מאמר שיטה

LAP-tagged מושרה שורות תאים יציבות על תפקוד החלבון חוקר, Spatiotemporal לוקליזציה רשתות אינטראקציה חלבון

11.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54870

⸱

24 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטה ליצירת לוקליזציה וטיהור זיקה (LAP) קווי תאים יציבים הניתנים להשראה לחקירת תפקוד חלבון, לוקליזציה תת-תאית מרחבית-זמנית ורשתות אינטראקציה בין חלבון-חלבון.

תקציר

קומפלקסים מרובי חלבונים, במקום חלבונים בודדים הפועלים בבידוד, שולטים לעתים קרובות במסלולים מולקולריים המווסתים את ההומאוסטזיס התאי. בהתבסס על עיקרון זה, טיהור החלבונים הקריטיים הנדרשים לתפקוד מסלולים אלה יחד עם שותפיהם המקומיים האינטראקטיביים לא רק איפשר מיפוי של מרכיבי החלבון של מסלולים אלה, אלא גם סיפק הבנה עמוקה יותר של האופן שבו חלבונים אלה מתאמים כדי לווסת מסלולים אלה. בהקשר זה, הבנת הלוקליזציה המרחבית-זמנית של חלבון ורשת האינטראקציה בין חלבון לחלבון יכולה לסייע בהגדרת תפקידו בתוך מסלול, כמו גם כיצד ויסות שגוי שלו עלול להוביל לפתוגנזה של מחלה. כדי לענות על צורך זה, מספר גישות לטיהור חלבונים כגון טיהור זיקה טנדם (TAP) ולוקליזציה וטיהור זיקה (LAP) תוכננו ונעשה בהם שימוש מוצלח. עם זאת, על מנת ליישם גישות אלה לניתוחים פרוטאומיים בקנה מידה של מסלול, יש להשלים אסטרטגיות אלה עם פיתוחים טכנולוגיים מודרניים בשיבוט ויצירת קווי תאים יציבים של יונקים. כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת קווי תאים יציבים הניתנים להשראה אנושית מתויגים על ידי LAP לחקירת לוקליזציה תת-תאית של חלבון ורשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון. גישה זו יושמה בהצלחה על דיסקציה של מסלולים תאיים מרובים כולל חלוקת תאים ותואמת לניתוחים פרוטאומיים בעלי תפוקה גבוהה.

מבוא

כדי לחקור את התפקוד התאי של חלבון לא מאופיין, חשוב לקבוע את הלוקליזציה התת-תאית המרחבית-זמנית שלו ואת שותפי החלבון האינטראקטיביים שלו. באופן מסורתי, תגי אפיטופ בודדים וטנדמים המאוחים לקצה N או C של חלבון מעניין שימשו כדי להקל על לוקליזציה של חלבונים ומחקרי אינטראקציה בין חלבונים. לדוגמה, טכנולוגיית טיהור הזיקה הטנדם (TAP) אפשרה בידוד של קומפלקסים של חלבונים מקומיים, אפילו אלה שנמצאים בשפע נמוך, הן בשורות תאי שמרים והן ביונקים1,2. טכנולוגיית הלוקליזציה וטיהור הזיקה (LAP), היא פיתוח עדכני יותר המשנה את הליך ה-TAP כך שיכלול רכיב לוקליזציה באמצעות הכנסת החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) כאחד מתגי האפיטופ3. גישה זו העניקה לחוקרים הבנה מעמיקה יותר של הלוקליזציה התת-תאית של חלבון בתאים חיים תוך שמירה על היכולת לבצע טיהורי TAP מורכבים כדי למפות רשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון.

עם זאת, ישנן בעיות רבות הקשורות לשימוש בטכנולוגיות TAP/LAP שפגעו בשימוש הנרחב בהן בתאי יונקים. לדוגמה, משך הזמן הדרוש ליצירת קו תאים יציב המבטא חלבון מתויג TAP/LAP מעניין; המסתמך בדרך כלל על שיבוט הגן המעניין לווקטור ויראלי ובחירת אינטגרנטים יציבים של תא בודד עם רמת הביטוי הרצויה. בנוסף, מסלולים תאיים רבים רגישים לביטוי יתר של חלבון מכונן (אפילו ברמות נמוכות) ויכולים לעצור תאים או לעורר מוות תאי לאורך זמן, מה שהופך את יצירת קו התאים היציב TAP/LAP לבלתי אפשרי. אילוצים אלה ואחרים מנעו ממתודולוגיות LAP/TAP להפוך למערכות בעלות תפוקה גבוהה ללוקליזציה של חלבונים והבהרת קומפלקס חלבונים. לכן, היה עניין רב בפיתוח מערכת תיוג LAP-תפוקה גבוהה הניתנת להשראה עבור תאי יונקים המנצלת את החידושים הנוכחיים בטכנולוגיות שיבוט וקווי תאים.

כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת קווי תאים יציבים עם חלבונים מתויגים ב-LAP הניתנים להשראת דוקסיציקלין/טטרציקלין (Dox/Tet) המיישמים התקדמות הן בטכנולוגיות שיבוט והן בטכנולוגיות קו תאים של יונקים. גישה זו מייעלת את רכישת הנתונים בכל הנוגע ללוקליזציה תת-תאית של חלבון מתויג LAP, טיהור קומפלקס חלבונים וזיהוי חלבונים אינטראקטיביים4. למרות שפרוטאומיקה של זיקה משתמשת במגוון רחב של טכניקות להבהרת קומפלקס חלבונים5, הגישה שלנו מועילה להאצת הזיהוי של קומפלקסים אלה ורשתות האינטראקציה המקוריות שלהם והיא ניתנת לתיוג חלבונים בתפוקה גבוהה הדרוש לחקירת מסלולים ביולוגיים מורכבים המכילים מספר רב של מרכיבי חלבון. המפתח לגישה זו הוא התקדמות באסטרטגיות שיבוט המאפשרות נאמנות גבוהה ושיבוט מזורז של גני מטרה למערך של וקטורים לביטוי גנים במבחנה, באורגניזמים שונים כמו חיידקים ובקולו-וירוס, ובתאי יונקים6,7. בנוסף, שיתוף הפעולה של ORFeome שיבט אלפי מסגרות קריאה פתוחות מאומתות ברצף בווקטורים המשלבים את ההתקדמות הללו בשיבוט, הזמינות לקהילה המדעית8-11. במערכת שלנו, וקטור תיוג ה-LAP של pGLAP1 מאפשר שיבוט בו-זמני של מספר רב של שיבוטים, מה שמקל על תיוג LAP בתפוקה גבוהה. הליך שיבוט מזורז זה משולב בגישה יעילה ליצירת קווי תאים עם גנים מעניינים מתויגים ב-LAP המוכנסים בלוקוס גנומי יחיד שנקבע מראש. זה עושה שימוש בקווי תאים המכילים אתר יעד זיהוי יחיד (FRT) בתוך הגנום שלהם, שהוא אתר האינטגרציה של גנים מתויגים LAP. קווי תאים אלה מבטאים גם את מדכא הטטרציקלין (TetR) שנקשר למפעילי Tet (TetO2) במעלה הזרם של הגנים המתויגים ב-LAP ומשתיק את ביטוים בהיעדר Dox/Tet. זה מאפשר ביטוי השראת Dox/Tet של החלבון המתויג LAP בכל זמן נתון. היכולת של ביטוי חלבון מתויג LAP הניתן להשראה היא קריטית, מכיוון שמסלולים תאיים רבים רגישים לרמות החלבונים הקריטיים השולטים במסלול ויכולים לעצור את צמיחת התאים או לעורר מוות תאי כאשר חלבונים אלה מתבטאים יתר על המידה, אפילו ברמות נמוכות, מה שהופך את היצירה של קווי תאים יציבים שאינם ניתנים להשראה לבלתי אפשרית12.

