יש צורך בשיטות בידוד חדשות של תאי אנדותל ראשוניים מכלי הדם. פרוטוקול זה מתאר טכניקה חדשה שהופכת לחלוטין את כלי הדם המעניינים, וחושפת רק את צד האנדותל לעיכול אנזימטי. ניתן להשתמש בתרבית תאי האנדותל הטהורה המתקבלת לחקר מחלות לב וכלי דם, מודלים של מחלות ואנגיוגנזה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחלות לב וכלי דם נחקרות הן ברפואה אנושית והן ברפואה וטרינרית. תאי אנדותל שימשו רבות כמודל מבחנה לחקר כלי דם, אנגיוגנזה (גידול) וטרשת עורקים. הסטנדרט הנוכחי למחקר במבחנה על תאי אנדותל אנושיים (ECs) הוא השימוש בתאי אנדותל וריד טבורי אנושיים (HUVECs) ותאי אנדותל עורק טבור אנושיים (HUAECs). למחקר אנדותל כלבים, רק קו תאים אחד (CnAOEC) זמין, שמקורו באנדותל אבי העורקים של הכלבים. למרות שכרגע לא לגמרי מובן, יש הבדל בין ECs שמקורם בעורקים או בוורידים. לגישה ישירה יותר למחקרי פונקציונליות במבחנה על ECs, אנו מתארים שיטה חדשה לבידוד תאי אנדותל ראשוניים של כלבים (CaPECs) ממגוון כלי דם. טכניקה זו מפחיתה את הסיכוי לזיהום בתאים הגדלים במהירות כגון פיברובלסטים ותאי שריר חלק, בעיה הנפוצה בשיטות בידוד סטנדרטיות כגון שטיפת הכלי בתמיסות אנזימטיות או טחינת הכלי לפני עיכול הרקמה המכילה את כל התאים. הטכניקה שתיארנו הייתה מותאמת למודל הכלבים, אך ניתן להשתמש בה בקלות במינים אחרים כמו בני אדם.
מבוא
כלבים משמשים כמודל חיה גדול למחקר מחלות לב וכלי דם וכן עלול לסבול מולדת (גנטי) מומים בכלי דם 1, 2. כדי לחקור מחלות אלה שורות תאים מסחריות אנדותל משמשות לעתים קרובות כדי להעריך תא האנדותל פונקציונלי (EC). לכלבים יש קו תא האנדותל מסחרי אחד זמין (CnAOEC), נגזר האאורטה כלבים. שורת תאים זה משמשת בעיקר במחקרים כשליטה נורמלית ECS 3-5. במחקר לב וכלי דם אדם שורות תאי אנדותל הנפוץ ביותר הם אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs) ותאי האנדותל עורקים אדם טבורים (HUAECs) נגזרים ורידים ועורקים כבל אדם טבור, בהתאמה. HUVECs שמש כתקן זהב במחקר וסקולרית מאז 1980 6. הם נחשבים מערכת המודל הקלסית ללמוד תפקוד האנדותל ו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אתיקת הצהרה: כלי דם השתמשו במחקר זה נבצרו כחומר עודף המתקבל גוויות כלבים טריות (n = 4) מכלבים בריאים מורדמים למחקר קשור אחרת (מדיניות האוניברסיטה 3R). כלי הדם סוטה (shunts portosystemic התוך extrahepatic, n = 1 כל אחד) נבצרו שלאחר המוות לאחר הסכמה מדעת של בעלי מכלבים בפני מרפאת אוניברסיטת עבור חיות של אוניברסיטת אוטרכט.
1. ניתוק והתרבות של תאים האנדותל לכלבים ראשיים
- טרום מעיל 6-גם צלחות עם 2 מ"ל / גם 0.5% w / v ג'לטין ולהשאיר למשך 2 שעות באינקובטור עם אווירה humidifi....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כלי דם שונים היו נתונים בהצלחת פרוטוקול הבידוד המתואר (תרשים 2). אפשר היה לנתח והפוך אבי העורקים, הווריד הנבוב, פורטה הנבוב, ואת העורקים הכליליים מכלבים בריאים (כל כלי מכל כלב, n = 4). עם אותה ECS הגישה בודדה שני shunts portosystemic המולד (extrahepatic ו intrahepatic, n = 1 כל אחד). למרות אבי העורקים היה הפוך בקלות, מגזרים אבי העורקים החזי היו יותר מאתגר מאשר אבי העורקים בבטן. בשנת פרקי חזה יש האאורטה רב העורקים צלעי הסתעפות ממנו,.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקרי ההתמקדות כלבית ECS הקו העיקרי CnAOEC משמש מודל השושלות האנדותל של הכלב 3, 12, 13. במחקרים בבני אדם, תרבות HUVEC עדיין נחשבה תקן הזהב. ברור, התמקדות רק על ECS נגזרה חבל טבור היא הגבלת משרד במחקר לב וכלי דם. יש לתאי אנדותל דפוס ביטוי גנים ספציפיים קביעת מפרט arteriovenous. על מנת להסביר את ההבדלים הללו בכלי לאחר לידה אנו מציגים שיטת בידוד הרומן הזה מבוסס על המיקום האנטומי הספציפי של תאי אנדותל. השיטות הנפוצות לבידוד EC העיקרי הן שטיפת הספינה עם פתרון אנזים או וקוצצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים מבקשים להודות להנס דה גראף ותומאס ויננדאל על עזרתם הטכנית בטיפוח ה-ECs.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קולגנאז סוג II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| מדיום גידול תאי אנדותל כלבים | יישומי תאים | Cn211-500 | |
| CnAOECs | יישומי תאים | Cn304-05 | |
| סרום עגל עוברי (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| ערכת סינתזה | iScript Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR ירוק סופר מיקס | Bio-Rad | 170-8886 | |
| הקפאת תאי התאוששות בינוני | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | שמור על קרח לפני השימוש |
| מיכל הקפאה, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| מספריים כירורגיים (מיונז או מצנבאום) | B. Braun Medical | BC555R | |
| מלקחיים נגד יתושים | B. Braun Medical | FB440R | |
| מלקחיים נגד יתושים מעוקלים | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| תא ספירה אוטומטי | Bio-Rad | 145-0102 | |
| שקופיות ספירה, תא כפול | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | להפשיר לאט על קרח |
| ומיקרו;-שקופית אנגיוגנזה | Ibidi | 81501 | |
| גידול אנדותל בינוני | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | לונזה | CC-4176 |
מקורות
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
