יש צורך בשיטות בידוד חדשות של תאי אנדותל ראשוניים מכלי הדם. פרוטוקול זה מתאר טכניקה חדשה שהופכת לחלוטין את כלי הדם המעניינים, וחושפת רק את צד האנדותל לעיכול אנזימטי. ניתן להשתמש בתרבית תאי האנדותל הטהורה המתקבלת לחקר מחלות לב וכלי דם, מודלים של מחלות ואנגיוגנזה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחלות לב וכלי דם נחקרות הן ברפואה אנושית והן ברפואה וטרינרית. תאי אנדותל שימשו רבות כמודל מבחנה לחקר כלי דם, אנגיוגנזה (גידול) וטרשת עורקים. הסטנדרט הנוכחי למחקר במבחנה על תאי אנדותל אנושיים (ECs) הוא השימוש בתאי אנדותל וריד טבורי אנושיים (HUVECs) ותאי אנדותל עורק טבור אנושיים (HUAECs). למחקר אנדותל כלבים, רק קו תאים אחד (CnAOEC) זמין, שמקורו באנדותל אבי העורקים של הכלבים. למרות שכרגע לא לגמרי מובן, יש הבדל בין ECs שמקורם בעורקים או בוורידים. לגישה ישירה יותר למחקרי פונקציונליות במבחנה על ECs, אנו מתארים שיטה חדשה לבידוד תאי אנדותל ראשוניים של כלבים (CaPECs) ממגוון כלי דם. טכניקה זו מפחיתה את הסיכוי לזיהום בתאים הגדלים במהירות כגון פיברובלסטים ותאי שריר חלק, בעיה הנפוצה בשיטות בידוד סטנדרטיות כגון שטיפת הכלי בתמיסות אנזימטיות או טחינת הכלי לפני עיכול הרקמה המכילה את כל התאים. הטכניקה שתיארנו הייתה מותאמת למודל הכלבים, אך ניתן להשתמש בה בקלות במינים אחרים כמו בני אדם.
מבוא
כלבים משמשים כמודל חיה גדול למחקר מחלות לב וכלי דם וכן עלול לסבול מולדת (גנטי) מומים בכלי דם 1, 2. כדי לחקור מחלות אלה שורות תאים מסחריות אנדותל משמשות לעתים קרובות כדי להעריך תא האנדותל פונקציונלי (EC). לכלבים יש קו תא האנדותל מסחרי אחד זמין (CnAOEC), נגזר האאורטה כלבים. שורת תאים זה משמשת בעיקר במחקרים כשליטה נורמלית ECS 3-5. במחקר לב וכלי דם אדם שורות תאי אנדותל הנפוץ ביותר הם אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs) ותאי האנדותל עורקים אדם טבורים (HUAECs) נגזרים ורידים ועורקים כבל אדם טבור, בהתאמה. HUVECs שמש כתקן זהב במחקר וסקולרית מאז 1980 6. הם נחשבים מערכת המודל הקלסית ללמוד תפקוד האנדותל והתאמת מחלה. תאי האנדותל מבודדים כלי דם שונים להשתנות appearancדואר ופונקציונליות בשל רקע גנטי וחשיפה במיקרו-סביבה של 7. בנוסף, HUVECs ו HUAECs נגזרות חבל הטבור, מבנה כלי הדם התפתחותי שעלול לא לחקות באופן מלא כלי דם בוגרים ביחס לתנאי הם נחשפים ותגובה למחלות. לפיכך, תרגום תוצאות שנמצאו HUVECs ו HUAECs למחלות לב וכלי דם בכלל אינו מספק.
