הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון

10.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54735

⸱

27 באוקטובר 2016

 , 
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology, Johns Hopkins University

במאמר זה

סיכום

דג הזברה מתגלה כמודל רב ערך של עיבוד שומנים תזונתי ומחלות מטבוליות. מתוארים פרוטוקולים של הזנת זחלים עשירה בשומנים, הדמיה חיה של אנלוגים של שומנים פלואורסצנטיים תזונתיים וכימות צריכת מזון. ניתן ליישם טכניקות אלו במגוון טכניקות סינון, הדמיה וחקירה מונעת השערות.

תקציר

דג הזברה מתגלה כמודל לעיבוד שומנים תזונתי ומחלות מטבוליות. פרוטוקול זה מתאר כיצד להאכיל את דג הזברה בארוחה עשירה בשומנים, המורכבת מתחליב של ליפוזומי חלמון ביצת עוף שנוצר על ידי סוניקציה של חלמון ביצה במדיה עוברית. ניתנות הוראות מפורטות לסינון זחלים לצריכת חלמון ביצה כך שזחלים שלא מצליחים להאכיל לא יבלבלו את תוצאות הניסוי. ניתן לשלב את הליפוזומים של חלמון ביצת העוף עם אנלוגים של שומנים פלואורסצנטיים, כולל חומצות שומן וכולסטרול, מה שמאפשר הדמיה מערכתית ותת-תאית של עיבוד שומנים תזונתיים. מתוארות מספר שיטות להרכבה של זחלים התורמים להדמיה חיה לטווח קצר וארוך עם מטרות זקופות והפוכות בהגדלה גבוהה ונמוכה. בנוסף מוצגת בדיקה לכימות צריכת המזון של הזחלים על ידי חילוץ השומנים של אנלוגים ליפידים פלואורסצנטיים המוזנים בזחלים, איתור השומנים על צלחת כרומטוגרפיה בשכבה דקה וכימות הקרינה. לבסוף, נדונים היבטים קריטיים של הנהלים, בקרות חשובות, אפשרויות לשינוי הפרוטוקולים כדי לענות על שאלות ניסוי ספציפיות ומגבלות פוטנציאליות. ניתן ליישם טכניקות אלה לא רק לחקירות ממוקדות המונעות על ידי השערות, אלא גם למגוון מסכים וטכניקות הדמיה חיה כדי לחקור את חילוף החומרים של השומנים בתזונה ואת הבקרה על צריכת המזון.

מבוא

את המנגנונים שבאמצעותם המעי מסדיר עיבוד שומנים בתזונה, הכבד שולט מטבוליזם סינתזה ליפופרוטאין שומנים מורכב, ואיך האיברים האלה לעבוד עם מערכת העצבים המרכזית לשלוט על צריכת מזון מובן. מעניין ביו להבהיר ביולוגיה זה לאור המגיפות הנוכחיות של השמנת יתר, מחלות לב וכלי דם, סוכרת, מחלת כבד שומני לא אלכוהולי. מחקרים בתרבות ועכברים תא סיפקו את רוב הבנתנו את היחסים מכניסטית בין שומנים תזונתיים ומחלות, ו דג הזברה (Danio rerio) הם מתעוררים כמו מודל אידיאלי כדי להשלים את העבודה הזאת.

דג הזברה יש עיכול דומה (GI) איברים, מטבוליזם של שומנים, תחבורה ליפופרוטאין לבעלי חוליות גבוהות 1,2, לפתח במהירות, והם גנטיים צייתנים. בהירות אופטית של דג הזברה הזחל הופך לפשוט במחקרים vivo, particulaיתרון r עבור חקר מערכת העיכול כמו הסביבה התאית שלה (כלומר, מרה, חיידקים, איתות האנדוקרינית) היא כמעט בלתי אפשרי לבנות מודל vivo לשעבר. בהתאם, גוף מחקר המשלב את העקיבות הגנטיות conduciveness לחיות הדמיה של זחלי דג זברה עם מגוון רחב של מניפולציות תזונתיות (עתיר שומן 3,4, -cholesterol 5, ודיאטות -carbohydrate 6,7), ומודלים של מחלות לב וכלי דם 8, סוכרת 9,10, בכבד steatosis 11-13, והשמנת 14-16, הם מתעוררים, כדי לספק שורה של תובנות מטבולית.

