מאמר שיטה

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי באתרו Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

DOI:

10.3791/54899

⸱

10 בדצמבר 2016

 , 
1Lund University Diabetes Centre, Lund University, 2INSERM UMR-1060, CarMeN Laboratory, Lyon 1 University, INRA U1235, INSA of Lyon, Rockefeller and Charles Merieux Lyon-Sud Medical Universities

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות מבניות בין הרשתית האנדופלזמית (ER) לממברנות המיטוכונדריה, בתחומים הידועים כממברנות הקשורות למיטוכונדריה (MAM), הן מוקדים חיוניים לאיתות תאי ולגורל התא. במיוחד, אתרי מגע בין-אברונים אלה מאפשרים העברת סידן מה-ER למיטוכונדריה דרך תעלת האניונים התלויה במתח (VDAC)/חלבון מווסת גלוקוז 75 (GRP75)/אינוזיטול 1,4,5-קולטן טריפוספט (IP3R) קומפלקס תיעול סידן. בעוד שתא תת-תאי זה נמצא תחת חקירה אינטנסיבית בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד, לא קיימת שיטה פשוטה ורגישה לכימות הכמות האנדוגנית של מגע ER-מיטוכונדריה בתאים. באופן דומה, MAMs הם מבנים דינמיים מאוד, ואין גישה מתאימה לעקוב אחר שינויים באינטראקציות ER-מיטוכונדריה ללא ביטוי יתר של חלבון. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימלי המבוסס על שימוש במבחן קשירת קרבה באתרו כדי לדמיין ולכמת אינטראקציות ER-מיטוכונדריה אנדוגניות בתאים קבועים על ידי שימוש בסמיכות בין חלבונים של הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית (VDAC1) ושל קרום ה-ER (IP3R1) בממשק ה-MAM. ניתן לבצע ניסויי קשירת קרבה דומים באתרם גם עם זוגות הנוגדנים GRP75/IP3R1 ו-cyclophilin D/IP3R1. בדיקה זו מספקת מספר יתרונות על פני הליכי הדמיה אחרים, מכיוון שהיא ספציפית מאוד, רגישה ומתאימה לבדיקות מרובות מצבים. לכן, השימוש בבדיקת קשירת קרבה זו באתרה אמור להועיל להבנה טובה יותר של התקנות הפיזיולוגיות של אינטראקציות ER-מיטוכונדריה, כמו גם את תפקידן בהקשרים פתולוגיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה reticulum endoplasmic (ER) אינה אברונים עצמאי בתא, אבל הם פועלים מבניים והן מבחינה תפקודית באתרי קשר המוגדרים ממברנות reticulum endoplasmic הקשורים המיטוכונדריה (MAM). למעשה, MAMs מתאימות באזורים שבהם קרום של ER ו המיטוכונדריה apposed מקרוב, המאפשר אינטראקציות בין חלבונים משני הצדדים. עם זאת, את הקרומים של אברונים אלה אינם מתאחים בתוך אזורים אלה, כך שהם שומרים ישויות נפרדות שלהם. MAMs לשחק תפקיד מכריע סידן (Ca 2 +) והעביר פוספוליפידים מ ER מיטוכונדריה, המשפיע חילוף אנרגיה ותא הישרדות 1-3.

העמותה בין ER ואת המיטוכונדריה היה דמיינו לראשונה בשנות ה -1970 עם מיקרוסקופ אלקטרונים. מאז, מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים 4,5, טומוגרפיה אלקטרון 6,7 או חיסוני לוקליזציה של fluorophore ER ואת המיטוכונדריה ספציפיs / חלבוני ניאון 8 שימשו קלאסי ללמוד אינטראקציות ER-המיטוכונדריה. כלי שימושי נוסף לניתוח MAM מבוסס על השימוש חלוק subcellular. זה מאפשר בידוד של שברים MAM ידי ultracentrifugation ההפרש מצמידים את שיפוע Percoll 9. עם זאת, המוצר הסופי מכיל שברי MAM מועשרים, ולא שברים טהורים. בסך הכל, האסטרטגיות אלה אינן רגישות במיוחד ו / או כמותית, והם לא מקובל בקלות הקרנה גדולה. לחלופין, גישות גנטיות באמצעות linkers הבין-אברון ניאון סמים מושרה צמחו, אבל הם אינם מאפשרים ניתוח של אינטראקציות אברון ברמות ביטוי אנדוגני של חלבונים 10.

