הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע

8.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54666

⸱

31 באוקטובר 2016

 , 
1Waksman Institute, Rutgers University, 2Department of Genetics, Rutgers University

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקולים לאיסוף, הכנה והדמיה של ביציות דרוזופילה בוגרות. שיטות אלו מאפשרות הדמיה של התנהגות הכרומוזומים והרכבת הציר ותפקודו במהלך מיוזה.

תקציר

הפרדת כרומוזומים בביציות אנושיות מועדת לטעויות, וכתוצאה מכך אנופלואידיה, שהיא הגורם הגנטי המוביל להפלה ולמומים מולדים. חקר התנהגות הכרומוזומים בביציות מאורגניזמים מודל טומן בחובו הבטחה רבה לחשוף את הבסיס המולקולרי של הרגישות של ביציות אנושיות לאנופלואידיה. Drosophila melanogaster נתון למניפולציה גנטית, עם למעלה מ-100 שנות מחקר, קהילה ופיתוח טכניקות. עם זאת, להמחשת התנהגות הכרומוזומים והרכבת הציר בביציות דרוזופילה יש אתגרים מיוחדים, בעיקר בשל נוכחותם של ממברנות המקיפות את הביצית שאינן חדירות לנוגדנים. אנו מתארים כאן פרוטוקולים לאיסוף, הכנה והדמיה של הרכבת ציר מיוזה I והתנהגות כרומוזומים בביציות דרוזופילה, המאפשרים דיסקציה מולקולרית של הפרדת כרומוזומים באורגניזם מודל חשוב זה.

מבוא

חקר המיוזה מתואר לפעמים כ"גנטיקה של הגנטיקה". הסיבה לכך היא שהתכונות הבסיסיות של תורשת כרומוזומים ומבחר עצמאי מתבצעות באמצעות הפרדת כרומוזומים במהלך ייצור הגמטות. הדגמה חשובה של תאוריית הכרומוזומים של התורשה הגיעה ב-1916 מעבודתו של קלווין ברידג'ס ב-Drosophila melanogaster1. מחקר זה ומחקרים גנטיים קלאסיים אחרים בדרוזופילה תרמו רבות להבנת הגנטיקה שלנו. בדיקה ציטולוגית של כרומוזומים מיוטיים בביציות דרוזופילה, לעומת זאת, הייתה מאתגרת. הסיבה העיקרית לכך היא שאימונופלואורסצנציה של ביציות דרוזופילה בשלב מאוחר, כאשר הציר מתאסף והכרומוזומים מכוונים להפרדה, נפגעת על ידי נוכחות של ממברנות שהופכות את הביצית לבלתי חדירה לנוגדנים.

למרות אתגר זה, ביציות דרוזופילה נותרו מודל אטרקטיבי לחקר התנהגות הכרומוזומים והרכבת הציר. הסיבה לכך היא הכלים הגנטיים החזקים הזמינים בדרוזופילה, אך גם מכיוון שהביציות נעצרות במטאפאזה I, כאשר הכרומוזומים מכוונים והציר נוצר במלואו. זה מקל על איסוף ובדיקה של מספר רב של ביציות בשלב חשוב זה של חלוקת התאים. בנוסף, אורגניזם מודל פשוט הניתן למניפולציה גנטית לחקר הפרדת כרומוזומי ביציות יכול לספק תרומה חשובה להבנתנו את בריאות הרבייה האנושית. שגיאות במספר הכרומוזומים הן הגורם הגנטי המוביל להפלה ולמומים מולדים בבני אדם2. ניתן לייחס את רוב השגיאות הללו לביצית והן קשורות לעלייה בגיל האם. הגיל הממוצע של אמהות בארה"ב עולה, מה שהופך את זה לדאגה גדולה לבריאות הציבור.

אנו מתארים כאן שיטות לבדיקה ציטולוגית של ביציות דרוזופילה, כולל הדגמה כיצד להסיר את ממברנות הביציות. שיטות אלה הן שינויים של פרוטוקולים שתוארו לראשונה על ידי Theurkauf ו-Hawley3, Zou et al.4, ו-Dernburg et al.5. אנו כוללים גם שיטות להעשרה של שלבים שונים של ביציות, המבוססות על פרוטוקול שתואר לראשונה על ידי Gilliland ואחרים.6. לבסוף, אנו מוסיפים הוראות לטיפול תרופתי בביציות דרוזופילה. יחד, שיטות אלו מאפשרות חקירה ציטולוגית של הפרדת כרומוזומי ביציות והרכבת ציר בדרוזופילה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: ההליכים מתבצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. חממות שבשליטת טמפרטורה משמשים כדי לשמור על טמפרטורות עבור גידול זבוב וחוצה אלא אם צוין אחרת.