פרוטוקול

הערה: סקירה של דור שורות תאי יציבות מתויג LAP מושרים לכל חלבון העניין מתוארת באיור 1 ואת הסקירה של ביטוי חלבון מתויג LAP, טיהור והכנת proteomic המוני ניתוחית מתוארת באיור 3.

1. שיבוט את מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של הגן של עניין לתוך וקטור LAP-תג

  1. שיבוט ORF של הגן של עניין לתוך מעבורת וקטור.
    1. השתמש תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר את ORF עניינים עם באתרי attB1 ו attB2 המתאים בתוך פריימרים היתוך או N-terminal או היתוך C-terminal. ראה טבלה מס '1 עבור רצפים פריימר ולוח 2 התנאים PCR.
    2. ג'ל לטהר את מוצרי ה- PCR על ידי לפתור אותן על ג'ל 1% agarose. ובלו הלהקה המוגבר כי הוא הגודל הרצוי לך מתוך הג'ל ולחלץ אותו מן פרוסת ג'ל באמצעות גרם DNAאל מיצוי ערכה לפי הוראות יצרן.
    3. דגירת attB המטוהרים המכיל מוצרי PCR עם attP המכיל וקטור הסעות ואת recombinase המאפשר מוצרי PCR כדי ולשלב מחדש לתוך הווקטור לפי הוראות יצרן (ראה טבלת M aterials).
      הערה: וקטורי הסעות ריקים וקטורי LAP תיוג המכילים את גן CCD B ו- צריכים להיות מופצות תאי חיידקיים עמידים B CCD (ראה לוח חומרים). עם זאת גן ccdB הוא recombined החוצה כאשר ORF מוכנס לתוך וקטורים אלה, ומכאן להשתמש בתאי DH5α E. coli רגילים כאשר הפצת וקטורים עם ORFs המשובט.
    4. Transform קולי תאים DH5α E. עם 1 μl של המוצר התגובה צלחת התאים טרנספורמציה על מרק לוריא (LB) צלחת אגר עם 50 מ"ג / מ"ל Kanamycin 13.
    5. בחר המושבות העמידות Kanamycin.
    6. לגדול מושבות שנבחרו ב LB ליdia עם 50 מ"ג / מ"ל Kanamycin, לעשות הכנה-מיני דנ"א לאשר שילוב הגן על ידי רצפי DNA באמצעות פריימרים רצף המפורטים בטבלה 3.
  2. העברת הגן של עניין ממעבורת וקטור לתוך וקטור LAP-תג.
    1. דגירה וקטור הסעות המכיל את הגן אומת רצף של ORF עניין עם וקטור LAP-תג (pGLAP1 היתוך N-terminal) ואת recombinase שמתווך העברת הגן של עניין מן וקטור הסעות לתוך וקטור LAP-תג לפי הוראות היצרן (ראה חומרים).
      הערה: סדרת LAP / וקטורים TAP שיכולים לשמש מבוסס על האמרגן הרצוי, epitope תג, ו- N או C- מסוף תיוג ניתן למצוא בטבלה 4.
    2. Transform קולי תאים DH5α E. עם 1 μl של המוצר התגובה צלחת התאים שינו לצלחת אגר LB עם 100 מ"ג / מ"ל אמפיצילין 13.
    3. בחר את קולו אמפיצילין העמידניז.
    4. לגדול מושבות שנבחרו בתקשורת LB עם 100 מ"ג / מ"ל אמפיצילין, לבצע אינטגרציה הגן DNA מיני-prep, ולאשר על ידי רצפי DNA באמצעות פריימרים רצף המפורטים בטבלה 5.