היבט חיוני של מעבר דג הזברה זחל לתוך מחקר מטבולית הוא אופטימיזציה של טכניקות שפותחו בחיות מודל אחרות אל דג הזברה לבין ההתפתחות של מבחני רומן המנצלים את נקודות החוזק הייחודיות של דג הזברה. פרוטוקול זה מציג טכניקות שפותחו והותאמו במיוחד להאכיל דג הזברה הזחל lipiד-עשיר הארוחה, לדמיין עיבוד השומנים תזונתיים מהגוף כולו ברזולוציה subcellular, ולמדוד את צריכת המזון. חלמון עוף ביצה נבחר להלחין הארוחה עשיר שומנים בדם כפי שהוא מכיל רמות גבוהות של שומנים וכולסטרול (ליפידים להלחין ~ 58% של חלמון עוף ביצה, מתוכם ~ 5% הוא כולסטרול, 60% הם טריגליצרידים, ו -35% הם פוספוליפידים ). חלמון עוף ביצה מספק יותר שומן מאשר מזונות micropellet דג זברה מסחריים טיפוסיים (~ 15% שומנים) ויתרון שזה הזנה סטנדרטית עם אחוזים ידועים של מיני חומצות שומן ספציפיים, כמו דיאטות דג זברה וגדודי האכלה טרם טופלו על פני מעבדות 17. יתר על כן, תחליפי שומני ניאון שנקבעו חלמון הביצה לדמיין תחבורה וצבירת שומנים תזונתיים 18, מרכיבים תאיים תמונה כולל טיפות שומנים ידי ששמש הוא צבעים חיוניים כמו 3 ובאמצעות שילוב קוולנטיים לתוך שומנים מורכבים, לחקור את חילוף חומרים באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) 19 ו כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) (נתונים שלא פורסמו SAF), ולספק assay כמותיים צריכת המזון הכולל 20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקולים אלה אושרו על ידי מכון קרנגי טיפול בבעלי חיים מוסדי מדע ועדת שימוש (פרוטוקול לא. 139).

1. הכנת בעלי חיים

  1. לשמור על מבוגרים וזחלים על 28 מעלות צלזיוס על 14 שעות: 10 שעות אור: מחזור כהה. Feed מבוגרים פעמיים ביום עם הארטמיה בחינם פגז (decapsulated, הבקיעה-עישון, החל מהשעה 14 DPF) ו micropellets מסחרי.
  2. פרוטוקולים אלה מותאמים לשימוש זחלי 6-7 DPF שנאסף על ידי השרצה טבעית של רקע AB. פרוטוקולים יכולים להיות שונים עבור זחלים של גיל ורקע אחרים. אל תספק מזון אקסוגניים לפני 6 DPF.
  3. להרדים הזחלים עם Tricaine במדיה העובר (EM) (4.2 מ"ל של 4 מ"ג / מ"ל ​​לכל Tricaine EM 100 מ"ל) בטמפרטורת החדר (RT).