בהתבסס על תגלית של Szabadkai של המתחם IP3R / GRP75 / VDAC בבית MAM 11, פיתחנו שיטה כמותית לנתח אינטראקציות ER-המיטוכונדריה. השתמשנו ב ligati הקרבה באתרועל assay כדי לזהות ולכמת אינטראקציות בין VDAC1 ו IP3R1, שני חלבונים אברון-משטח מעורב במתחם -channeling Ca 2+ על הממשק MAM בתאים קבוע 12. בקצרה, העמקנו VDAC1 על קרום המיטוכונדריה החיצוני (עכבר אנטי VDAC1 נוגדן ראשוני) ו IP3R1 על הממברנה ER (ארנב נוגדן ראשוני נגד IP3R1) (איור 1, לוח א '). לאחר מכן, על פי assay, הוספנו שני אנטי עכבר IgG נגד ארנב (עכבר בדיקות assay קשירת ארנב קרבה), אשר מצומדות כדי רחבות oligonucleotide משלימות. אם שני החלבונים הממוקדים הם במרחק מתחת ל -40 ננומטר, oligonucleotides יכול להכליא עם oligos מחבר הנוסף לאחר מכן לאפשר את היווצרות של תבנית ה- DNA מעגלי (איור 1, לוח ב '). מולקולת הדנ"א חוזר זה ligated מוגבר, יצירת מוצר דנ"א חד-גדילי המצורפת קוולנטית לאחד חלליות הקרבה (איור 1, ג פאנל) 6 ננומטר, קשירת הקרבה והגברה ניתן לעשות, מה שמוביל לגילוי הבאים עקב הכלאה של בדיקות oligonucleotides אדום שכותרתו טקסס (איור 1, פאנל ד ). נקודה פלורסנט מייצגת אינטראקציות בין VDAC1 / IP3R1, ובכך מאפשר כימות של באתרו ER-המיטוכונדריה אינטראקציות בתאים בודדים.

figure-introduction-1
איור 1: איור סכמטי של איתור של endoplasmic אינטראקציות reticulum-המיטוכונדריה ידי ב assay קשירת Situ קרבה. א) נוגדן עכבר עיקרי המכוון נגד VDAC1 ו נוגדן ראשוני ארנב המכוון נגד IP3R1 יכול להיקשר אפיטופים שלהם בסמיכות בממשק MAM, ב) התוספת של זוג חלליות קשירת קרבהמכוון נגד עכבר IgG ארנב. בדיקות אלה יש מצורפות גדילי דנ"א שיכול ליצור תבניות עבור קשירת oligos מחבר. ג) גדיל DNA המעגלי שיקום לאחר הקשירה יכול להיות מוגבר ו ד) מדמיין ידי מיקרוסקופ כנקודת פלורסנט באמצעות oligonucleotides האדום שכותרתו טקסס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דומה בניסויים assay קשירת הקרבה באתרו ניתן לבצע עם זוג GRP75 / IP3R1 של נוגדנים, כמו גם cyclophilin D (CypD) / נוגדנים IP3R1, בהתחשב בכך CypD הוצגה אינטראקציה עם מורכבות IP3R / GRP75 / VDAC בממשק MAM 12-14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת פתרונות

  1. הכן 10 פורמלדהיד% ב PBS (מלח נמוכה) על ידי דילול 5.5 מ"ל של פורמלדהיד 37% ב 14.5 מ"ל של PBS. הכן 1 M גליצין, pH 8.0, על ידי המסת 3.8 גרם של גליצין ב 50 מ"ל של PBS; לדלל את הפתרון הזה כדי לקבל גליצין 100 מ"מ 1x PBS.
  2. כן 0.1% Triton-X100 ב 1x PBS. כן 20x המלוח סודיום ציטראט (SSC) באמצעות 3.0 M נתרן כלורי 0.30 M ציטראט Trisodium ערוך חיץ מים ללא יונים עם pH 7.0 במהירות של 25 ° C. לדלל חיץ זה ל X 1 ו 0.01x באמצעות מים ללא יונים.

קיבוע 2. של תאים

הערה: השתמשנו הקו הסלולרי HuH7 hepatocarcinoma במחקר זה, אך שיטה זו ישימה בתרביות תאים חסידות אחרות.

  1. פלייט תאי HuH7 (בתרבית גלוקוז DMEM 1 גר '/ ל, בתוספת 10% עוברי עגל בסרום 0.01% מניות פניצילין, סטרפטומיצין) ב 150,000 תאים לכל צלחת זכוכית תחתונה בגודל 35 מ"מ ללא ציפוי. כשעובד על תא ראשוניתרבויות, משתמשים מנות מצופות קולגן.
  2. למחרת, להסיר את המדיום לתרבות. שוטפים את התאים עם 1 מ"ל של PBS ואת לשאוב. תקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של פורמלדהיד 10% ו דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) תחת תסיסה.
  3. עצור את התגובה עם 1 מ"ל של 1 M גליצין ומערבבים ידי סיבוב. הסר את הפתרון התגובה להפסיק לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 1x PBS; להתסיס ידי סיבוב לשאוב. הוסף 1 מ"ל של 100 מ"מ גליצין לתאים דגירה אותם במשך 15 דקות ב RT תחת תסיסה, ולאחר מכן לשאוב.
    הערה: הפרוטוקול ניתן לעצור כאן ואת הצעדים הבאים יכולים להידחות ליום אחר. במקרה זה, להוסיף 1 מ"ל של 100 גליצין מ"מ ולשמור על 4 מעלות צלזיוס, אם יהיה צורך בכך.

