעילותה. ABPP פותח כדי לחקור את פעילותם של חלבונים במצב הטבעי שלהם. שתי תכונות נדרשות: בדיקה כימית שקושרה קוולנטית אל האתר הפעיל של אנזים עניין ותג כתב כדי לזהות את האנזים שכותרתו בדיקה.

עיצוב וסינתזה Probe הם נקודות קריטיות של ההלי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים למרכז ההדמיה של ניקון במכון האיטלקי לטכנולוגיה, ג'נובה, איטליה (NIC@IIT).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,1'-sulfonyldiimidazole Sigma Aldrich367818מזיק
2-dipyridylcarbonateFluorochem11331מזיק
2-MethylbutanSigma AldrichM32631דליק, רעיל, מסוכן לסביבה המימית
4-(Dimethylamino) pyridineSigma Aldrich107700
חומצה אצטיתSigma Aldrich695092דליק, קורוזיבי
אצטוניטריל Sigma Aldrich34998דליק, רעיל
Sigma Aldrich161551
אמוניום כלורידSigma AldrichA9434
Jena BiosciencesCLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545Jena BiosciencesCLK-AZ109
BCA ערכת בדיקת חלבוןThermo פישר סיינטיפיק23227
עמודות ביו-ספיןBiorad732-6204
ביוטיןסיגמא אולדריץ'B4501
חוצץ חוסםLi-Cor Biosciences927-40000
β-מרקפטואתנולסיגמא אולדריץ'M6250סרום בווין רעיל ביותר
(BSA)סיגמא אולדריץ'A7030
ברומופנול כחולסיגמא אולדריץ'B0126
Bruker Avance III 400Bruker
CeliteSigma Aldrich419931סכנה בריאותית
Ceric אמוניום חנקתי Sigma Aldrich22249מחמצן,
כלורל הידרטSigma AldrichC8383
CuSO4.5H2O סיגמא אולדריץ'209198
ציקלוהקסדיאןסיגמא אולדריץ'125415דליק, סכנה בריאותית
ציקלוהקסאןסיגמא אולדריץ'34855דליק, מזיק, סכנה בריאותית, סכנה סביבתית
דיכלורומתאןסיגמא אולדריץ'34856מזיק, סכנה בריאותית
דיאתיל אתרסיגמא אולדריץ'296082דליק,
דימתיל סולפוקסיד מזיק (DMSO)Acros Organics348441000
דימתיל סולפוקסיד d6 (DMSO-d6)Sigma Aldrich175943
אתנולSigma Aldrich2860דליק,
מזיק אתיל אצטטSigma Aldrich34858דליק,
גליצרולסיגמא אולדריץ'G5516
אירדיי 680-LT סטרפטווידיןLi-Cor Biosciences925-68031
IRDye680-LT סטרפטווידין Licor925-68031צנטריפוגה קצרה לפני השימוש לזירוז קומפלקסים של חלבונים
מתנולסיגמא אולדריץ'34966
מתנולסיגמא אולדריץ'34860דליק, רעיל, סכנה בריאותית
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′ -ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma AldrichE7750מזיק, קורוזיבי
N,N-diisopropylethylamineSigma AldrichD125806דליק, קורוזיבי, רעיל
N,N-דימתילפורממידסיגמא אולדריץ'227056דליק, מזיק, מסוכן לבריאות
N-CBZ-L-סריןפלואורוכםM03053
מיקרוסקופיה קונפוקלית מזיקה Nikon A1Nikonקרא את המדריך למשתמש
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gelThermo Fisher ScientificNP0335BOX
פלדיום על פחמןסיגמא אולדריץ'330108
p-anisidineSigma AldrichA88255רעיל, סכנה בריאותית, סכנה
סביבתיתParaformaldehydesigma Aldrich441244רעיל, מזיק לדרכי הנשימה, קורוזיבי, ניתן לדילוף
פולי (אתילן גליקול) Sigma AldrichP3265
ProLong זהב תושבת נגד דהייה עם DAPI תרמו פישר סיינטיפיקP36931הימנע מהיווצרות בועות
קוקטייל מעכב פרוטאזסיגמא אולדריץ'P8340
נתרן ביקרבונטסיגמא אולדריץ'S6014
נתרן דודציל סולפט (SDS) Sigma AldrichL3771הידריד רעיל, קורוזיבי, ניתן לזיקה
 Sigma Aldrich452912
נתרן גופרתיSigma Aldrich239313
Starion FLA-9000 סורק אימאגFUJIFILMקרא  המדריך למשתמש
Streptavidin agaroseThermo Fisher Scientific20349
סוכרוזסיגמא אולדריץ'S7903
טרט-בוטנולסיגמא אולדריץ'360538
טטרהידרופוראןסיגמא אולדריץ186562דליק, מזיק, סכנה בריאותית
ThioureaAcros Organics424542500רעיל, חם ב-50 מעלות; C להמסת
TrisSigma AldrichRDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)Sigma AldrichC4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)Sigma Aldrich678937
Triton-x100Sigma AldrichX100Toxic
Tween-20Sigma AldrichP9416
Tween-80Sigma AldrichP1754
Ultra turrax IKA T18 הומוגנייזר רקמות בסיסיIKA
Undec-10-yn-1-olFluorochem13739אוריאה מזיקה
סיגמא אולדריץ'U5378רעיל, חם ב-50 מעלות; C להתמוסס
רעילה פחם פעיל אזיד מזיק-PEG3-ביוטין אלבומין מזיק רעיל מזיק נתרן דליק ' ' רעיל, דליק

מקורות

  1. Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
  2. Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
  3. Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
  4. Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
  5. Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
  6. Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
  7. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  8. Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
  9. Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
  10. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  11. Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
  12. Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
  13. Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
  14. Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
  15. Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
  16. Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
  17. Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
  18. Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
  19. West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
  20. Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
  21. Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
  22. Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
  23. Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
  24. Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
  25. Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
  26. Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
  27. Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
  28. Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
  29. Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
  30. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  31. Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
  32. Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
  33. Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
  34. Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
  35. Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הכנה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.