2. הכנת Feed חלמון ביצה ליפידים עשירי

  1. כן ולאחסן את חלמוני ביצת עוף. הפרד את החלמון ולבן של 12 ביצי תרנגולת. פינת את החלמונים, aliquot 1 מ"ל לתוך 1.5צינורות מ"ל, ולאחסן ב עד -80 ° C עד 1 לשנה (12 חלמוני יגרום ~ 80 aliquots). פינת הלבנים, לשמור אותם ולהשתמש בהם כמו להאכיל השומנים-עניים, עשירים בחלבון.
  2. כן אנלוגי שומני ניאון (ים) שיש להוסיף ל- RSS חלמון ביצה אם ארצה בכך.
    1. להשעות את שנרכש, אנלוגי שומנים פלורסנט האבקה באתנול 100% או 100% כלורופורם על 0.1 מיקרוגרם / μl (ראה הערה הבאה דנים ממסים), aliquot צינורות זכוכית אטומים, חותם עם parafilm, ולאחסן על פי הוראות היצרן. בשל אידוי מהיר של ממיסים אורגניים לא משתמשים באמצעי אחסון aliquot פחות מ ~ 400 μl עבור אחסון לטווח ארוך.
      הערה: אם אנלוגי השומנים מושעים באתנול, כמויות גדולות של אנלוגי השומנים תשמשנה כי הוא מתייבש מהר תחת N 2 מ כלורופורם. אם אנלוגי השומנים מושעה באתנול זה לא חייב להיות יבשים resuspended לפני הוספתו להאכיל ליפוזום בשלב 2.2.4, אך ריכוז אתנול הכולל לא יעלה על 0.1% בהזנת liposome כדי למנוע תופעות פיסיולוגיות בלבול הפוטנציאלי של אתנול.
    2. עבור אנלוגים חומצת שומן ניאון: כן בנפח כולל של 20 מיליליטר תחליב חלמון 5% ביצה ב EM. מאותו להכין 5 מ"ל aliquots עם ריכוז סופי של 6.4 מיקרומטר 4,4-difluoro-4-בורה-3a, 4a-diaza-s-indacene (BODIPY C 16) עבור מבחני הדמיה צריכת המזון confocal לחיות או 1 מיקרוגרם / מ"ל BODIPY C 12 הדמיה סטראו. מעבירים את הכמות הרצויה של אנלוגי השומנים פלורסנט לתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל. ייבש את השומנים תחת זרם של N 2, נזהר שלא לתקוע שומנים מתוך הצינור.
    3. מיד, resuspend ב 5 μl 100% אתנול על ידי pipetting זרם לאורך צידי הצינור, להוסיף 95 μl EM, ומערבבים היטב.
      הערה: התערובת צריכה להופיע הומוגנית; אם בצבע השומנים נשאר על הצדדים של הצינור או הנוזל מופיע clumpy, השומנים לא solubilized מלא דורש יותר אתנול. הגן על הצינור הלוך ושובמ אור ולאחסן על הקרח.
    4. עבור אנלוגי כולסטרול ניאון: להכין ריכוז סופי של כולסטרול 2.4 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב 5 מ"ל תחליב 0.5-5% חלמון ביצה ללימודי הדמיה לחיות. מעבירים את הכמות הרצויה של כולסטרול לתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל. ייבש את השומנים תחת זרם של N 2, נזהר שלא לתקוע שומנים מתוך הצינור.
    5. מיד, resuspend ב 15 μl של אתנול 100% RT ידי pipetting זרם לאורך צידי הצינור ומערבבים עם 85 μl של BSA נטול חומצה שומן RT 1% ב H 2 O. מטוהרים הגן על הצינור מן האור ולאחסן על הקרח.
  3. כן Feed Liposome חלמון הביצה.
    1. הוספת aliquot מופשר של חלמון ביצה EM צינור חרוטי 50 מ"ל. וורטקס את תערובת חלמון ביצה המדוללת במשך 1-2 דקות; התערובת צריכה להיראות אמולסיה הומוגנית.
    2. יוצקים את התערובת דרך מסננת רשת בסדר להסיר קונגלומרטים חלבון ולאסוף צינור חרוטי 50 מ"ל חדש, טרי.
    3. sonica Pulsete תערובת הביצה עם microtip מחודדת אינץ רבע (5 פעמים (5 x 1 שניות על, 1 שניות כבויות) השהיית 5-10 שניות בין כל סט; עוצמת פלט: 6 W) ב RT ליצור ליפוזומים. הגדרות צריכת חשמל sonicator הם מכשיר תלוי ולכן דורשות אופטימיזציה עבור כל מכשיר ו microtip.
      הערה: ברציפות רוק תערובת ליפוזום ב RT לשמור הומוגניות עד השימוש.
  4. מוסיפים את אנלוגי השומנים פלורסנט אל ליפוזומים חלמון ביצה, אם תרצה בכך. מיד לאחר sonication, pipet את השומנים מוכנים לתוך התערובת liposome ו מערבולת במהירות גבוהה במשך 30 שניות כדי לשלב ליפוזומים. הגן על התערובת מן האור על ידי עטיפת הצינור בנייר ולהמשיך נדנדה ב RT.

פרדיגמה האכלה 3.