כאשר לומד הסתגלות והתנהגות של ECS המבוגרת, ECS העיקרי מהספינה של ריבית צריך לשמש גישה ישירה יותר. כדי לבודד תאים אלה, מספר שיטות דווחו. שיטה שתואר נרחב, אשר משמש גם HUVECs, מוחקת את הספינה עם פתרון עיכול אנזימטי 8. זה לעתים קרובות תוצאות זיהום עם הלא-ECS כגון תאי שריר חלק פיברובלסטים 9. שיטה נוספת בשימוש תדיר לבידוד היא עיכול אנזימטי של רקמת כלי הטחונה ואחריו fluorescence-תא מיון מופעל (FACS) מבוסס על אשכול סמן תא האנדותל של בידול (CD) 31 7, 8. FACS מיון תרבית תאים עוקבות דורש כמויות גדולות יחסית של תאים, ולכן הוא לא מתאים הבידוד של האנדותל מכלי דם קטנים. לפיכך, אנו שמטרתה לפתח שיטה חזקה חדשה לבידוד אוכלוסיית תא האנדותל טהורה מכלי דם כלבים שונים עם טוהר גבוה. כדי לבדוק את יעילות שיטת הבידוד החדשה, אנחנו מבודדים וקבלנו תא האנדותל הראשי כלב טהור (CaPEC) תרבויות מן עורקי כלבים שונים ורידים, גדולים וקטנים כאחד. שיטה זו גם מאפשרת התרבות של תאי אנדותל שמקורם חולה ו / או כלי סוטה כגון shunts portosystemic תוך או חוץ-כבדית מולד, מחלה נפוצה אצל כלבים 2. השיטה מאפשרת הבידוד של תאים מסוגים רלוונטיים נוספים של אותו הכלי כמו תאי שריר חלק בכלי דם מאחר שרוב הכולים נשאר intלפעול במהלך ההליך.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אתיקת הצהרה: כלי דם השתמשו במחקר זה נבצרו כחומר עודף המתקבל גוויות כלבים טריות (n = 4) מכלבים בריאים מורדמים למחקר קשור אחרת (מדיניות האוניברסיטה 3R). כלי הדם סוטה (shunts portosystemic התוך extrahepatic, n = 1 כל אחד) נבצרו שלאחר המוות לאחר הסכמה מדעת של בעלי מכלבים בפני מרפאת אוניברסיטת עבור חיות של אוניברסיטת אוטרכט.
1. ניתוק והתרבות של תאים האנדותל לכלבים ראשיים
- טרום מעיל 6-גם צלחות עם 2 מ"ל / גם 0.5% w / v ג'לטין ולהשאיר למשך 2 שעות באינקובטור עם אווירה humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. סור פתרון ג'לטין עודף לפני זריעת התאים הראשוניים.
- בסביבה נקיה מחיידקים, להסיר את כלי הדם (ים) של עניין (למשל, אב עורקים, וריד נבוב, נבוב פורטה) מתוך (איור 1 א) פגר כלב טרי. לשמור על האנטומיה של מערכת כליעל ידי הצבת מלקחיים ישרים בשני הקצוות של כלי השיט של עניין. הימנע מניפולציה מיותרת של הרקמה עם מלקחיים כדי למנוע נזק לתאי אנדותל.
- חותך את הכלי המהודק בשני הקצוות עם מספרי כירורגיות ומסיר את הגופה. תחבורה תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS) על קרח.
הערה: כלי באורך של כ -5 סנטימטר היא מועדף עבור הליך זה, אבל אלה המודדים 1 סנטימטר גם יספקו מספיק תאים לתרבות.
- חותך את הכלי המהודק בשני הקצוות עם מספרי כירורגיות ומסיר את הגופה. תחבורה תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS) על קרח.
- מעביר את כלי הדם כדי בצלחת פטרי המלאה HBSS קר כקרח. בעזרת מספרי כירורגיות, להסיר את כל רקמת שומן חסיד מהחלק החיצוני של הספינה, שמירה על הכלי עצמו ללא פגע (איור 1 ב). ודא הכלי נראה בבירור בכל העת כאשר חיתוך: מסיט הצידה את הרקמה שמסביב עם מהדק או מלקחיים עבור תצוגה אופטימלית.