דור 2. של שורת תאים יציבה ועין מתנהלת המבטא את ג'ין מתויג-LAP עניין

  1. בחר את שורת התאים המתאימה ביותר עבור הפרויקט של עניין. לחלופין, ליצור קו התא המארח מכל שורת תאים קיימים אשר constitutively מבטא את TetR ומכיל אתר FRT המאפשר הגן-tagged LAP עניין להיות משולבת ביציבות לתוך הגנום (ראה חומרים).
    הערה: פרוטוקול זה משתמש בקו התא HEK293 המכיל את TetR ואתר FRT, אשר גדל ב -Tet DMEM / F12 התקשורת [עשה עם 10% בסרום שור העובר (FBS) כי הוא נטול טטרציקלין (-Tet)] 4 .
  2. קבע את הריכוז המינימאלי של hygromycin נדרש להרוג את קו התא המארח בתוך 1 עד 2 קטןKS לאחר תוספת התרופה. הריכוז יכול להשתנות בין שורות תאים המארח, עם רוב הנע בין 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 800 מיקרוגרם / מ"ל.
    הערה: HEK293 תאים שגודלו -Tet DMEM / F12 התקשורת עם 100 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ימותו תוך 1-2 שבועות.
  3. Co-transfect וקטור המבטא את recombinase flippase (מתווכת שילוב של הגן LAP-tagged עניין לתוך האתר FRT בתוך הגנום של התא) עם וקטור מתויג-LAP לתאים HEK293 באמצעות מגיב transfection לפי הוראות היצרן . השתמש יחס של 4: 1 של וקטור recombinase כדי LAP וקטור 14.
    הערה: היחס האופטימלי תלוי קו התא המארח ושיטת transfection, והן עשוי לחייב טיטרציה. יחס של 4: 1 עובד היטב עבור שורות התאים ביותר. כלול צלחת מעושה טרנספקציה כביקורת שלילית.
  4. יום אחד-transfection פוסט, להחליף את תקשורת -Tet DMEM / F12 עם תקשורת טריה.
  5. יומיים שלאחר transfectiעל, פיצול תאים כדי מפגש 25%. אפשר תאים ~ 5 שעות לצרף, אז להוסיף hygromycin המכיל תקשורת -Tet DMEM / F12 בריכוז הקבוע מראש בשלב 2.2. לקבלת HEK293 התאים משתמשים 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin.
    הערה: FRT המכיל שורת תאי HEK293 מכיל גם את TetR המשויך התנגדות Blasticidin, ולכן 5 מיקרוגרם / מיליליטר Blasticidin משמש במהלך תהליך בחירת תא קו היציב כדי לבחור עבור TetR ולמזער ביטוי דולף.
  6. חלף hygromycin המכיל תקשורת -Tet DMEM / F12 לפי צורך עד מוקדי תאים מובחנים להופיע דומות כתמים אטומים נגד הצלחת השקופה.
  7. הוסף 20 μl של טריפסין על גבי אחד מוקדי תאים ו pipet למעלה ולמטה 2 פעמים עם טיפ pipet 200 μl. המקום התאים בצלחת 24 היטב ולהרחיב את התאים על ידי נמשכה הצמיחה hygromycin המכילים -Tet DMEM / F12 התקשורת.
  8. מסך תאים עבור ביטוי חלבון LAP-tagged מושרה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי קבוע תאים או לחיות תאים ו / אומערבי סופג עבור תג GFP בתוך LAP-התג 15.

3. טיהור של קומפלקסי חלבונים-tagged LAP

הערה: המלצות פרטי פרוטוקול טיהור חלבוני LAP-tagged הבאות על תנאים ומינון עבור טיהור חלבוני LAP-tagged טיפוסי המבוססת על ניסיון קודם. עם זאת, יש להיזהר כדי להבטיח אופטימיזציה אמפירית מתבצעת לכל רמת ביטוי חלבון מורכב חלבון של עניין לספק את התוצאות הטובות ביותר.