  1. הכן את הזחלים עבור האכלה.
    1. לפני התחילה להאכיל, זחלי מסך פגמים מורפולוגיים ברורים שעשויות לעכב האכלה. העברת זחלים עד 60 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי או 6- או 12 גם PLAtes, להפחית EM עד למינימום, ולהחליף עם 5 מ"ל של הפתרון liposome מוכן.
    2. במידת הצורך, להעביר זחלים מלאים יאכילו אותם עד 5 מיליליטר EM ו / או 5 מיליליטר 5% חלבון ביצה ב EM ולטפל במקביל.
  2. נער בעדינות את הזחלים על כיסא נדנדה וטופח (29-31 מעלות צלזיוס ב 30 סל"ד) אורך העדכון לעודד צריכת מזון תוך המשך לגונן מפני אור אם תחליפי שומנים פלורסנט נוכחים. אם צורך הזחלים להיחשף לאור, למזער את החשיפה עם כיסוי חממת זכוכית כהה.
  3. בסוף תקופת ההאכלה, יש לשטוף את הזחלים בחופשיות השוחים EM 3 פעמים.
    הערה: הזחלים עשויים להתחיל לצרוך ליפוזומים בכל נקודה במהלך ההזנה. אם זה קריטי, כי הזחלים להתחיל האכלה בעת ובעונה אחת, מסך עבור צריכת המזון (ראה 3.4) אחרי שעה 1 של האכלה ולחזור הזחלים רק כי החלו להאכיל את התחליב חלמון ביצה כדי להשלים את העדכון.
  4. מסך הזחלים בשלב זה עבור צריכת מזון כמספר קטן אולי לא eat (בדרך כלל ~ 0-5%). בדוק את המעיים של זחלים כי כבר הרדימו או מקורר מעט על גוש מתכת על קרח כדי לקבוע אם הם האכילו: זחלים שכילו ליפוזומים יהיו מעי חשוך (איור 1).
  5. זחלי תמונה או תהליך צריכת מזון מייד. לחלופין, זחלי מקום EM הטרי לדגור על 28 ° C כדי לאפשר עיבוד מטבולית להתרחש.

4. הרכבת זחלים עבור הדמיה חיה

  1. מכין את תקשורת ההרכבה.
    1. עבור תאית מתיל 3%: להוסיף תאית מתיל 0.75 גרם ל -25 מ"ל של רתיחה ליד EM, מערבולת, רוק ב RT 2-3 ימים עד שהיא נמסה לחלוטין, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך שנים ב -20 ° C. מחזורים חוזרים של הקפאה להפשרה ב 4 ° C יסירו בועות אוויר. אחסן תאיים מתיל 3% על קרח בזמן הרכבת זחלים.
    2. לקבלת 1.2% agarose נמוכה הר: להוסיף 0.3 גרם של נמוכה להמיס agarose 25 מ"ל EM לפזר ידי הבאת לרתיחה, aliquot לתוך 2 מ"ל tubes, ולשמור על C ° 26-28 על גוש חום. aliquots שאינו בשימוש ניתן לאחסן ב RT או -20 מעלות צלזיוס, מבושל שוב במועד השימוש. הקפד כי agarose הוא מגניב מספיק כדי להתמודד לפני החשיפה כדי זחלים או שהם עשויים להיות מחוממים יתר על מידה.