- סגור את כל הסניפים של כלי השיט עם ליגטורה (למשל, polyglactin 3-0) ובהמשך להסיר אותםעם מספריים כירורגיות או אזמל.
- בזהירות להזין סוף כלי עם מלקחי יתוש מעוקלים הלסטד, מהדק את קצה המלקחיים בקצה השני של הספינה ולאחר מכן לחזור בו, היפוך הכלי לאט עד שהוא לגמרי מבפנים החוצה (איור 1 ג-ז). מבחוץ עכשיו מורכב של שכבת תא האנדותל. אם כל קושי הוא נתקל על היפוך הכלי, לצלול HBSS שוב כדי להפחית את החיכוך.
- מניחים התפרים הארנק מיתרים בשני קצותיו של כלי השיט כדי לסגור אותו לחלוטין כדי למנוע חשיפה של כל רקמת כלי הדם הלא-אנדותל לנוהל העיכול (1H איור). השתמש הקצוות ליגטורה לתפעל את הכלי ההפוך.
- אם עיכול והתרבות מתבצע מאוחר יותר, cryopreserve הספינה ההפוכה לפני פרוטוקול העיכול (שלב 1.7).
- מניח את הכלי ההפוך בתוך cryovial ולמלא עם תרבית תאי הקפאה בינונית. להקפיא עד -80 ° C באמצעות שיתוף הקפאהntainer. חנות ב -80 ° C אם כלי ישמשו בתוך שבוע. עבור אחסון לטווח ארוך, במקום cryovials ב -180 מעלות צלזיוס. בעת ביצוע הבידוד EC, להפשיר את cryovials במהירות באמבט מים (37 מעלות צלזיוס) ומכניסים מיד HBSS קר כקרח. המשך כמצוין 1.7.
הערה: קח בחשבון כי התשואה הכוללת של ECS לאחר הבידוד תהיה נמוכה כתוצאה מאובדן כדאיות במהלך תהליך ההקפאה.
- מניח את הכלי ההפוך בתוך cryovial ולמלא עם תרבית תאי הקפאה בינונית. להקפיא עד -80 ° C באמצעות שיתוף הקפאהntainer. חנות ב -80 ° C אם כלי ישמשו בתוך שבוע. עבור אחסון לטווח ארוך, במקום cryovials ב -180 מעלות צלזיוס. בעת ביצוע הבידוד EC, להפשיר את cryovials במהירות באמבט מים (37 מעלות צלזיוס) ומכניסים מיד HBSS קר כקרח. המשך כמצוין 1.7.
- מעביר את הכלי לצינור 50 מ"ל ולשטוף אותו פעמים HBSS להסיר אריתרוציטים (או בינוני הקפאה שיורית במקרה של הפשרה) (איור 1 ט).
- לעכל את כלי בתוך שפופרת 50 מ"ל עם פתרון מסוג 30 מ"ל collagenase השנייה (0.15 U / ml) ו dispase (0.15 U / ml) בתאי האנדותל לכלבים צמיחה בינוני (CECGM) במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס עם לסירוגין עדין תסיסה.
- הסר את הכלי מצינור צנטריפוגות השעית התא במשך 5 דקות ב 250 x גרם.
- Resuspend גלולה תא CECGMnd ההשעיה תא מ"ל זרע 2 לכל טוב (1 - 3 בארות בהתאם לגודל כלי). התרבות התאים ב 37 ° C באווירה humidified עם 5% CO 2 באוויר ולשנות את המדיום תרבות פעמיים בשבוע.
- מעבר התאים כאשר confluency של 70 - 80% הוא הגיע.
- שוטפים את התאים עם HBSS מחומם מראש כדי להסיר תאים מתים או שאינם מחוברים. הוסף 200 μl אנזים רקומביננטי תא דיסוציאציה (1x) זה טוב ומניח בחזרה בחממה במשך 5 דקות או עד שכל התאים מנותקים.