  1. צמיחת תאים וקציר Cell.
    1. הרחב את שורת תאים LAP-tagged תוקף לבידוד TAP של קומפלקסים חלבונים, על ידי HEK293 תאים passaging כל הרף לתוך צלחות גדולות ו / או בקבוקי רולר במדיה -Tet DMEM / F12 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    2. עבור שורות תאים מושרה ט / Dox, להשרות במשך 10-15 שעות בריכוז של 0.2 מיקרוגרם / מ"ל ​​ט / Dox כאשר התאים מגיעים ~ 70% confluency, לפני harvestinתאי ז.
      הערה: בפעם ריכוז אינדוקציה צריכה להיקבע עבור כל חלבון, טיטרציה של 0.1-1 מיקרוגרם / מיליליטר ט / Dox במשך 10-15 שעות מומלצת.
    3. קציר תאים על ידי תסיסה או תאי trypsinization ו גלול ב 875 XG למשך 5-10 דקות.
  2. זיווגים אנטי GFP נוגדנים חרוזים חלבון
    1. השתמש 40 מיקרוגרם של הנוגדן עבור immunoprecipitation מתוך lysate מוכן מן גלולה 0.5 מ"ל תא, נפח תא ארוז (PCV).
      הערה: כמות הנוגדנים הצורך יהיה תלוי שפע של חלבון LAP-tagged, בין היתר, ידרוש אופטימיזציה. טיטרציה של 10-40 מיקרוגרם מומלץ.
    2. לאזן 160 נפח ארוז μl (PV) חרוזים חלבון לתוך PBST (PBS + 0.1%-20 Tween) בצינור 1.5 מ"ל. לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBST.
      הערה: כל השטיפות בזאת מבוצעות על ידי צנטריפוגה חרוז ב 5000 XG במשך 10 שניות.
    3. חרוזים Resuspend ב 500 PBST μl ולהוסיף 80 מיקרוגרם של זיקהארנב -purified נוגדן אנטי GFP על צינור אחד של 160 חרוזים μl. מערבבים במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר (RT).
    4. לשטוף חרוזים 2 פעמים עם 1 מ"ל של PBST. לאחר מכן, לשטוף חרוזים 2 פעמים עם 1 מ"ל של 0.2 M borate נתרן, pH 9 (20 מ"ל 0.2 M נתרן borate + 15 מ"ל 0.2 M חומצה בורית). לאחר שטיפה של דבר, להוסיף 900 ​​μl של borate 0.2 M נתרן, pH 9 להביא את הנפח הסופי ל 1 מ"ל.
    5. הוספת 100 μl של 220 מ"מ dimethylpimelimidate (DMP) לריכוז סופי של 20 מ"מ. סובב את הצינורות בעדינות ב RT במשך 30 דקות. עבור 220 מ"מ DMP, resuspend תכולת בקבוק אחד 50 מ"ג ב 877 μl של 0.2 M borate נתרן, pH 9 ולהוסיף מיד ההשעיה חרוז.
    6. לאחר הדגרה עם DMP, לשטוף חרוזים פעם 1 עם 1 מ"ל של 0.2 M ethanolamine, 0.2 M NaCl pH 8.5 כדי להשבית את crosslinker שיורית. חרוזים Resuspend ב 1 מ"ל של אותו חיץ ולסובב עבור שעה 1 ב RT. חרוזים גלולים וחרוזי resuspend ב 500 μl של 0.2 M ethanolamine, 0.2 M NaCl pH 8.5. חרוזים הם יציבים עבור several חודשים על 4 מעלות צלזיוס.
  3. הכנת החוצצים עבור תמוגה תא וטיהור Complex
    1. כן מאגרי LAPX (כאשר X הוא ריכוז המלח הרצוי [KCl מ"מ] של למאגר LAP; 300 מ"מ עבור תמוגה תא, 200 מ"מ לשטיפת החרוז ביותר, ו -100 מ"מ חרוזי כביסה לפני משחררי חלבונים) על ידי ביצוע פתרון pH 7.4 המכיל 50 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), KCl X מ"מ, 1 מ"מ חומצה tetraacetic אתילן גליקול (EGTA), 1 מ"מ MgCl 2, ו גליצרול 10%.
      הערה: הרכיבים של חיץ זה משמש להיות קרוב ככל האפשר בסביבה בתאים חיים. HEPES משמש חיץ זעם pH של 7.2-8.2. KCl הוא מלח משמש כדי לשמור על החוזק היוני של למאגר. EGTA הוא סוכן chelating שקושר יוני סידן כדי להפחית את רמות הסידן לעומת מגנזיום. גליצרול MgCl 2 משמשים כדי לשפר את היציבות של חלבונים.
    2. הכן חיץ LAPX N ידי הוספת 0.05% nonyl phenoxypolyethoxylethanol למאגר LAPX.
      הערה: phenoxypolyethoxylethanol nonyl הוא חומר ניקוי עדין כי solubilizes חלבונים, אלא משמר אינטראקציות בין חלבונים, ובכך ריכוז גבוה משמש בעת תהליך החילוץ והוא הוריד אז במהלך השלבים מחייבים כביסה.
  4. הכנת lysates תא
    1. Resuspend 500 μl של PCV לתוך 2.5 מ"ל של LAP300 עם 0.5 מ"מ dithiothreitol (DTT) ומעכבי פרוטאז. להוסיף 90 μl של 10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol (0.3% סופיים) ומערבב על ידי היפוך.
    2. מניחים על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 21,000 XG במשך 10 דקות. איסוף supernatant במהירות הנמוך זו (LSS). לקחת דגימה 10 μl של LSS לניתוח ג'ל.
    3. העבר LSS לצינור TLA100.3 ספין על 100,000 XG במשך שעה 1 ב 4 ° C. איסוף supernatant מהירות גבוהה זה (HSS), בתוך שפופרת ומניחים על קרח. לקחת דגימה 10 μl של HSS לניתוח ג'ל.
      הערה: יש להימנע לוקחת את שכבת השומנים העליונה ביותרד שכבת התאים פסולת ביותר בתחתית. שכבת השומנים יש להסיר על ידי השאיפה ואקום לפני איסוף HSS.
  5. לכידת זיקה ראשונה: כריכת חרוזים אנטי-GFP
    1. חרוזים טרום elute מצמידים נוגדנים (השתמש 160 μl של חרוזים לכל 0.5 מ"ל תא גלולה (PCV)) על ידי שטיפה אותם 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ elution [3.5 M MgCl 2 עם 20 מ"מ טריס, pH 7.4] להיפטר זוגיים נוגדנים להפחית את הרקע. האם במהירות. אל תשאירו חרוזי מלח גבוה במשך זמן רב.
    2. לשטוף חרוזים 3 פעמים עם 1 מ"ל של LAP200 N. מערבבים HSS לחלץ עם חרוזים נוגדן עבור שעה 1 ב 4 ° C. צנטריפוגה ב 21,000 XG במשך 10 דקות. לקחת דגימה 10 μl של supernatant (כלומר, את הזרימה דרך (FT)) לניתוח ג'ל.
    3. לשטוף חרוזים 3 פעמים עם 1 מ"ל של LAP200 N עם 0.5 מ"מ מעכבי DTT ו פרוטאז. לשטוף חרוזים 2 פעמים (5 דקות כל אחד) עם 1 מ"ל של LAP200 N עם 0.5 מעכבי מ"מ DTT ו פרוטאז. שטפו במהירות 2 tIMEs עם 1 מ"ל של LAP200 N עם 0.5 מ"מ DTT ולא מעכבי פרוטאז לפני הוספת וירוס לחרוט טבק (TEV) פרוטאז.
  6. TEV מחשוף
    1. לדלל 10 מיקרוגרם פרוטאז TEV ב 1 מ"ל של LAP200 N ולסובב צינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: שלב זה יכול להיות מותאם לכל חלבון LAP-tagged להסתיים בעוד כמה שעות על ידי התאמת ריכוז של פרוטאז TEV, אשר יכול לסייע בשימור קומפלקסים חלבונים LAP-tagged.
    2. חרוזי ההעברה supernatant גלולים לצינור טרי. לשטוף חרוזים פעמיים עם 160 μl LAP200 N עם 0.5 מ"מ DTT ומעכבי פרוטאז (ריכוז משולש) כדי להסיר כל חלבון שיורית. לקחת דגימה 10 μl של supernatant לניתוח ג'ל.
  7. לכידת זיקה שנית: מלהתחבר לחלבון S Agarose
    1. לשטוף 1 שפופרת עם תערובת agarose חלבון 80 μl S (שרף ארוז 40 μl) 3 פעמים עם 1 מ"ל של LAP200 N.
      הערה: prot Sein מחייב את תג S יהיה לשקם RNase פעיל תג epitope השני אלטרנטיבה צריך להיחשב עבור קומפלקסים חלבונים המכילים RNA.
    2. להוסיף TEV eluted supernatant חרוזים agarose חלבון S ורוק עבור 3 שעות ב 4 ° C. חרוזים גלולה ולשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של LAP200 N עם 0.5 מ"מ DTT ו מעכבי פרוטאזות. לשטוף חרוזים 2 פעמים עם 1 מ"ל של LAP100.
  8. Elution חלבון
    1. Elute החלבונים את חלבון S agarose על ידי הוספת 50 μl של חיץ וחום מדגם 4x Laemmli ב 97 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
      הערה: חלבונים ניתן eluted גם מן החרוזים עם חיץ elution (3.5 M MgCl 2 עם 20 מ"מ טריס, pH 7.4).

4. זיהוי אינטראקציה חלבונים על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסה

  1. בחן את האיכות של הטיהור על ידי ניתוח הדגימות שנאספו על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE), צביעת כסף הג'ל (ראה חומרי טבלה) ועל ידי immunoblotting את eluates חיטוט עם נוגדנים אנטי GFP כדי להבטיח כי הטיהור מתויג LAP עבדה 16, ראה איור 4.
  2. כדי לזהות מינים לטיהור שיתוף stoichiometric ו substoichiometric, לקחת את דגימת elution הסופי ולהפריד אותו על ידי SDS-PAGE. כתם ג'ל עם כתם חלבון תואם ספקטרומטריית מסה. ובלו להקות הבולטים והחלל ביניהם מן הג'ל ולעבד אותם לניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה בנפרד 16.
    הערה: ישנן גישות רבות להפרדת eluates הטיהור הסופית והכין ספקטרומטריית מסה 5. לדוגמא, מתחמים-מטוהרי LAP ניתן eluted מן חרוזי S-חלבון באמצעות מלח גבוה (3.5 M MgCl 2) ואוכלוסיית החלבון השלמה בהמוניהם יכול להיות מנותחת על ידי ספקטרומטריית מסת 17. לחלופין, ניתן להפריד eluates הסופי 1 מ"מ על ידי SDS-PAGE ו להקה 1 מ"מ יחיד יכול להיות דוארxcised ונותח. זה מנקה את התערובת המורכבת של כל חרוזים או חומר חלקיקים כי יפריעו לניתוח.