  2. לקבלה-בהגדלה נמוכה, הדמיה לחיות תפוקה בינונית, מקום שקופית זכוכית על רקמה על גוש מתכת על קרח ולחכות השקופיות להתקרר. למרוח כמות נדיבה של תאית מתיל 3% (אשר נשמר על 4 מעלות צלזיוס על הקרח) לשקופית, להעביר זחל על תאית 3% מתיל, באמצעות פוקר דיג אונליין (חוט דיג בקוטר 0.41 מ"מ מודבק סוף צינור נימי זכוכית) ליצור troth לניקוז עודף EM (כך תאי מתיל לא להיות מדוללת) ומקמו את הזחלים כרצונכם.
  3. עבור לטווח קצר (<20 דק '), הדמיה חיה גבוהה הגדלה עם מטרה emersion שמן זקוף, הר הזחלים עם coverslip רזה-לשיטה.
    1. להשתמש בדבק cyanoacrylate מבוסס (הפלא) כדילצרף aa coverslip 22 מ"מ x 30 מ"מ עד קצה אחד של זכוכית שקופית. השתמש פוקר לשים קו דק של תאית מתיל 3% בשקופית הסמוכה coverslip ולהעביר זחלים לשקופית עם pipet פסטר רחב לשעמם. הסר EM עודף אז זה לא לדלל את תאית מתיל.
    2. באמצעות פוקר, מקם זחלים בעדין תאי מהתיל על צדם (בצד שמאל עד תמונה יותר של הכבד, בצד ימין למעלה כדי שזה יקלוט את כיס המרה) עם ראשיהם ליד coverslip.
    3. ספוט דבק מגע בפינות של coverslip השני ומניחים בעדינות קצה אחד של coverslip על coverslip רכוב והשני בשקופית, לגשר על הזחלים. יש להיזהר שלא להפעיל לחץ עודף במהלך שלב זה או במטרה תוך הדמיה כך הזחלים נשארים ללא פגע.
  4. עבור לטווח ארוך, הדמיה בהגדלה גבוהה עם טבילה אובייקטיבית זקופה, הר זחלי agarose. הוספת זחל aliquot קטן של נמוך להמס 1.2% agarose מכן להעביר אתזחל בנפח קטן של agarose כדי בצלחת פטרי.
    1. במהירות למקם את הזחלים עם פוקר לפני agarose מתמצק. אפשר agarose להתייבש במשך 2-3 דקות ומכסים את agarose מלא עם EM טריים למנוע התייבשותו.
  5. עבור לטווח ארוך, הדמיה בהגדלה גבוהה עם מטרה הפוכה, הר זחלים על צלחת זכוכית התחתונה ב agarose.
    1. מגניב גוש מתכת על קרח. מניח את התבנית על גוש המתכת המופרד על ידי רקמות כדי למנוע קירור יתר והקפאת זחל. העברת זחל כדי בצלחת ולהסיר את EM ידי פתילה עם רקמה.
    2. מניחים ירידה של 28 ° C נמוכה להמיס agarose (1.2%) על גבי הזחל ומיד למקם עם פוקר (בצד שמאל למטה התמונה הטובה ביותר בכבד, בצד ימין למטה כדי שזה יקלוט את כיס המרה). סר צלחת מהגוש הקר, לאפשר לו להתייבש במשך 2-3 דקות, ולהוסיף נפח מספיק של EM הטרי כדי לכסות את agarose (~ 2-5 מיליליטר).

