מחקר השוואתי של שיטות שיגור תרופות אל האוזן הפנימית עכבר: Bullostomy Versus הזרקת Transtympanic

סיכום

שתי גישות מיקרו-כירורגיות להעברת תרופות מקומיות לאוזן הפנימית מתוארות כאן ומושוות במונחים של השפעה על פרמטרי שמיעה, ציטוארכיטקטורה של השבלול וביטוי סמנים דלקתיים.

תקציר

אנו מציגים שתי טכניקות מיקרו פולשנית במכרסמים למסירה תרופה ספציפית לתוך האוזן התיכונה, כך שהוא עשוי להגיע אל האוזן הפנימית. ההליך הראשון מורכב ניקוב של הבולה התוף, כינה bullostomy; והשני הוא הזרקת transtympanic. שניהם לחקות נהלי intratympanic קליניים בבני אדם.

Chitosan-glycerophosphate (CGP) חיץ לקטט Ringer's (RL) שמשו כלי רכב ביולוגי למסירת סמים מקומית. CGP הוא פולימר מתכלה רעיל בשימוש נרחב ביישומי תרופות. זהו נוזל צמיג ב RT אבל זה נקרש לשלב מוצק למחצה בטמפרטורת הגוף. RL הוא פתרון איזוטוני המשמש ממשלים תוך ורידים בבני אדם. נפח קטן של הרכב הזה מושם דווקא על החלון העגול (RW) הנישה באמצעות bullostomy. זריקת transtympanic ממלאת את האוזן התיכונה ומאפשרת שליטה פחות אבל גישה רחבה יותר אל האוזן הפנימית.

s = "jove_content"> פרופילי הבטיחות בעבודה של שני הטכניקות נחקרו ומשווים באמצעות בדיקות פונקציונליות וצורניות. שמיעה הוערכה על ידי רישום בדיקת ABR (ABR) לפני וכמה פעמים לאחר המיקרו-כירורגיה. רמת cytoarchitecture ושימור מבני שבלול נחקרה על ידי טכניקות היסטולוגית קונבנציונליות בדגימות שבלול paraformaldehyde-קבוע decalcified. במקביל, דגימות שבלול מבולבלות נלקחו ומייד קפוא לנתח פרופילי ביטוי גנים של סמנים דלקתיים על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותיים הופך transcriptase (qRT-PCR).

שני התהליכים מתאימים כמו שיטות משלוח סמים לתוך האוזן התיכונה העכבר, למרות הזרקת transtympanic התבררה פחות פולשני לעומת bullostomy.

מבוא

ליקוי שמיעה הוא הגירעון חושי האדם השכיח ביותר ומשפיע 5.3% מאוכלוסיית העולם, ו -30% מהאנשים מעל גיל 65 ( http://www.who.int/topics/deafness/en , עודכן 2016). אובדן שמיעה משפיע רכישת השפה אצל ילדים ומאיץ ירידה קוגניטיבית אצל אנשים מבוגרים. לכן, זו בעיה משמעותית בריאות עם השפעת סוציו-כלכלית עצומה. זה יכול להיגרם על ידי פגמים גנטיים, גורמים סביבתיים או שילוב של שניהם ^1, אשר בסופו של דבר לגרום נזק ומוות של תאים שיער נוירונים שבלול. תאים אלה לא להתחדש ביונקים, ולכן אובדן הסלולר אובדן שמיעה במקביל לא יכול להיות הפוך. אפשרויות קליניות מבוססות על פרוטזות, לרבות מכשירי שמיעת שבלול, אוזן תיכונה שתל עצם הולכה ^2. למרבה הצער, אין בגיד משקם רפואי ספציפיtments עבור ליקוי שמיעה ולכן קווי מחקר מספר מתמקדים בפיתוח טיפולים מניעתיים ותיקון. אופציות טיפול חדשניות כוללות גני טיפולים בתאים כמו גם פיתוח של מולקולות קטנות לטיפול תרופתי ^2.