3. Permeabilization של תאים

  1. הוסף 1 מ"ל של 0.1% Triton-X100 ב PBS 1x, דגירה במשך 15 דקות ב RT תחת תסיסה, ולאחר מכן לשאוב. זמן דגירה זה יכול להיות מוגבר עד 15 - 20 דקות, כאשר עובדים על cultur תא הראשוניes (למשל, hepatocytes עכברים העיקרי). שוטפים את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 1x PBS; לשאוב.

4. חסימה

  1. הוסף 40 μl של פתרון לחסימת מדגם זה (המסופק על ידי בערכה); נפח זה יכול להיות מוגבר על מנת לכסות את המדגם. דגירת המנות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא לחות.
  2. הקש את פתרון חסימת הנחה של המנות. נסה להשיג כרכים שיורית שווים עבור כל שקופית, מאחר שהדבר ישפיע על שחזור. אל תתנו דגימות להתייבש!

5. נוגדנים ראשוניים

  1. לדלל את הנוגדנים הראשוניים ב 1x PBS ולהוסיף פתרון המנות (נוגדן עכבר VDAC1: 1/100, נוגדן ארנבת IP3R1: 1/500). לחלופין, נוגדני GRP75 או CypD (נוגדני העכבר הן השתמשו ב 1/500) יכולים לשמש במקום VDAC1.
  2. דגירת הלילה בתא לחות ב 4 ° C.. שטפו את השקופיות פעמיים באמצעות טריס בופר עם 0.01% Tween (TBS-T).
6. בדיקות Assay קשירת הסמיכות

  1. בדיקות assay קשירת סמיכות ניתנות על ידי ההערכה. בחר בדיקות על פי המין של נוגדנים ראשוניים.
  2. הכן את בדיקות assay קשירת שתי הקרבה 1: 5 ב diluent נוגדן. אפשר לתערובת לשבת במשך 20 דקות ב RT. מוסיף את פתרון בדיקת assay בדילול קרבת קשירה. דגירה מנות בתא לחות מחומם מראש עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. לשטוף את הכלים פעמיים עם-T TBS.

7. קשירה

  1. השתמש ב מגיב איתור באתרו ערכת אדום טקסס.
  2. לדלל את המניות קשירת 5x (המסופקים על ידי בערכה) 1: 5 במים טוהר גבוהה ומערבבים היטב. לדלל את האנזים בפתרון קשירת 1x (המסופק על ידי בערכה) 01:40 ו מערבולת. חכה להוסיף את האנזים עד שהערב בנוסף הדגימות.
  3. הוסף פתרון זה מדגם זה (40 μl עבור מנות זכוכית תחתונה בגודל 35 מ"מ) דגירה את השקופיות צ'אם לחות מחוממת מראשבער במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. שטפו את השקופיות פעמיים עם-T TBS.

הגברה 8.

הערה: היזהר, ריאגנטים רגיש לאור.

  1. לדלל את מניות הגברת 5x (המסופקות על ידי בערכה) 1: 5 במים טוהרים גבוהה. הסר את פולימראז מהמקפיא באמצעות לחסום הקפאה (-20 ° C). לדלל את פולימראז (המסופק על ידי בערכה) 1:80 בתמיסת מערבולת הגברת 1x. מוסיפים את פולימראז מיד לפני השימוש בתערובת.
  2. הוסף פתרון זה מדגם זה (40 μl עבור מנות זכוכית תחתונה בגודל 35 מ"מ). דגירה השקופיות בתא לחות מחומם מראש ל -100 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. קש פתרון הגברה-פולימראז ההנחה של השקופיות.

כביסה 9. סופי

  1. שטפו את השקופיות כביסה חיץ 1x SSC למשך 2 דקות. שטפו את השקופיות חיץ כביסה SSC 0.01x למשך 2 דקות. תנו את הכלים לייבוש ב RT בחושך.