צריכת מזון 5.assay

  1. בסוף עדכון ליפוזום חלמון ביצה המכיל 6.4 מיקרומטר BODIPY C 16, בריכת מינימום של 10 זחלים שטף בצינור מ"ל פלסטיק 1.5 או 2, להסיר EM, ולהצמיד ההקפאה. הדגימות ניתן לאחסן ב -80 ° C מוגן מפני אור במשך כמה חודשים.
    הערה: במידת האפשר, לאסוף משכפל מרובים. חשוב לאסוף זחלים יאכילו אותם בשלב זה לנרמל עבור קרינת שומני רקע (רצוי זחלים של אותו מחזור הרבייה משמשים).
  2. בצע מיצוי שומנים בליי-דייר שונה 3,21.
    1. הוספת 100 חיץ המגון μl (20 מ"מ טריס-Cl, 1 mM EDTA) המדגם על הקרח (H מטוהרים לחילופין 2 O יכול לשמש). Homogenize על קרח עם sonicator microtip (5 שניות כולל: שניות 1 על 1 שניות כבויות). בדקו זחלים כי הם לגמרי הומוגני; אם לא, חזור. מעבירים צינור תרבות זכוכית הפנויה מ"ל 13 (צינורות זכוכית אחרים עשויים לשמש).
      הערה: כלורופורם הוא מסוכן; לבצע את כל לשעבר עוקב השומניםצעדי מתיחה ב RT במנדף כימי.
    2. עבור כל 100 μl של חיץ המגון בשימוש, להוסיף 375 μl של 1: 2 (כלורופורם: מתנול). שניות וורטקס 30-60, דגירה 10 דקות, להוסיף 125 μl של כלורופורם לכל 100 חיץ המגון μl בשימוש, ו מערבולת 30 שניות.
    3. להוסיף 125 μl של 200 מ"מ טריס pH 7.5 ל -100 חיץ המגון μl בשימוש, מערבולת 30 שניות, ו צנטריפוגות (2,000 x גרם, 5 דקות, RT, מוגן מפני אור). מוציאים בזהירות את דגימות מתוך צנטריפוגה. הם יופרדו לשני שלבים: שלב עליון הוא מימי, ממשק של פסולת זחל, ושלב אורגני נמוך (מכיל שומנים).
    4. עם טפטפת זכוכית נקי לאסוף התחתון, בשלב אורגני ולהעביר אותו לתוך צינור זכוכית נקי 13 מ"ל.
      הערה: ישמור על עצמך כדי למנוע את השלב מהימי ופסולת זחל על הממשק; אם הזיהום מתרחש, חזור על שלב צנטריפוגה נזכרים בו. מחק את השלב העליון, מימית; זה עשוי להיות מועיל כדי להסיר ולסלק זושלב לפני האיסוף בשלב האורגני. המדגם יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1.
    5. יבש את השלב האורגני תחת ואקום (0.12 ATM) תוך הגנה מפני אור. אל תמשיכו לייבש את דגימות לאחר הנוזלים התאדו כפי שהיא תפחית מסיסות שומנים. Resuspend את השומנים 2: 1 (כלורופורם: מתנול) ולאחסן על הקרח. ההיקף האופטימלי של כלורופורם: פתרון מתנול תלוי בשיטת הזיהוי המשמשת; להתחיל נמוכה וממשיכים לדלל לפי הצורך. הנחיה כללית היא להשתמש 10 μl למשך 10 זחלים נקוו.
  3. ספוט הכרכים המדגמים במרווחים מחולקים באופן שווה על צלחת TLC מתועלת ולסרוק את הצלחת עם סורק ליזר בשימוש שיגרתי עבור הדמית biomolecular (למשל, קורא צלחת ניאון). עבור אנלוגים השומנים פלורסנט נכלל ברשימת החומרים שיש להם מקסימום עירור מן 500-650 ננומטר מקסימום פליטה 510-665 ננומטר, שימוש בלייזר 488 ננומטר עם אוסף פליטה ב 520 ננומטר.
    1. לכמת את הקרינה הכוללת של כל נקודה עם תוכנת הדמיה.
      הערה: נכון עבור טבע קרינת שומנים רקעו על ידי הפחתת הקרינה של זיווג, דגימות זחל תאכלנה אותם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאשר מוזן על כיסא נדנדה ב 29-31 מעלות צלזיוס, רוב הזחלים בריאים (≥95%) יאכל בתוך השעה 1. עם רב תחליב חלמון ביצה, מעי הזחל מכהה בצבע. מאוד מעיים כהים ניתן להבחין ב -2 שעות (איור 1). אם זחלים הם יאכילו אותם או לא מוזנים, מעי שרידים ברור. זחלים נמאסים ביצת תערוכה לבנה לומן מעי נפוח שאינו להכהות בצבע.