אחד האתגרים החשובים ביותר בטיפול תרופתי שבלול הוא משלוח סמים. טיפולים מערכתיים מוגבלים יעילים השבלול בשל מחסום הדם-מבוך ^3, האנדותל רציף במגע עם כלי דם שבלול, אשר ממשמש כמחסום פיזי ביוכימיים לשמור על הומאוסטזיס נוזל באוזן פנימי, ולכן להגביל מעבר סמים אל האוזן הפנימית. זה מחלחל רק למולקולות liposoluble קטנות, למרות חדירות ניתן להגדיל במהלך דלקת שבלול, וגם עם השימוש במשתנים או סוכנים האוסמוטי. היקף התרופה שבסופו של דבר מגיעה השבלול לאחר מתן מערכתי מצטמצם;ולכן, מינונים גבוהים שעלולות לגרום לרעילות אורגנית נדרשים. בנוסף, מטבוליזם בכבד של התרופה יכול לייצר מטבוליטים רעילים או פעילים ^{4, 5, 6, 7.} לעומת זאת, התערבויות מקומיות לאפשר ההכנסה של כמות מוגבלת ידועה של התרופה לתוך האוזן התיכונה או פנימית ללא תופעות לוואי לא רצויות ^{4, 7, 8, 9.} בפרקטיקה הקלינית הנוכחית, הממשלים intratympanic מוגבלים פתולוגיות שבלול מסוימים, כגון גנטמיצין במחלת מנייר ^10, סטרואידים ב חירשות פתאומית, מחלת מנייר, החיסון בתיווך ואיבוד שמיעה הרעש הנגרם, ^{11, 12, 13, 14, 15} ו גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF1) ב חירשות פתאומית ^{4, 16, 17.}

פורמולציות עבור ממשל מקומי צפוי להישמר הומאוסטזיס העדין (pH ו osmolarity) של נוזלי שבלול. בנוסף, זה מאוד חשוב לשמור על סטריליות בכל התהליך כדי למנוע זיהום החיידקים של הנוזל השדרתי. החומר לא הפעיל המשמש משלוח סמים צריך להיות ביולוגי, nonototoxic ושל העקביות המתאימה. פתרונות נוזלים המומלצים זריקות intracochlear, אך אינם מתאימים מסלול intratympanic בשל הפינוי דרך חצוצרת השמע. במקרה זה, תרופות בדרך כלל מבוצעות על ידי ג'לים חצי מוצק להגדיל הקביעות שלהם באוזן התיכונה ^{4, 18, 19.} syste משלוח אלטרנטיביms לשמש נשאים להגדיל את המעבר של התרופה לאוזן הפנימית הם חלקיקים ²⁰ adenoviruses ²¹ הנה השווינו שתי מכוניות: CGP ופתרון RL. CGP הוא הידרוג'ל נוצר על ידי chitosan, פוליסכריד ליניארי מורכב D-גלוקוזאמין ו- N-acetyl-D-גלוקוזאמין המתקבל פגזים סרטנאים, ו β-glycerophosphate, polyol המהווה מגן מים ברחבי שרשראות chitosan ושומר אותו בצורה נוזלת. CGP הוא thermosensitive ויכול להיות מושפל על ידי lysozymes, המאפשר שחרור תרופה מתמשך באוזן התיכונה ^{22, 23, 24, 25.} הידרוג Chitosan-הבסיס הם כלי רכב מתאימים ליישומים קליניים כגון משלוח סמים בשל חוסר חיסוני וחוסר ההפעלה של תגובות דלקתיות מקומיות ^{23, 24.} על othיד אה, חיץ RL הוא פתרון איזוטוני הלא pyrogenic (273 mOsm / L ו- pH 6.5) מיועד עירוי לוריד בבני אדם כמקור מים ואלקטרוליטים, במיוחד איבוד דם, טראומה או לשרוף פציעות בגלל תוצרי לוואי של חילוף החומרים לקטט בכבד לנטרל חמצת.