הכנת 10. הדמיה

  1. הר השקופיות באמצעות בהיקף מינימאלי של הרכבה בינונית המכילים DAPI (מימי לא לחזק), להבטיח כי אין בועות אוויר להיתפס תחת להחליק את המכסה. ניתן להשתמש לק כדי לאטום את הקצוות. חכה כ -15 דקות לפני הניתוח באמצעות קרינה או מיקרוסקופ confocal (עירור: 594 ננומטר, פליטה: 624 ננומטר, גדלה: 63X).
  2. לאחר הדמיה, אחסן את השקופיות ב -20 ° C בחושך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתבסס על הניסיון שלנו באמצעות פרוטוקול זה, אנחנו יכולים בבטחה ממליצים על שיטה זו עבור להדמיה וכימות של אינטראקציות ER-המיטוכונדריות בתאים קבועים. נציג תמונות של באינטראקציות ER-המיטוכונדריה assay-דמיינו קשירת הקרבה באתרו הקו הסלולרי HuH7 hepatocarcinoma, באמצעות כמה זוגות של נוגדנים, מוצגים. כפי שניתן לראות בתרשים 2 על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כל נקודה אדומה מייצגת אינטראקציה בין שני החלבונים ממוקדים, גרעינים מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באופן קולקטיבי, המחקרים שלנו מצביעים על כך שבדיקת קשירת הקרבה באתרה היא באמת אסטרטגיה רלוונטית לעקוב ולכמת אינטראקציות ER-מיטוכונדריה אנדוגניות בתאים קבועים, ללא צורך בשימוש בפלואורופורים ספציפיים לאברונים או חלבונים פלואורסצנטיים. השימוש הספציפי בנוגדנים VDAC1/IP3R1 הותאם לחקר אינטראקציות ER-מיטוכונדריה בתאי HuH7. עם זאת, ניתן להשתמש באיזופורמים חלופיים של VDAC ו-IP3R, בהתאם לסוג התא. במקרה זה, יש לאמת נוגדנים על ידי אימונופלואורסצנציה לפני ניסויי בדיקת קשירת הקרבה על מנת להבטיח ספציפיות ולמצוא את דילול העבודה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לכל האנשים במעבדה שלנו שתרמו לייעל ולאמת את הפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי INSERM ואת סוכנות המחקר הלאומי (ANR-09-JCJC-0116 ו ANR-11-BSV1-033-02). ET נתמכה במהלך הדוקטורט שלה על ידי מענק מחקר מהמשרד הצרפתי של השכלה גבוהות ומחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פורמלדהידסיגמאF-8775
גליציןסיגמאG-8898
טריטוןסיגמאT8532
35 מ"מ כלי תרבית תחתית זכוכיתתאגיד MatTeKP35G-0-14-C
תמיסת חסימהסיגמאDUO-92004 או DUO-92002המסופקים בבדיקות Duolink PLA, נוגדן Sigma
VDAC1נוגדן Abcamab14734
IP3R1-H80סנטה קרוזsc28614
נוגדן CypDAbcamab110324
Grp75 נוגדןסנטה קרוזsc13967
TBS 10xeuromedexET220לדלל כדי להשיג 1x
Tween 100xeuromedex2001-Bלדלל ב-TBS כדי להשיג 0,01%
עכבר בדיקות PLA MINUSSigmaDUO-92004Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUSSigmaDUO-92002Duolink, Sigma
Duolink ריאגנטים לזיהוי אדוםSigmaDUO-92008Duolink, תמיסת קשירת סיגמא
SigmaDUO-92008חלק מהריאגנטים לזיהוי Duolink אדום, Sigma
LigaseSigmaDUO-92008חלק מריאגנטים לזיהוי Duolink אדום,
פתרון הגברהסיגמא סיגמאDUO-92008חלק מריאגנטים לזיהוי Duolink אדום, סיגמא
פולימראזסיגמאDUO-92008חלק מריאגנטים לזיהוי Duolink אדום, Sigma
Duolink הרכבה בינוניתסיגמאDUO80102Duolink, סיגמא
<חזק>תוכנה
איתור כתמיםBlobFinder היא תוכנה המופצת באופן חופשי שיכולה לבצע חישובים על תאים מתמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. ניתן להוריד תוכנה זו בחינם מהמרכז לניתוח תמונות באוניברסיטת אופסלה שפיתחו את התוכנה והעבודה נתמכה על ידי פרויקט FP6 של האיחוד האירופי ENLIGHT ו-Olink Bioscience. תוכנת
http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm ImageJניתנת להורדה בחינם מ: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
של תוכנת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
  2. Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
  3. Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
  4. Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169(2012).
  5. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
  6. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
  7. Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
  8. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
  9. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
  10. Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
  11. Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
  12. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
  13. Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
  14. Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
  15. Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
  16. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. , (2016).
  17. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
  18. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
  19. De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
  20. Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VDAC1 IP3R1Proximity Ligation AssayGRP75 IP3R1Cyclophilin D IP3R1

מאמרים קשורים