figure-results-1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הטכניקות המתוארות כאן לאפשר לחוקרים לטיפול דג זברת זחל עם הזנת שומנים עשירים, לדמיין עיבוד שומנים תזונתי זחלים חיים, ולכמת את צריכת מזון זחל. כדי להבטיח הצלחה, תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן כמה שלבים קריטיים. ביצי תרנגולת מסחריות להשתנות; אנו למזער השתנות פוטנציאל לבצע את כל מבחני על ביצים אורגניות מתרנגולות כלוב ללא שלא היה מועשר עבור חומצות שומן אומגה -3. שיעורי האכלה עשויים להיות נמוכים בדגים מתחת לגיל 6 DPF עם יתרת אספקת אנרגית חלמון אנדוגני, דגים בריאים, או דג עם מוטציות התפתח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים למנג-צ'יה שן על התמונות, לג'ניפר אנדרסון על ההערות המועילות על כתב היד, ולחברי מעבדת פרבר על תרומתם לפיתוח הטכניקות האלה. מחקר זה מומן על ידי RO1DK093399 פרסי NIDDK-NIH (S.A.F.), RO1GM63904 (קונסורציום הגנומיקה הפונקציונלית של דג הזברה: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F) ו-F32DK096786 (J.P.O). תוכן זה הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של ה-NIH. תמיכה נוספת ניתנה על ידי קרן הצדקה ע"ש ג. הרולד וליילה י. מאת'רס למעבדה של S.A.F וקרן קרנגי למדע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
טריקאין (מלח אתיל 3-אמינובנזואט מתאןסולופנט)סיגמא-אולדריץ'A5040-25Gהרדמה לזחל דג זברה
ביצי עוףN/AN/Aביצים אורגניות, ללא כלובים, לא מועשרות לחומצות שומן omege-3
מעבד אולטרסאונד 3000 סוניקטורMisonix, Inc.S-3000להכנת ליפוזומי חלמון ביצה
מארז אקוסטי SonaboxMisonix, Inc.432Bלהכנת ליפוזומים של חלמון ביצה
1/8 אינץ' מיקרו-קצה מחודדMisonix, Inc.419להכנת ליפוזומי חלמון ביצה
בקבוקוני ענבר (4 מ"ל, זכוכית)National Scientific13-425אחסון שומנים; כולל בקבוקונים, מכסים פתוחים ומחיצות
כובע Incu-Shaker Mini בנצ'מרק1222U12שייקר דגירה להזנות
BODIPY FL C16 Thermo Fisher ScientificD3821אנלוגי שומנים פלואורסצנטיים; (4,4-דיפלואורו-5,7-דימתיל-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-אינדצן-3-חומצה הקסדקנואית)
BODIPY FL C12 Thermo Fisher ScientificD3822אנלוגי שומנים פלואורסצנטיים; (4,4-דיפלואורו-5,7-דימתיל-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-אינדצן-3-חומצה דודקנואית)
BODIPY FL C5 Thermo Fisher ScientificD3834אנלוגי שומנים פלואורסצנטיים; (4,4-דיפלואורו-5,7-דימתיל-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-אינדצן-3-חומצה פנטנואית)
BODIPY FL C5Thermo Fisher ScientificD2183אנלוגי שומנים פלואורסצנטיים; (4,4-דיפלואורו-5,7-דימתיל-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-חומצה אינדצנית-3-פרופיונית)
כולסטרול TopFluor אוונטי פולאר ליפידים בע"מ810255אנלוגי שומנים פלואורסצנטיים; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol
ללא חומצות שומן BSASigma-AldrichA0281-1Gעבור TopFluor מסיס כולסטרול
מתיל תאיתSigma-AldrichM0387אמצעי הרכבה להדמיית זחלים חיה; 75 x 25 x 1 מ"מ
אגרוז נמס נמוךThermo Fisher ScientificBP165-25אמצעי הרכבה לזחל חי דימות; 22 x 30
שקופיות מיקרוסקופ VWR VWR 16004-422הרכבה של זחלים להדמיה חיה
Coverslips כיסוי זכוכית12-544Aזחלי הרכבה להדמיה חיה
דבק סופרLoctiteLOC01-30379זחלי הרכבה להדמיה חיה
FluoroDish (צלחת תחתית זכוכית)World Precision Instruments, Inc. FD35-100זחלי הרכבה להדמיה חיה; צלחת 35 מ"מ, זכוכית 23 מ"מ, עובי זכוכית 0.17 מ"מ   
מיקרוסקופ קונפוקליLeica MicrosytemsSP-2, מיקרוסקופ SP-5להדמיה חיה בהגדלה גבוהה
סטריאוסקופNikonSM21500מיקרוסקופ להדמיה חיה בהגדלה נמוכה
צינורות תרבית זכוכית Kimble73500-13100מיצוי שומנים; (13 x 100 מ"מ; 13 מ"ל)
Savant SpeedVac Plus ThermoQuestSC210Aמיצוי שומנים
צלחות TLC מתועלות WhatmanScientificWC4855-821בדיקת צריכת מזון; LK5D סיליקה ג'ל 150 A, 20 x 20 ס"מ, עובי 250 אום;
לוחות TLC מתוקשרים שהופסקוAnaltech, Inc.66911בדיקת צריכת מזון; החלפה ישירה לצלחות Whatman Scientific TLC
טייפון 9410 מצב משתנה ImagerGE Healthcare9410קורא צלחות פלורסנט לבדיקת צריכת מזון
תוכנת ImageQuant GEHealthcare29000605ניתוח צריכת מזון מבחן
5 3/4' פיפטות פסטר חד פעמיות בורוסיליקט רחבות     Kimble63A53WTהעברת זחלים

מקורות

  1. Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).
  2. Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
  3. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
  4. Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
  5. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
  6. Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
  7. Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485(2013).
  8. Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
  9. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  10. Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
  11. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  12. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
  13. Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
  14. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21(2010).
  15. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474(2012).
  16. Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
  17. Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
  18. Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
  19. Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
  20. Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
  21. Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
  22. Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
  23. Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
  24. Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מטבוליזם של ליפידיםאנלוגים פלואורסצנטיים של ליפידיםליפוזומים מחלמון ביצהכרומטוגרפיה בשכבה דקהכימות פלואורסצנציהעיבוד ליפידים תזונתיים
עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.