1. הכנות

  1. הכן זבובים.
    1. Prometaphase מועשר אוספי ביצית.
      1. מבוגר מנקה זבובים מתרבויות מניות או צלב בריאות, צעירות. בקבוקי גיל ליומיים של 25 מעלות צלזיוס.
        הערה: באופן כללי שני בקבוקים בריאים יספיקו, אם כי יותר עשוי להיות נחוץ עבור בתרבויות מסוימות צלב.
      2. לאחר יומיים, לאסוף ~ 100 עד 300 נקבות (שהינם 0 עד 2 בימים ההם בשלב זה) מהבקבוקים. הנקבות לא צריכות להיות בתולות. להוסיף טיפה של רסק שמרים לצד בקבוקון ולמקם 30 נקבות ו -10 עד 15 גברים כל לתוך צלוחיות yeasted. בקבוקוני גיל לימים של 25 מעלות צלזיוס.
    2. Metaphase מועשר אוספי ביצית.
      1. אסוף ~ 100 עד 300 נקבות מן cultur מניות או צלבes. להוסיף טיפה של רסק שמרים לצד בקבוקון ולמקם 30 נקבות כל (ללא זכרים הוסיפו) לתוך צלוחיות yeasted. בקבוקוני גיל במשך שלושה עד חמישה ימים ב- C ° 25.
  2. הכינו פתרונות.
    הערה: הפתרונות עשויים להיות מאוחסנים ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.
    1. הכן שונה מאגר של רוב (5x): 500 מ"מ HEPES, 500 סוכרוז מ"מ, 275 מ"מ נתרן אצטט, 200 אצטט אשלגן מ"מ, 50 מ"מ גלוקוז, 6 מגנזיום כלוריד מ"מ, סידן כלורי 5 מ"מ. השתמש 10 N 11: סודיום הידרוקסיד 8: הידרוקסיד אשלגן להביא pH ל -7.4. לעקר על ידי סינון; לא חיטוי. חנות ב -20 מעלות צלזיוס. להפשיר לפי הצורך להכין ~ 200 מ"ל של הכנה לכל הביצית של 1x Robb.
    2. פתרונות קיבוע.
      1. אפשרות מס '1: כן קיבעון פורמלדהיד / heptane. כן הצפת קיבוע: 1x פוספט שנאגר מלוח (PBS) בתוספת 150 סוכרוז מ"מ. כדי להשתמש, לעשות טרי עם 687.5 μl הצפת קיבוע 312.5 μl 16% פורמלדהידלכל הכנת ביצית.
        זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת שימוש פתרונות פורמלדהיד במנדף. מפנה את הפסולת בהתאם להנחיות מוסדיות.
      2. # 2 אפשרות: כן קיבעון פורמלדהיד / cacodylate. הכינו תערובת תקן: 250 סוכרוז מ"מ, 100 אצטט אשלגן מ"מ (pH 7.5), אצטט נתרן 25 מ"מ (pH 7.0), ו -25 מ"מ EGTA (pH 8.0). כדי להשתמש, לעשות טרי עם 400 μl תקן מיקס, 100 cacodylate אשלגן μl (1 M, pH 7.2), ו -500 μl 16% פורמלדהיד לכל הכנה הביצית.
        זהירות: אשלגן cacodylate מכיל ארסן.
    3. כן PBS / טריטון X-100: 1x PBS בתוספת 1% או 0.05% Triton X-100. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
    4. הכן PBS-Tween 20-שור סרום אלבומין (BSA) (PTB): PBS 1x, 0.5% BSA (w / v), ו -0.1% Tween-20. עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע אחד.
    5. קרינת הכלאה באתרו (FISH) פתרונות.
      1. כן כלוריד-נתרן 20X ציטראט (SSC): 3 M נתרן כלורי 0.3 M נתרן ציטרט.
      2. הכן 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC פלוס 0.1% Tween-20. הפוך טרי, ~ 20 מ"ל לכל הכנת ביצית.
      3. הכינו פתרונות לפוראמיד: 2x SSC, 0.1% Tween-20, פלוס לפוראמיד. הפוך טרי, 1 מ"ל 20% לפוראמיד, 0.5 מ"ל 40% לפוראמיד, ו -2 מ"ל 50% לפוראמיד לכל הכנה הביצית.
        זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת שימוש פתרונות לפוראמיד במנדף. מפנה את הפסולת בהתאם להנחיות מוסדיות.
      4. כן פתרון הכלאה: 2x SSC, 50% לפוראמיד, ו -10% סולפט dextran (w / v). חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
    6. בדיקות FISH.
      1. Oligonucleotides להזמין (ראה לוח 1 עבור רצפים) עם טיהור HPLC ורצוי 5 'שינוי ניאון (למשל, Cy3 או Cy5). Resuspend ב טריס-EDTA (TE) ב 50 ng / μl.
        הערה: גן oligos מחשיפה לאור בכל העת.