תוצאות

כדי להדגיש את התועלת של מערכת זו, את מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של חלבון מחייב microtubule טאו שובט לתוך וקטור הסעות ידי הגברה ORF טאו עם פריימרים המכיל אתרים attB1 ו attB2 (טבלה 1) ו דוגרים המוצרים PCR עם וקטור הסעות וכן recombinase שמתווך החדרת המוצרים PCR לתוך וקטור הסעות. מוצרי התגובה שמשו להפוך חיידקי DH5α 13 ו- DNA פלסמיד ממושבות עמידות Kanamycin היה רצף כדי להבטיח חיבור טאו. וקטור תוקף רצף הסעות-טאו ששימש אז להעביר את ORF טאו לתוך וקטור pGLAP1, אשר התמזגו טאו ב מסגרת עם LAP (EGFP-TEV-S-חלבון) תג, על ידי דוגרים וקטור-טאו הסעות עם וקטור pGLAP1 ואת recombinase שמתווך העברת ORF מפני שיטת הסעות pGLAP1. מוצרי התגובה שמשו להפוך חיידקי DH5α13 ו- DNA פלסמיד ממושבות עמידות אמפיצילין היה רצף על מנת להבטיח כי היתוך LAP-טאו היה בתוך מסגרת. רצף תוקף pGLAP1-LAP-טאו היה שותף transfected אז עם וקטור המבטא את אנזים רקומבינציה flippase לתאי HEK293 שהכיל יעד הכרת flippase יחיד (FRT) באתר בתוך הגנום שלהם, המהווה את האתר של אינטגרציה עבור גני LAP-tagged 14. גם שורת תאים זו ביטאה את TetR הנקשרת מפעילי ט במעלה הזרם של גנים מתויג LAP ושתיקות הביטוי שלהם בהעדר ט / Dox. integrants יציבה נבחרו עם התקשורת -Tet DMEM / F12 עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin במשך 5 ימים. מוקדי תאים בודדים hygromycin עמיד נבצרו ידי הוספת 20 μl של טריפסין על גבי pipetting למעלה ולמטה 2 פעמים. תאים הונחו בצלחת 24 גם והורחבו נמשכה צמיחת תקשורת -Tet DMEM / F12.

כדי לוודא תא hygromycin העמידהים היה מסוגל לבטא LAP-טאו, HEK293 תאי LAP-טאו היו מושרים עם 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר Dox במשך 15 תמציות hr וחלבון הוכנו מ הלא מושרה ואת מושרה Dox תאים. תמציות אלה הופרדו על ידי SDS-PAGE, הועבר קרום PVDF, ו immunoblotted עבור GFP ו טובולין כמו טעינה מלאה. כפי שניתן לראות באיור 4 א, LAP-טאו (דמיינו עם נוגדנים אנטי GFP) באה לידי ביטוי רק בנוכחות Dox. כדי לאמת כי LAP-טאו היה מקומי כראוי ציר microtubule mitotic במהלך מיטוזה, כפי שהוכיחו בעבר עבור טאו אנדוגני 18, HEK293 תאי LAP-טאו היו מושרים עם 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר Dox במשך 15 שעות ותאים תוקנו עם 4% paraformaldehyde ושיתוף מוכתם עבור DNA (Hoechst 33342) ו microtubules (נוגדנים נגד טובולין). באופן עקבי, LAP-טאו היה מקומי אל ציר mitotic במהלך metaphase של מיטוזה (איור 4B). כדי לוודא LAP-טאו וחלבוני האינטראקציה שלה יכול להיות מטוהר עם sys זהTEM, HEK293 תאים LAP-טאו גדלו בקבוקי רולר ל ~ 70% confluency, המושרה עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​Dox במשך 15 שעות, שנקטפו על ידי תסיסה, lysed עם חיץ LAP300, ו LAP-טאו היה מטוהרים באמצעות פרוטוקול לעיל. Eluates מן טיהור LAP-טאו נפתרו על ידי SDS-PAGE ו הג'ל היה מוכתם כסף. איור 4C מראה את טיהור LAP-טאו, המסומנים בכוכבית היא LAP-טאו וכמה להקות אחרות מעידים על חלבוני אינטראקצית טאו ניתן לראות.

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של דור שורות תאים יציבות ועין מתנהלת-tagged LAP לכל חלבון עניין. מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של גנים של עניין הם מוגברים עם אתרי attB1 ו attB2 איגוף 5 'ו 3' הרצפים סוף, בהתאמה (רצפים פריימר ניתנים טבלה 1) ו משובטים לתוך וקטור ההסעות. וקטורי הסעות אומת רצף עם הגן של עניין משמשים לאחר מכן כדי להעביר את הגן של עניין לתוך וקטור pGLAP1. רצף אומת וקטור pGLAP1 עם הגן של עניין הוא אז שיתוף transfected עם הווקטור המכיל את recombinase flippase לתוך קו התא הרצוי המכיל יעד הכרת flippase יחיד (FRT) באתר בתוך הגנום שלהם, המהווה את האתר של אינטגרציה עבור LAP גני -tagged. שורות תאים אלה גם לבטא את מדכא ט (TetR) הנקשרת מפעילי ט (TETO 2) במעלה הזרם של גנים מתויג LAP ושתיקות הביטוי שלהם בהעדר ט / Dox. הגן-tagged LAP של ריבית recombined מכן לתוך אתר FRT ו integrants היציבה נבחרת עם hygromycin. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2 "src =" / files / ftp_upload / 54,870 / 54870fig2.jpg "/>
איור 2: סקירה של בקשות שורות תאים יציבות מתויג LAP. LAP-tagged שורות תאי יציבות מושרות הם המושרה להביע את חלבון LAP-tagged עניין ידי תוספת Dox ויכולות להיות מסונכרנות בשלבים שונים של מחזור התא או יכולות להיות מגורה עם כימיקלים או הליגנדים כדי להפעיל כל מסלול איתות רצויה. לוקליזציה subcellular של חלבון LAP-tagged עניין יכולה להיות מנותחת על ידי תא חי או הדמית תא קבועה. חלבונים-tagged LAP יכול גם להיות מטוהרים זיקה טנדם וחלבונים אינטראקציה שלהם ניתן לזהות על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS / MS). לבסוף, cytoscape יכול לשמש כדי ליצור רשת אינטראקציה בין חלבונים של חלבון הפיתיון. Dox מציין דוקסיציקלין, IP מציין immunoprecipitate, EGFP מציין משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק, Tev מציין אתר מחשוף פרוטאז TEV, ו- S מציין תג S.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 3: מבט כולל של ביטוי חלבון LAP-tagged, טיהור והכנת ספקטרומטריית מסה. פרוטוקול יש 9 שלבים: 1) צמיחה אינדוקציה של ביטוי חלבון LAP-tagged, 2) קציר התא תמוגה, 3) הכנת lysates, 4) עקידת lysates חרוזים אנטי GFP, 5) מחשוף פרוטאז TEV של GFP-תג, 6) עקידת lysates חרוזים S-חלבון, 7) elution של חלבון הפיתיון וחלבונים אינטראקציה, ו 8-9) הכנת דגימות עבור ניתוחים proteomic מבוססי ספקטרומטריית מסה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 4: אימות ביטוי LAP-טאו. (א) כתם המערבי (WB) ניתוח של דגימות חלבון מן המושרה הלא המושרה ואת Dox LAP-טאו HEK293 תאים נחקר עם אנטי GFP ואנטי-טובולין נוגדנים לגילוי החלבון טאו-tagged LAP ואת טעינה מלאה טובולין, בהתאמה. שים לב LAP-טאו מתבטאת רק כאשר התאים הם המושרה עם Dox. (ב) בתאים mitotic להביע LAP-טאו קובעו שיתוף מוכתם עבור DNA (Hoechst 33342) ו טובולין (ג'קוזי) עם נוגדנים נגד טובולין ואת לוקליזציה subcellular של טאו LAP נותח על ידי microcopy הקרינה. שים לב LAP-טאו localizes לקטבים ציר ציר mitotic במהלך מיטוזה. (C) כסף מוכתם ג'ל של טיהור LAP-טאו. MW מציין משקל מולקולרי, CL מציין lysates פינה, ו- E הודיתeluates הסופי אטס. דוגמאות היו לרוץ על SDS-PAGE 4-20% ואת ג'ל הוכתם כסף לדמיין חלבונים מטוהרים. שים לב הלהקה המתאימה LAP-טאו מסומנת בכוכבית וכמה להקות אחרות המתאים חלבוני שיתוף לטיהור ניתן לראות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
היתוך N-terminal
קָדִימָה 5'- GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 '
לַהֲפוֹך 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (> 18gsn) -3 '
היתוך C-terminal
קָדִימָה 5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 '
לַהֲפוֹך 5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (> 18gsn) -3 '

