מאמר שיטה

הדמיה של שינוי צורה של התא ותנועתו ב תסיסנית Gastrulation שימוש Reporter DE-cadherin זבובים טרנסגניים

6.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54764

⸱

29 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  , 
1Biotechnology and Genetic Engineering Department, Jahangirnagar University, 2JT Biohistory Research Hall, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 5Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים הליך ללכידת תמונות חיות של גסטרולציה של דרוזופילה. זה אפשר לנו להבין טוב יותר את ההתכווצות האפיקלית הכרוכה בהתפתחות מוקדמת ולנתח עוד יותר מנגנונים השולטים בתנועות התאים במהלך שינוי מבנה הרקמה.

תקציר

Gastrulation הוא הסט הראשון של אירועים דינמיים מורפולוגית המתרחשים במהלך ההתפתחות העוברית של בעלי חיים רבים-תאיים כגון תסיסנית. שינוי מורפולוגי זו מוכרת גם בשם אפיתל המעבר mesenchymal (EMT). חוסר ויסות של EMT קשורה סיסטיק ו גרורות סרטניות. יש ראיות המתעוררים כי EMT נשלטת על ידי מספר מנגנונים מולקולריים. כמו גנים מפתח כגון, רבים השולטים התכווצות הפסגה גם ידועים להיות מרכיב חשוב EMT ציין בהתפשטות גרורות סרטניות. כמו EMT במהלך gastrulation תסיסנית, תאי אפיתל יכולים להיגרם לשנות את צורתם ואת לתכנת מחדש להפנות תא גורל כלפי סוגי תאים שונים אחרים. כאן אנו מספקים שיטת הדמיה חזקה של gastrulation תסיסנית כדי assay את החניכה של תנועות הסלולר המוךפו"גנטי שהולכות וזיהוי תאי גורל בשלב זה של התפתחות עוברית. באמצעות שיטה זו, אנו מזהים גell התארגנות בזמן gastrulation ולהפגין את החשיבות של התכווצות הפסגה במהלך gastrulation באמצעות GFP שכותרתו DE-cadherin.

מבוא

Gastrulation הוא הסט הראשון של אירועים דינמי מורפולוגית המתרחשים במהלך ההתפתחות העוברית של בעלי חיים רב-תאיים כגון תסיסנית 1,2. מעניין, המתעוררים הראיות עולה כי תהליך זה מוסדר באמצעות משחק הגומלין בין מנגנונים מכניים ומולקולרית 3. יתר על כן, אפיתל המעבר mesenchymal (EMT), שהוא תהליך מכריע gastrulation, הוא מעורב גם בתהליכי מחלות אנושיות כגון גרורות סרטן 4-8. כמו גנים כאלה, רבים השולטים התכווצות פסגה גם ידועים כגורמי מפתח EMT שנצפתה בסרטן גרור 9. לפיכך, מועקה הפסגה בעת gastrulation הוא מודל מצוין לחקור את מנגנוני ויסות הנ"ל כדי לשפר את ההבנה שלנו של גרורות סרטניות. היתרון של שיטה זו הוא כי אנו יכולים לצפות תנועת התא בעת gastrulation בזמן אמת ולכן, אנחנו נהיהמסוגל להקרין גנים המעורבים gastrulation וכן גרורות סרטניות.

למרות יחסית ידוע, תא אל התא הדבק הוא חשב לשחק תפקיד מרכזי התכווצות פסגת 1. גנטיקת תסיסנית מתאימה גם לחקירות ברמת התא בודדות לחקור מנגנונים מולקולריים רגולטוריות. מודל זה יאפשר לנו לחשוף את החשיבות של התכווצות הפסגה במהלך gastrulation. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש מסך גנים המעורבים בהתפשטות גרורות סרטניות. תמונות חיות לכידות של gastrulation תסיסנית נוספת אפשרו לנו להבין ביתר פירוט את המנגנונים המולקולריים השולטים התארגנות רקמות. בזאת, אנו מספקים תיאור מקיף של שיטה פשוטה כדי להשיג זאת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: הזבובים המהונדסים נעשו שימוש במחקר זה כולל את הפעולות הבאות: DE-CAD :: GFP 10.

1. הכנת הצלחת האפלה

  1. הכינו תערובת של אגר 12.5 גרם, 125 מ"ל 100% מיץ תפוחים זמינים מסחרית, 12.5 גלוקוז g, ו- 375 מ"ל H 2 O. מחממים את התערובת במיקרוגל ויוצקים אותו לתוך צלחת תרבית תאים 3 ס"מ. אחסן את התערובת על 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
  2. לאחר הכנת צלחת התפוח, להוסיף שכבה דקה של ממרח שמרים לש ​​על גבי זה כדי לאפשר הזבובים להטיל ביצים.