2. אוסף של ביציות תסיסנית בשלבים מתקדמים

  1. כפי ש ביציות תסיסנית עם קרומים שלמים ידבק פלסטיק וזכוכית, מראש המעיל הפנימי של אחד 5 מ"ל צינור ואחד פסטר pipet לכל הכנה הביצית עם PTB.
  2. להרדים כל ~ 100 עד 300 זבובי yeasted עם פחמן דו חמצני ומוסיף בבלנדר המכיל ~ 100 מיליליטר 1x ההצפה של רוב. פעמים דופקות שלוש (~ 1 שניות כל אחד). שמור ביציות ב Robb של עבור <20 דק 'כדי להימנע מהפעלת.
    הערה: לחלופין, ביציות ניתן יד גזורה מן הנקבות. היתרון של שיטה זו הוא בכך שהיא דורשת נקבות פחות. עם זאת, יש להקפיד על מנת להגביל את החשיפה לפחמן דו-חמצני כדי רק כמה דקות, כדי למנוע חפצים הקשורים היפוקסיה 7.
  3. סינון דרך רשת גדולה (~ 1,500 מיקרומטר) לתוך כוס 250 מ"ל להסיר חלקי גוף גדול. אם בטן שלמה רבה נותרה על חומר רשת, מחדש לטחון באמצעות ההצפה של רוב נוספת, ולסנן שוב. בואו להתיישב ~ 2 דקות, ולאחר מכן לשאוב את השכבה העליונה, הסרת כמה שיותר חלקי גוף גדול ככל האפשר.
  4. אלחוטיLTER דרך רשת קטנה (~ 300 מיקרומטר) לתוך מבחנה 250 מ"ל. לשטוף ביציות הנותרות מתוך המבחנה הראשונה באמצעות ומצופה pipet פסטר של רוב נוספים. בואו להתיישב ~ 3 דקות; ביציות יישבו בחוץ. לשאוב את כל אבל ~ 10 מ"ל.
  5. יוצקים כמה שיותר 10 מ"ל כמו ייכנס לתוך הצינור 5 מ"ל מצופה. בואו להתיישב, להסיר את הנוזל, וחזרו עם שארית. לשטוף ביציות הנותרות מתוך מבחנה באמצעות ו של רוב נוסף pipet פסטר מצופה. בואו להתיישב צינור 5 מ"ל ~ 3-5 דקות.

3. טיפולים תרופתיים (אופציונלי)

  1. מעיל צינור 5 מ"ל השני עם PTB לכל הכנה הביצית. להוסיף ממס מתאים (שליטה) או תרופה עד 1 מיליליטר רוב של כל עבור כל הכנת ביצית (טבלה 2).
  2. ביציות פיצול לתוך הצינור השני מצופה 5 מ"ל. בואו להתיישב, להסיר את נוזל, ולהוסיף 1 מ"ל Robb של פלוס ממס לתוך צינור אחד ו 1 מ"ל Robb של פלוס התרופה לתוך הצינור השני. Nutate עבור משך הזמן המתאים עבור טיפול תרופתי (טבלה 2). Let להתיישב.

קיבוע 4.

  1. לשאוב את כל הנוזל ומיד להוסיף 1 מ"ל תקן.
  2. אפשרות # 1: פורמלדהיד / heptane קיבעון (קיבוע הצפה בתוספת 5% פורמלדהיד).
    1. תקן עבור 2.5 דקות על nutator. להוסיף heptane 1 מ"ל ו מערבולת 1 דקות. בואו להתיישב ~ 1 דק '.
    2. הסר את כל נוזל, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל 1x PBS. וורטקס 30 שניות. בואו להתיישב ~ 1 דק '.
    3. הסר את כל הנוזל, ולאחר מכן למלא צינור עם 1x PBS.
      הערה: ביציות ניתן להשתמש מיד או שמרו על nutator במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר.
  3. # 2 אפשרות: קיבעון פורמלדהיד / cacodylate (תקן Mix Plus 8% פורמאלדהיד 100 מ"מ cacodylate).
    1. תקן עבור 6 דקות על nutator. בואו להתיישב 2 דקות. הסר נוזלי, ולאחר מכן למלא צינור עם 1x PBS.
      הערה: ביציות ניתן להשתמש מיד או שמרו על nutator במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר.