טבלה 1: קדימה לאחור תחל עבור הגברה ORFs או ריבית כדי להכניסו הסעות וקטור. אתרי attB מודגשים באותיות קידוש לבנות, GSN מציין כי יותר מ -18 נוקלאוטידים גנים ספציפיים מתווספים פריימר.

שלב טֶמפֶּרָטוּרָה זְמַן
denaturation הראשונית 94 ° C 2 דקות
מחזורי הגברת PCR (35) לְפַגֵל 94 ° C 30 שניות
לְחַשֵׁל 55 ° C (תלוי פריימר Tm) 30 שניות
לְהַאֲרִיך 72 ° C 1 דקות / kb
לְהַחזִיק 4 ° C ללא הגבלת זמן

טבלה 2: PCR תנאי ההגברה של ORFs עניין.

וֶקטוֹר פריימר רצף קדימה הפוך רצף פריימר
וקטור הסעות 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 " 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 "

טבלה 3: קדימה ההפוך הרצף Primers עבור שירות ההסעות של הווקטור.

תְעוּדַת זֶהוּת מִבְנֶה שֶׁל הַהוֹרִים מְקַדֵם מיל Bac מיל אמא Reg ט?
pGLAP1 N לטווח EGFP-TEV-S פפטיד pcDNA5 / FRT / TO CMV amp מוצרי היגיינה כן
pGLAP2 N לטווח דגל-TEV-S פפטיד pcDNA5 / FRT / TO CMV amp מוצרי היגיינה כן
pGLAP3 N לטווח EGFP-TEV-S פפטיד; C לטווח V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a amp מוצרי היגיינה לא
pGLAP4 N לטווח דגל-TEV-S פפטיד; ; C לטווח V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a מוצרי היגיינה לא
pGLAP5 C לטווח S פפטיד-PreProt x2-EGFP pEF5 / FRT-V5 EF1a amp מוצרי היגיינה לא

לוח 4: רשימת וקטורי LAP / TAP זמינים עם יזמים משתנים, epitope-תגים, וכן יכול ביטוי Dox ועין מתנהל עבור N או תיוג חלבון-מסוף C. וקטורים זמינים מסחרית. מיל Bac מציין סמן עמיד חיידקים, מיל אמא מציינת סמן התנגדות תאים יונק, רג ט? הביטוי מציין אם הוא ט / Dox regulatable.

וֶקטוֹר פריימר רצף קדימה הפוך רצף פריימר
pGLAP1 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 " 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 "
pGLAP2 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 " 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 "
pGLAP3 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 " 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 "
pGLAP4 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 " 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 "
pGLAP5 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 " 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 "

לוח 5: קדימה ההפוך הרצף Primers עבור וקטורי pGLAP.

דיון

הפרוטוקול המתואר מתאר השיבוט של גני העניין לתוך וקטור תיוג LAP, הדור של שורות תאי יציבות מתויג LAP מושרים, והטיהור של קומפלקסי חלבונים-tagged LAP עבור ניתוחי proteomic. עם כל כבוד גישות LAP / TAP תיוג אחרים, פרוטוקול זה התייעל להיות תואם גישות תפוקה גבוהה למפה אינטראקציות לוקליזציה חלבון חלבונים בתוך כל נתיב תאי. גישה זו יושמה באופן נרחב על האפיון הפונקציונלי של חלבונים קריטיים עבור התקדמות מחזור התא, הרכבת ציר mitotic, הומאוסטזיס מוט ציר, ואת ciliogenesis שם כמה ו סייעה להבנה כיצד ויסות לא תקין של חלבונים אלה יכול להוביל למחל אדם 15, 16,19,20. לדוגמא, הקבוצה שלנו לאחרונה מנוצלת במערכת זו כדי להגדיר את הפונקציה והרגולציה של kinesin mitotic STARD9 (מטרת סרטן המועמד) ב הרכבת ציר 15,21, להגדירקישור מולקולרי חדש בין שרשרת אור dynein Tctex1d2 ותסמונות צלע לפולידקטיליות קצרות (SRPS) 19, ולהגדיר קישור מולקולרי חדש להבנה איך מוטציה של אנזים היוביקוויטין Mid2 יכולה להוביל צמודי X רוחניים מוגבלויות 16. מעבדות אחרות לא גם בהצלחה ליישם שיטה זו, כוללת אחד אשר קבעה כי Tctn1, רגולטור של איתות עכבר קיפוד, היה חלק ממכלול החלבון הקשורים ciliopathy כי בהרכב הממברנה ריסי מוסדר ciliogenesis באופן תלוי-רקמות 22,23. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן נרחב דיסקציה של כל נתיב תאי.