- מעבירים את התאים לצינור 15 מ"ל ולעצור trypsinization ידי הוספת 10 מ"ל של התקשורת בתרבות (CEGM) כולל 10% עוברית עגל בסרום (FCS). צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 250 x. המשך התרבות צלחת או בקבוק מראש מצופה ג'לטין.
אפיון 2.
- לתאי אנדותל התרבות כלבים אבי העורקים (CnAOECs) ולהשוות את המורפולוגיה של שורות תאים ראשוניים מסחרי פעמיים בשבוע עם מיקרוסקופ.
הערה: Tהוא אופייני גדל דפוס של ECS בטלאים יכול להיות הכי טוב שנצפה כאשר confluency של> 70% הוא הגיע.- תרבות CnAOECs ב CECGM על ג'לטין 0.5% w / v מצופה מראש בבקבוק T75. תאי מעבר פעם בשבוע כאשר confluency הוא 70 - 80%.
- לקבלת passaging, לשטוף את התאים פעם עם HBSS מחומם מראש ולהוסיף 1 מ"ל אנזים התא דיסוציאציה רקומביננטי (1x). מניח את הבקבוק בחזרה בחממה במשך 5 דקות או עד שכל התאים מנותקים. להשבית טריפסין על ידי הוספת בינוני תרבות 10 מ"ל (CEGM) כולל 10% FCS. צנטריפוגה ההשעיה תא במשך 5 דקות ב 250 XG, וזורקים supernatant ו resuspend התאים במדיום תרבות 1 מ"ל.
- קחו aliquot 10 μl של ההשעיה תא לדלל 1: 1 עם 0.4% trypan כחול. ספירת התאים באמצעות דלפק תא אוטומטי, צלחת החוצה 4.0 x 10 5 תאי קיימא בבקבוק T75 חדש. הוסף 10 מ"ל של מחומם מראש CECGM אל הבקבוק ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO 2.
- תרבות CnAOECs ב CECGM על ג'לטין 0.5% w / v מצופה מראש בבקבוק T75. תאי מעבר פעם בשבוע כאשר confluency הוא 70 - 80%.
- לבודד RNA מפסוק 1 של CaPECs התרבותי CnAOECs.
- אסוף לפחות 1 x 10 3 תאים כמו גלולה, להוסיף 20 μl של מגיב הכנת המדגם (SPR) ו דגירה של 1 דק 'כדי lyse התאים. לאחר דגירה, בזהירות לאסוף את lysate התא המכיל RNA ולאחסן הכולל ב -70 ° C..
- המרת mRNA כדי cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA (למשל, iScript) בהתאם להוראות היצרן. cDNA חנות ב 4 ° C עד שבוע, או ב -20 ° C לטווח ארוך עד מוכן לבצע את qPCR.
- מדוד ביטוי גנים של CD31 סמן אנדותל לאשר ממוצא תא האנדותל. בצע התקנה ניסיונית וכימות באמצעות הנחיות תמצית MIQE 10. לנורמליזציה, למדוד ביטוי של גנים התייחסות GAPDH, RPS19, ו B2MG 11.
- הכן דילול של פי 10 של cDNA שהושגו מים חינם nuclease.
- להכיןדילול של פי 4 ממדגם cDNA ונקוו עבור הקו הרגיל ולהשתמש מים חינם nuclease כביקורת הלא תבנית. לדלל את הדגימות חמש פעמים להגיע דילול כולל של פי 50 לתגובות qPCR. פיפטה 10 תגובות μl בשני עותקים בפורמט 384 גם באמצעות 4 cDNA μl ו -6 μl של fluorophore מעורבב עם 20 pmol של הפוך פריימר קדימה (טבלה 1).
- הגדר את התוכנית עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עבור הפעלת פולימראז תקי, ואחריו 39 מחזורים של 10 שניות על 95 מעלות צלזיוס למשך denaturation, ו -30 שניות ב Tm עבור חישול התארכות. ה- TM עבור כל קבוצה פריימר מוצג בטבלה 1.