5. הסרת ממברנות ( "רולינג")

  1. שימוש pipet פסטר מצופה, להוסיף ~ 500 1,000 ביציות לחלק (חול-מותז) החלבי של שקופית זכוכית. הסר את כל חלקי הגוף באמצעות מלקחי חומר זרים. אל תתנו ביציות להתייבש; להוסיף 1x PBS במידת הצורך.
  2. מניחים coverslip על גבי ביציות בעדינות ביציות "גליל" עד שכל ממברנות מוסרים (גרירת בקצה coverslip ברחבי ביציות עובד הכי טוב.) מדי פעם לבדוק את ההתקדמות מתחת למיקרוסקופ, הוספת עוד PBS 1x לפי הצורך. תשמור על עצמך כמו יותר מדי לחץ יהרוס את הביציות.
    הערה: לקבלת immunofluorescence בלבד, להמשיך עם שלב 6. לדגים (עם או בלי immunofluorescence), להמשיך עם שלב 7.

6. מכתים נוגדן של תסיסנית ביציות

  1. כריית חסימה
    1. לשטוף ביציות התגלגל לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל ~ 15 מ"ל PBS / 1% Triton X-100. ביציות Nutate בפתרון זה עבור לא פחות מ -1.5 שעות ולא יותר מ -2 שעות.שלב זה מאפשר חדירת נוגדן.
    2. בואו ביציות להתיישב ~ 2 דק '. סר נוזל יחד עם ממברנות רבות ככל האפשר, ולאחר מכן להוסיף PBS / 0.05% Triton X-100.
      הערה: ממברנות יישב איטיים יותר ביציות התגלגלו.
    3. תנו ביציות להתיישב ~ 2 דקות, ולאחר מכן להסיר את כל אבל ~ 1 מ"ל נוזל. העברת ביציות כדי סיימו צינור 1.5 מיליליטר ולהסיר נוזל נותר. הוסף 1 מ"ל PTB עבור חסימת nutate עבור שעה 1.
  2. מכתים נוגדן
    1. בולמי Pre של נוגדנים משני נגד עוברים.
      הערה: צעד זה מבטל מכתים רקע מאינטראקציות נוגדן הלא ספציפית עם חלבונים תסיסנית.
      1. אסוף ולתקן עוברים תסיסנית (~ 25 μl) לכל הליך טיפוסי 8. אחסן מתנול ב -20 ° C.
      2. הסר מתנול מעוברים, להוסיף 800 מתנול μl בתוספת 200 μl 1x PBS, nutate במשך 15 דקות. הסר 500 μl של supernatant ולהחליף עם 500 μl 1x PBS. ואז nutate במשך 15 דקות. חזור פעמיים (עבור סכום כולל של ~ 1 hr שוטף), ולאחר מכן לסיים ב PTB.
        הערה: עוברים ניתן להשתמש מיד או שמרו על nutator במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר.
      3. סר נוזלי, מתמלא PTB 200 μl לכל הכנת ביצית, ולהוסיף נוגדנים משני שכותרתו fluorescently ב דילולים מתאימים (יש לזכור כי ההיקף הסופי יהיה 300 μl;. ראה שלב 7.4) Nutate ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (עדיף) או בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 4 שעות.
        הערה: נוגדנים מראש נספג ישמש בשלב 6.2.4.
        הערה: שמור דגימות בחושך ככל האפשר פעם נוגדנים ניאון נוספו.
    2. הסר נוזל ביציות, מתמלא PTB 300 μl, ולהוסיף נוגדנים עיקריים ב דילולים מתאימים. Nutate ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (עדיף) או בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 4 שעות.
    3. לשטוף ביציות ארבע פעמים במשך 15 דקות כל אחד עם 1 מ"ל PTB.
    4. לְהַסִירנוזל ביציות, להוסיף 200 μl של supernatant מעובר (נוגדנים משני שקוע מראש). ואז למלא עם PTB 300 μl. Nutate בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 4 שעות (עדיף) או על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    5. לשטוף ביציות פעם במשך 15 דקות עם 1 מ"ל PTB, להסיר את נוזל. לאחר מכן מוסיפים 0.5 μl Hoechst 33342 ו 500 μl PTB ו nutate עבור 7 דקות.
    6. לשטוף ביציות פעמיים במשך 15 דקות כל אחד עם 1 מ"ל PTB.
      הערה: ביציות יכולות להיות מותקנות בשקופית מייד או ניתן לאחסן PTB על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן הדמיה.