שלב קריטי פרוטוקול זה הוא הבחירה של שורות תאים יציבות מתויג LAP כי הם hygromycin עמיד. זהירות מיוחדת יש לנקוט כדי להבטיח כי כל התאים בצלחת המלאה מתים לפני בחירת מוקדים בצלחת ניסיוני עבור הגברה. Hygromycin ניתן גם אדהד במהלך culturing תא השיגרתי של שורות תאי יציבות מתויג LAP כדי להבטיח עוד שכל התאים לשמור על הגן מתויג-LAP עניין באתר FRT. אנו מזהירים כי לא כל-tagged חלבונים LAP יהיה פונקציונלי וכי חשוב יש מבחני במקום שניתן להשתמש בהם כדי לבדוק את תפקוד החלבון. דוגמאות של מבחנים משמשים לבדיקת תפקוד חלבון כוללות הצלת פנוטיפים הנגרמת siRNA וב מבחני פעילות במבחנה. כדי לטפל בבעיות פוטנציאליות של התוספת של תג-LAP גדול, יש לנו שנוצרנו בעבר וקטורי TAP-תג תואמים עם מערכת זו המכילה תגים קטנים, כמו דגל, אשר נוטים פחות לעכב היטב את הפונקציה ולוקליזציה של החלבון של עניין 4. בנוסף, וקטורים התיוג LAP קיימים להפקת חלבונים-tagged LAP C- מסוף או C- מסוף-tagged חלבונים TAP התואמות מערכת זו, אשר ניתן להשתמש בהם במקרים בהם תג LAP / TAP אינו נסבל על N -terminus של חלבון. בנוסף, הריכוזי ה מלח וחומרי ניקוי מאגרי הטיהור (LAPX N) יכולים להיות שונים כדי להגדיל או להקטין את החמרת הטיהור אם אף אחד או יותר מדי אינטראקציות הם נצפו. באופן דומה, הליך טיהור זיקת טנדם הוא מחמיר יותר מאשר יחיד הליכי טיהור ו interactors החלש עלול ללכת לאיבוד, ולכן ערכת טיהור יחידה יכולה לשמש כאשר מעט או לא interactors מזוהה.