2. הכנת עובר ופרוטוקול הדמיה חיה

  1. מניחים כ 50 זבובים (25 זכרים ו -25 נקבות) בבקבוק להזדווג ובהמשך להטיל ביצים לילה על צלחת תפוח מכוסה שמרים לשה. הגדר את צלחת מיץ תפוחים בפתחו של הבקבוק. שמור את הבקבוק באינקובטור. עוטפים את בקבוקי פלסטיק תסיסנית המניות ברדיד אלומיניום כדי להנחות הדואר טס להטיל יותר ביצים.
  2. למחרת בבוקר, להחליף את צלחת מיץ תפוחים הישן בחדש.
  3. בואו הזבובים להטיל ביצים במשך 3 עד 4 שעות על ידי לפפה את הבקבוק בנייר אלומיניום.
  4. שלוש עד ארבע שעות מאוחר יותר, לאסוף את העוברים בתוך מסננת העובר מהצלחת מיץ תפוחים באמצעות רע מברשת או כותנה ולשטוף אותם עם PBS. לשטוף את העוברים 2 עד 3 פעמים יותר עם PBS במנות תרבות 12 גם.
  5. Dechorionate את העוברים עם אקונומיקה 50% במשך 5 דקות במנות תרבות 12 גם.
  6. בעקבות תהליך dechorionation, לשטוף את העוברים 2 עד 3 פעמים יותר עם PBS.
  7. מעבירים את העוברים על צלחת תרבית תאים 3 ס"מ המכיל הבמה PBS ובחר 5 עוברים תחת המיקרוסקופ מבוסס על רמת שקיפות גבולותיהן. פיפטה עובר המבוים באמצעות קצה פיפטה 200 μL.
  8. בשלב הבא, במקום שני עוברים שנבחרו על coverslip זכוכית, ולהסיר PBS העודף בנייר טישו מעוות דק. אוריינט עובר בצד הגבה עלאת coverslip באמצעות נייר טישו מעוות דק. לאחר מכן, לצרף את עוברי coverslip הזכוכית עם גריז סיליקון באמצעות מחט דקה ונייר דק מעווה.
  9. הוסף טיפה קטנה של שמן halocarbon 700 על העוברים ומניחים את coverslip המכיל את העוברים במהופך בשקופית מסוכסך, משאיר קצת מקום בתחתית המגלשה.
  10. בדוק את העוברים באמצעות מערכת הדמיה confocal, לייזר ארגון / 488, אובייקטיבי טבילה-שמן (63X).
    הערה: זיהוי העובר בשלב ההתפתחותי המתאים חשובה ללכוד תמונות של אירוע gastrulation. בתנאים אלה, יש למלא אחר כמעט כל העוברים להתפתח בצורה תקינה עד לשלב לפחות 14. העובר נתח יכול להיות מתורבת להמשיך לפתח כמבוגר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן, אנו מציגים את אירועי gastrulation של עובר תסיסנית סקירה כללית של הליך הכנת עובר (איור 1). קרום התא מסומנים באמצעות DE-cadherin :: GFP ו הדמיה חיה של תנועות תא מתבצע בעת gastrulation תסיסנית (איור 2). מאז זבובי DE-cadherin GFP מאפשרים לנו לדמיין צמתים דבקות תא, אנו מסוגלים לעקוב אחר צורת תא פסגה ותנועות באמצעות מערכת זו. יתרה מכך, מערכת זו גם מאפשרת לנו להתחקות אחר דפוסי ביטוי DE-cadherin אנדוגני.

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות שדיווחנו בעבר על הליך דומה לצילום תמונות חיות של תהליך הקיבה בדרוזופילה1, השיטה שאנו מתארים כאן מפורטת וקלה למעקב אחר ביטוי קדרין אנדוגני ולכן היא שימושית למדי לסריקה גנטית של גורמי מפתח המעורבים בקיבה. כדי למקסם את ההצלחה בהליך הדמיה זה, חיוני להשתמש בשקופית שקועה. לחץ מכני גורם לפעמים למוות עוברי. לכן, חשוב גם לטפל בעוברים בעדינות ככל האפשר מכיוון שכל לחץ מכני עלול לשבש את תהליך הקיבה העוברית. שימוש בכמות הנכונה של שומן במהלך קיבוע העובר ישפר עוד יותר את תוצאות הליך ההדמיה החיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי קרן אסטלס לחקר הפרעות מטבוליות (HT), קרן טקדה למדע (HT) והתוכנית הנתמכת על ידי MEXT עבור קרן המחקר האסטרטגי באוניברסיטאות פרטיות (HT).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שמן Halocarbon 700SigmaMKBH 5726
גריז ואקום סיליקוןבקמן335148
כיסוי זכוכית זכוכית מטסונאמימס'1 24 - 36 מ"מ
כוכב עוברקורנינג קורנינג3477
בקבוקי מלאי מפלסטיק דרוזופילהHitecMKC-100
DE-Cadherin זבוביREF (10)
עובי דפיקה

מקורות

  1. Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
  2. Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
  3. Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
  4. Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).
  5. Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
  6. Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
  7. Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
  8. Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
  9. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
  10. Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GFP

מאמרים קשורים