7. FISH (והמשך משלב 5 לעיל)

  1. לשטוף ביציות התגלגל לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל ~ 15 מ"ל 2x SSCT. בואו ביציות להתיישב ~ 2 דק '. הסר את כל אבל ~ 0.5 מ"ל נוזל יחד עם ממברנות רבים ככל האפשר.
    הערה: ממברנות יישב איטיים יותר ביציות התגלגלו.
  2. העברת ביציות כדי צינור 0.5 מ"ל ולהסיר הנוזל הנותר. ברציפות להוסיף ולהסיר 500 μl20%, 40%, ופתרונות לפוראמיד 50%, nutating במשך 10 דקות בכל פתרון.
    הערה: ביציות יישב איטיות עם אחוזים גבוהים של לפוראמיד.
  3. הסר נוזלי, ולאחר מכן להוסיף 500 μl 50% פתרון לפוראמיד, ו nutate ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 עד 5 שעות.
    הערה: incubations יותר לגרום חדירת בדיקה טובה יותר.
  4. הסר נוזלי, והותיר אחריו לא יותר מ ~ 100 ביציות μl, ולהוסיף 36 μl הכלאה פתרון בתוספת 2 μl של החללית (50 ng / μl) ו -2 μl של מים או 2 μl של החללית 2 nd (טבלה 1).
  5. לדגור על 91 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות (FISH בלבד) או 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (FISH בתוספת immunofluorescence), ואחריו הדגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: פעולות אלה עשויות להתבצע ב thermocycler.
  6. אל תסיר נוזלי. הוסף 500 μl 50% פתרון לפוראמיד ואת nutate ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
  7. בואו להתיישב, להסיר את נוזל, להוסיף 500 μl 50% פתרון לפוראמיד, גידולד nutate ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
  8. בואו להתיישב, להסיר את נוזל, להוסיף 500 μl 20% פתרון לפוראמיד, ו nutate בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  9. בצע שלושה שוטף מהיר 500 μl 2x SSCT (בוא להתיישב, להסיר ולאחר מכן להוסיף נוזל, להפוך מספר פעמים, חזור.) בוא להתיישב, להסיר את הנוזל, ולאחר מכן להוסיף 500 μl PTB ו nutate עבור 4 שעות.

8. נוגדן מכתים לאחר FISH

  1. הסר נוזל ביציות, מתמלאות PTB 300 μl, ולהוסיף 10 μl נוגדן אנטי α-טובולין מצומדות כדי FITC. לחלופין, נוגדנים אחרים יכולים לשמש, בעקבות בפרוטוקול לעיל. Nutate בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
  2. לשטוף ביציות פעם במשך 15 דקות עם 500 PTB μl, להסיר את נוזל, ולאחר מכן להוסיף 0.5 μl Hoechst 33342 ו 500 μl PTB ו nutate עבור 7 דקות.
  3. לשטוף ביציות פעמים במשך 15 דקות כל אחד עם 500 μl PTB.
    הערה: ביציות יכולות להיות מותקנות בשקופית מייד או ניתן לאחסן PTB על 4 מעלות צלזיוס עד מוכןהַדמָיָה. שמור ביציות בחושך ככל האפשר פעם נוגדנים ניאון נוספו.
שם חזור כרומוזום רצף אוליגו *
359 איקס GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC 2 AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
dodeca 3 CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1.686 2 + 3 AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT 4 (+ Y) AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* 359 רצף מאריק ג'ויס, תקשורת אישית, רצפים אחרים מהעמוד סאליבן et al. 8

טבלה 1: בדיקות FISH עבור חזרות centromeric תסיסנית.