חשוב לציין כי גישות תיוג epitope GFP אחרות קיימות המאפשרים חלבון ה- GFP בקנה מידה גדולה תיוג ללימודי לוקליזציה חלבון וטיהור 24,25. אלה כוללים את הגישה BAC TransgenOmics אשר מנצל כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי לבטא גנים-tagged GFP עניין מהסביבה מולדתם המכיל את כל האלמנטים רגולטוריות, אשר מחקה ביטוי גנים אנדוגניים 24. לאחרונה, CAS9 / רנ"א חד-מודרך (sgRNA) מתחמי ribonucleoprotein (RNPs) שימשו לסייםogenously לתייג גנים של עניין עם מערכת מפוצלת GFP המאפשרת את הביטוי של גנים-tagged GFP מן הלוקוסים הגנומי אנדוגני שלהם 25. למרות ששתי הגישות הללו לאפשר את הביטוי של חלבונים המתויגים בתנאים אנדוגני, לעומת פרוטוקול LAP התיוג המתואר כאן, הם אינם מאפשרים ביטוי מושרה ו מתכונן מהגנים מתויגים עניין. בנוסף, הם עדיין צריכים להיות מיושמים epitope טנדם תיוג TAP. כמו כן, חשוב לציין כי מערכות תיוג אחרות יכולות גם להיות שונות כדי להיות תואם למערכת המתוארת כאן ליצירת שורות תאי יציבות מתויג epitope מושרים. לדוגמא, זיהוי ביוטין תלוי קרבה (BioID) צבר תשומת לב רבה בשל יכולתו להגדיר ביחסים במרחב ובזמן בין חלבוני אינטראקצית 26. טכניקה זו מנצלת בשילובי חלבון זן מופקר של האנזים ביוטין coli Escherichia הבירה, אשר biotinylateזה כל חלבון ברדיוס ~ 10 ננומטר של האנזים. החלבונים biotinylated אז הם זיקה מטוהרים באמצעות לכידת ביוטין אפיניות ניתוח מעבדתי של הרכב על ידי ספקטרומטריית מסה. בירה תהיה biotinylate חלבון כלשהו בסמיכות, אפילו זמנית, מה שהופך אותו מתאים במיוחד לאיתור שותפים באינטראקציה חלש בתוך 27 מורכבים. בנוסף, את ערכת הטיהור אינה מחייבת כי אינטראקציות חלבון-חלבון אנדוגני להישאר שלמות יכולות להתבצע בתנאי denaturing, ובכך להקטין את שיעור תוצאות חיוביות שגויות. בתוך הפרוטוקול הנוכחי שלנו, ההחלפה של וקטור pGLAP1 ידי וקטור בירת תיוג יכולה להפוך מערכת זו מזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על זיקת גילוי אותם על סמך הקרבה. מערכת כזו תהיה יתרון מאוד לאיתור אינטראקציות חלבון חולפות כפי שקורה בין אינטראקציות אנזים-מצע רבים למיפוי inte חלבוני spatiotemporalractions בתוך מבנים המוגדרים בוצע עבור centrosome ואת הריסים 26,28.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF-MCB1243645 של הקרן הלאומית למדע (JZT), כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את העמדות של הקרן הלאומית למדע. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת ליבה Flp-In T-RExInvitrogenK6500-01ליצירת קווי תאים המכילים אתר FRT וביטוי TrtR
PETG, 5xNunc, Inc. 73520-734בקבוק רולר לגידול תאים
PETG, 2.5xNunc, Inc. 73520-420בקבוק רולר לגידול תאים
מערמי תאיםCorning CellSTACK3271מערם תאים לגידול תאים
500 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםCorning 431123 צינורות לקצירת תאים
נוגדן נגד GFPInvitrogenA11122ארנב נוגדן נגד GFP
חרוזי חלבון ABiorad156-0006משמש כמטריצה לצימוד נוגדנים נגד GFP
Dimethylpimelimidate (DMP)ThermoFisher Scientific21667משמש לצימוד נוגדנים נגד GFP לחרוזי חלבון
A צינורות TLA100.3Beckman349622Tubes לצנטריפוגה של ליזטים חלבונים במהלך שלב הפינוי
פרוטאז TEVInvitrogen12575-015משמש לפיצול תג GFP מחלבונים מתויגים ב-N מסוף
Precession GEHealthcare27-0843-01משמש לפיצול תג GFP מחלבונים מתויגים ב-C-terminal LAP חלבון
S agaroseNovagen69704משמש כמטריצת זיקה שנייה במהלך הטיהור של קומפלקסי חלבון מתויגים ב-LAP
ערכת מיצוי ג'ל QIAquick DNAQiagen28704/28706לשימוש בטיהור מוצרי PCR מג'ל אגרוז
BP clonase IIInvitrogen11789020משמש לשיבוט מוצרי ORF PCR לתוך וקטור המעבורת pDONR221
LR clonase IIInvitrogen11791020משמש לשיבוט ה-ORF של הגן המעניין לתוך וקטור התיוג pGLAP1 LAP
ccdB Survival 2 T1R E. coliInvitrogenA10460משמש לקידום וקטורי מעבורת ווקטורים ריקים של pGLAP
Fugene 6PromegaE2691מגיב טרנספקציה להעברת וקטורים לתאים אנושיים
TetracyclineInvitrogenQ100-19תרופה להשראת ביטוי חלבון המעורר Dox/Tet 
דוקסיציקליןקלונטק631311תרופה להשראת ביטוי חלבון מעורר Dox/Tet 
Hygromycin BInvitrogen10687010תרופה לבחירת אינטגרנטים יציבים מתויגים LAP
KanamycinCorning61-176-RGתרופה לבחירת מושבות חיידקים עמידות לקנמיצין
AmpicillinFisherBP1760-5תרופה לבחירת מושבות חיידקים עמידות לאמפיצילין
4-20% Tris Glycine SDS-PAGE ג'ליםBiorad4561094משמש להפרדת דגימות חלבון וטיהור סופי של תג LAP מבהיר
את ערכת Silver Stain Plus Biorad1610449משמש לצביעת כסף של דגימות ודגימות מתויגות LAP שנאספו לאורך תהליך הטיהור 
Coomassie כתם כחולInvitrogenLC6060משמש לצביעה של ג'לים SDS-PAGE כדי להמחיש טיהורים מתויגים ב-LAP וחיתוך רצועות חלבון, תואם ספקטרומטריית
מסה וקטור מעבורת pDONR221Invitrogen12536017וקטור מעבורת לשיבוט ה-ORFs של גנים מעניינים
Flippase המבטא וקטור pOG44InvitrogenV600520וקטור המבטא את הרקומבינאז של Flippase לשילוב גנים מתויגים ב-LAP בגנום של אתר FRT המכיל קווי תאים
Platinum Taq DNA PolymeraseThermoFisher Scientific10966018משמש להגברת PCR של ה-ORFs של גנים מעניינים
4x מאגר דגימת LaemmliBiorad1610747מאגר דגימה לסילוק קומפלקסים חלבונים מטוהרים מתויגים ב-LAP ממדיית מרק
Luria (LB) מטריצת החרוזיםפישרBP9723-2משמש לגידול DH5 ואלפא; ערכת
מיני-הכנה ל-DNAPromegaA1222משמש לייצור מיני-הכנה של פלסמיד DNA
מדיה DMEM/F12HycloneSH30023.01לגידול תאים אנושיים Hek293
FBS חסר TetAltanta BiologicalsS10350משמש לייצור מדיה -Tet DMEM/F12 לייצור וגידול קווי תאים יציבים הניתנים להשראה עם תיוג LAP
טריפסיןהיקלוןSH30042.01להרמת מוקדי תאי Hek293 מצלחות
טבליות מעכב פרוטאזRoche11836170001משמש לייצור חוצצי פרוטוקול, ללא EDTA
10% נוניל פנוקסיפוליאתוקסילאתנול Roche11332473001משמש להכנת מאגרי פרוטוקול
PBSCorning21-040-CMמשמש להכנת מאגרי פרוטוקול
Tween-20FisherBP337-500משמש להכנת מאגרי פרוטוקול
נתרן בוראטפישרS249-500משמש להכנת מאגרי פרוטוקול
חומצה בוריתפישרA78-500משמש להכנת מאגרי פרוטוקול
אתנולמיןCalbiochem34115משמש להכנת מאגרי פרוטוקול
NaClFisherP217-3משמש להכנת מאגרי פרוטוקול
KClFisherBP358-10משמש להכנת מאגרי פרוטוקול
Dithiothreitol (DTT)FisherBP172-25משמש להכנת מאגרי פרוטוקול
MgCl2FisherM33-500משמש לייצור מאגרי פרוטוקולים
Tris baseFisherBP152-5משמש לייצור מאגרי פרוטוקול
ערכת של חיידקים

מקורות

  1. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  2. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  3. Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci STKE. , (2005).
  4. Torres, J. Z., Miller, J. J., Jackson, P. K. High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis. Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).
  5. LaCava, J., et al. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives. Biotechniques. 58, 103-119 (2015).
  6. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).
  7. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).
  8. ORFeome Collaboration. The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource. Nat Methods. 13, 191-192 (2016).
  9. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).
  10. Lamesch, P., et al. hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics. 89, 307-315 (2007).
  11. Rual, J. F., et al. Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).
  12. Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M., Groudine, M. An "in-out" strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory. (1989).
  14. Uyttersprot, N., Costagliola, S., Miot, F. A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).
  15. Senese, S., et al. A unique insertion in STARD9's motor domain regulates its stability. Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).
  16. Gholkar, A. A., et al. The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division. Cell Rep. 14, 180-188 (2016).
  17. Graumann, J., et al. Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast. Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).
  18. Connolly, J. A., Kalnins, V. I., Cleveland, D. W., Kirschner, M. W. Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).
  19. Gholkar, A. A., et al. Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis. Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).
  20. Cheung, K., et al. Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing. Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).
  21. Torres, J. Z., et al. The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly. Cell. 147, 1309-1323 (2011).
  22. Garcia-Gonzalo, F. R., et al. A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition. Nat Genet. 43, 776-784 (2011).
  23. Chih, B., et al. A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain. Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).
  24. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).
  25. Poser, I., et al. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
  26. Firat-Karalar, E. N., Stearns, T. Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation. Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).
  27. Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B. BioID: a screen for protein-protein interactions. Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).
  28. Gupta, G. D., et al. A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface. Cell. 163, 1484-1499 (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

HEK293SDS PAGE
LAP-tagged מושרה שורות תאים יציבות על תפקוד החלבון חוקר, Spatiotemporal לוקליזציה רשתות אינטראקציה חלבון
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.