- לבצע המסת עקומת המנתח הבאה כל ריצה כדי להבטיח מוצר אחד בלבד מוגברת. לנרמל את רמות הביטוי של דגימות באמצעות הכמות היחסית הממוצעת של גנים התייחסות, ולחשב את ΔCt אם יעילות התגובה היא בין 95% ו -105%.
- להעריך פונקציונלי EC עם angiassay ogenesis.
- הוסף 10 μl של מטריקס היטב בכל שקופית אנגיוגנזה טרום מקורר להתפשט עם קצה פיפטה כדי לכסות את פני השטח של הבאר. שמור את תאי מטריקס על הקרח ולהימנע כניסתה של בועות אוויר לתוך הג'ל. לחזק את הג'ל על ידי הצבת את השקופית בצלחת פטרי עם מגבות נייר ספוגה מים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 30 דקות.
- להוסיף 1.0 x 10 4 עיקרי ECS ב 50 μl בינוני צמיחה האנדותל לכל טוב. דגירת השקופיות עבור 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- לאחר 6 שעות לצלם עם הגדלה 20X, והקפד לכלול הבאר כולו בתמונה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כלי דם שונים היו נתונים בהצלחת פרוטוקול הבידוד המתואר (תרשים 2). אפשר היה לנתח והפוך אבי העורקים, הווריד הנבוב, פורטה הנבוב, ואת העורקים הכליליים מכלבים בריאים (כל כלי מכל כלב, n = 4). עם אותה ECS הגישה בודדה שני shunts portosystemic המולד (extrahepatic ו intrahepatic, n = 1 כל אחד). למרות אבי העורקים היה הפוך בקלות, מגזרים אבי העורקים החזי היו יותר מאתגר מאשר אבי העורקים בבטן. בשנת פרקי חזה יש האאורטה רב העורקים צלעי הסתעפות ממנו,...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקרי ההתמקדות כלבית ECS הקו העיקרי CnAOEC משמש מודל השושלות האנדותל של הכלב 3, 12, 13. במחקרים בבני אדם, תרבות HUVEC עדיין נחשבה תקן הזהב. ברור, התמקדות רק על ECS נגזרה חבל טבור היא הגבלת משרד במחקר לב וכלי דם. יש לתאי אנדותל דפוס ביטוי גנים ספציפיים קביעת מפרט arteriovenous. על מנת להסביר את ההבדלים הללו בכלי לאחר לידה אנו מציגים שיטת בידוד הרומן הזה מבוסס על המיקום האנטומי הספציפי של תאי אנדותל. השיטות הנפוצות לבידוד EC העיקרי הן שטיפת הספינה עם פתרון אנזים או וקוצצ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים מבקשים להודות להנס דה גראף ותומאס ויננדאל על עזרתם הטכנית בטיפוח ה-ECs.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קולגנאז סוג II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| מדיום גידול תאי אנדותל כלבים | יישומי תאים | Cn211-500 | |
| CnAOECs | יישומי תאים | Cn304-05 | |
| סרום עגל עוברי (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| ערכת סינתזה | iScript Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR ירוק סופר מיקס | Bio-Rad | 170-8886 | |
| הקפאת תאי התאוששות בינוני | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | שמור על קרח לפני השימוש |
| מיכל הקפאה, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| מספריים כירורגיים (מיונז או מצנבאום) | B. Braun Medical | BC555R | |
| מלקחיים נגד יתושים | B. Braun Medical | FB440R | |
| מלקחיים נגד יתושים מעוקלים | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| תא ספירה אוטומטי | Bio-Rad | 145-0102 | |
| שקופיות ספירה, תא כפול | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | להפשיר לאט על קרח |
| ומיקרו;-שקופית אנגיוגנזה | Ibidi | 81501 | |
| גידול אנדותל בינוני | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | לונזה | CC-4176 |
מקורות
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128(2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445(2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183(2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74(2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