תְרוּפָה מֵמֵס ריכוז מניות ריכוז סופי זמן טיפול השפעה
קולכיצין אתנול 125 מ"מ 150 מיקרומטר 10 דקות או 30 דקות לערער-קינטוכור הלא (10 דק ') 9 או כל (30 דקות) microtubules
פקליטקסל DMSO 10 מ"מ 10 מיקרומטר 10 דק ' לייצב מיקרופוןrotubules
Binucleine 2 DMSO 25 מ"מ 25 מיקרומטר 20 דק ' לעכב קינאז אורורה B 10

טבלה 2: טיפול תרופתי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השיטות שתיארנו כאן תוביל גביית ביציות תסיסנית בשלב מאוחר המייצגים שלושה שלבי המיוזה (איור 1). ביציות ב prophase מאופיינים בנוכחות מעטפת הגרעין, אשר גלוי על ידי חוסר האות טובולין באזור המקיף את karyosome (איור 1 א). Prometaphase היא התקופה לאחר התמוטטות מעטפת גרעין שבמהלכו מרכיב הכישור. במהלך prometaphase, את karyosome לובשת צורה ייחודית, נעשה ארוך מדי לעתים קרובות עם 4 הכרומוזומים ה מלבד המסה ka...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Staging תסיסנית ביציות

אם כי karyosome מוארך נראה בדרך כלל ב ביציות prometaphase, באמצעות karyosome צורה להבחין prometaphase מ ביציות metaphase יכול להיות בעייתי. במהלך prometaphase, את karyosome מתחיל כמו צורה עגולה, מתארך, ולאחר מכן חזר בו כדי צורה עגולה כמו הביצית מתקרבת מעצר metaphase. משמעות הדבר היא כי רבים ביציות prometaphase אין לי karyosome מוארך. בנוסף, אם ביציות מוטציה או מטופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לכריסטיאן להנר על מתן נוגדן CENP-C ולאריק ג'ויס על ההמלצות על FISH. העבודה במעבדת מק'קים מומנה על ידי מענק מה-NIH (GM101955).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"ל צינורות חרוטייםשונים
16% פורמלדהידטד פלה, בע"מ18505מסוכן; לאחר הפתיחה, יש להשליך לאחר חודש
250 מ"ל כוסותשונות
של 5 מ"ל שמרים
מערבבים עם מים ליצירת משחה העקביות של
נוגדן חמאת בוטנים נגד &אלפא טובולין מצומד לשיבוט FITCSigmaF2168DM1A
Binucleine 2סיגמאB1186בלנדר מסוכן
אלבומין סרום בקר
סידן כלוריקולכיצין שונים
סיגמאC-9754
כיסוייםVWR48366-227מס' 1 1/2
DMSOמגוון
EGTA
שונים
טד פלה, בע"מ5622פינצטה דומונט דיוק גבוה בסגנון 5
פורממידסיגמא47670-250ML-F
שקופיות זכוכיתVWR48312-003
גלוקוז
1.5 מ"ל צינורות
HEPESVWREM-5330זמינים ממספר ספקים
Hoechst 33342שונים
מתנולשונים
m)VWRAA43657-NKמגוון פורמטים וספקים אחרים, 12 או 14
רשת רשת קטנה (~ 300 ומיקרו; m)מעבדות ספקטרום146 424מגוון פורמטים, למשל , 146 422 או 146 486
nutator
אשלגן אצטט
SigmaC0125מסוכן; לחלופין, נתרן קקודילאט עשוי להיות מוחלף
הידרוקסיד
נתרן כלורי
נתרן הידרוקסיד
שונים
סוכרוזשונים
טריטון X-100פישרPI-28314
טווין 20פישרPI-28320
מערבולתשונות
יבשים פעילים שונים שונים סיגמא A4161 מסוכנים דקסטרן סולפט שונים אתנול מלקחיים בוגרים שונים שונים מגנזיום כלוריד רשתות גדולות שונות (~1,500 & מיקרו; פיפטות פסטר שונות שונות חומצה קקודילית שונות באשלגן נתרן אצטט שונים נתרן ציטראט שונים טקסול שונים (פקליטקסל) סיגמא T1912 מסוכן

מקורות

  1. Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein. J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).
  4. Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes. J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).
  5. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86 (1), 135-146 (1996).
  6. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  7. Gilliland, W. D., et al. Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes. PLoS One. 4 (10), e7544(2009).
  8. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  9. Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes. PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).
  10. Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis. ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).
  11. Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
  12. Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
  13. Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila. EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).
  14. Endow, S. A., Komma, D. J. Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes. J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).
  15. Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).
  16. Colombié, N., et al. Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis. Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הרכבת כישורהתנהגות כרומוזומיםהסרה של ממברנהאימונופלורסצנציהמיקרוסקופיה קונפוקליתחדירת נוגדניםקיבוע של ביציתאנליזה של קריוזום
טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.