כאן אנו מתארים ולהשוות שתי שיטות כירורגיות אשר שוכללו למסירת סמים מקומית לאוזן העכבר הפנימית. פרופיל הבטיחות של שתי הטכניקות הוערכה באמצעות בדיקות פונקציונליות, מורפולוגיים ומולקולריים. שמיעה הוערך באמצעות בדיקת ABR (ABR) ^{26, 27} ביצע לפני ואחרי המיקרו-כירורגיה בזמנים שונים. נהלים נקודת הסיום שימשו לנתח שבלול ולהשוות את ההשפעה אנטומיים, תאית ומולקולרית של שני הליכים מיקרו אלה.

פרוטוקול

ודא כי נהלי הטיפול בבעלי החיים הם בהתאם לתקנות בינלאומיות ולאומיות. הפרוטוקול כדלקמן קהילת אירופה 2010/63 / EU וספרדית RD 53/2013 הנחיות, בהתאמה.

1. טיפול בבעלי חיים כללי

1. עכברי Feed כרצונך מודעה עם תזונה סטנדרטית ומי שתייה. בקרה בריאות ורווחה ידי ביצוע הפדרציה של איגודי מדע בעלי חיים מעבדה (FELASA) המלצות.

הערכת שמיעה 2.

הערה: השפעה פונקציונלית מסלול של נהלי מייקרו ידי שמיעת בדיקות לפני ופעמים רבות לאחר הניתוח (בעבודה 2 זו, 7, 14 ו -28 ד postmicrosurgery) לנהלים פולשני כגון ABR ^9.

1. עבור בדיקות ABR, להרדים עכברים עם פרוטוקולי אפקט זמן קצר כלומר זריקה intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / ק"ג משקל גוף (BW) ו xylazine (10מ"ג / ק"ג, BW). לחלופין, לבצע בדיקות שמיעה בהרדמה נשימתית.
   הערה: מאז פרמטרי ABR יכולים להיות מושפעים על ידי פרוטוקול הרדמת ^28, להשתמש באותו אחד לאורך הניסוי.
2. בדוק את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הבוהן קמצוץ.
   הערה: כאשר רפלקס הנסיגה נעלם, החיה הגיעה לעומק מתאים של הרדמה לבצע בדיקות שמיעה.
3. להגן על העיניים מפני התייבשות ו sicca keratoconjunctivitis משני מורכב בידי ממשל אקטואלי של תוסף מדמיע, כגון ג'לים methylcellulose המבוסס Hydroxypropyl.
4. שמור את העכבר בטמפרטורה פיזיולוגית (37.5-38 מעלות צלזיוס) במהלך ההליך כולו. כדי למנוע הפרעות חשמליות, להשתמש רפידות משאבה וחימום מים חמות. מעקב אחר טמפרטורת גוף עם בדיקות רקטלית. תמיד לדאוג שלא לחמם יותר מדי את בעל החיים.
   הערה: אנו ממליצים לנקות את כרית החימום עם חומר חיטוי פנים בין עכברים.0; לזירוז והתאוששות הרדמה, כריות חימום חשמלי, ליבון או נורות אינפרא אדום יכול לשמש.
5. הליך ABR
   הערה: לפרטים והרשמה ABR, להשתמש עבודה מחשב עם כרטיס קול inboard ליצור צורות גל (דיגיטלי אנלוגיים, פלט DA, המרה) לספרת גל בתגובה חשמלי (אנלוגי קלט דיגיטלי, AD), גידול מחליש, אוסצילוסקופ ו מגבר נמוך עכבה. תחנות עבודת שמיעה מודרנית (כלומר טאקר דייויס techonologies) כוללים את כל המרכיבים הללו במערכת קומפקטית אחת.
   1. מניח את העכבר הרדים אפרקדן על כריות החימום בתוך תא הפחתה-קול, כדי למנוע הפרעת רעש סביבה והדהוד (איור 1).
   2. לספק גירויים אקוסטיים לתוך תעלת השמע החיצונית. השתמש גירויים מראש או אותות חדשים נועדו עם התוכנה המתאימה. חברו את יציאת תחנת עבודה DA לרמקול שנבחרו.
      הערה: Freדואר שדה או רמקולי שדה סגור המוכנסים בתוך תעלת השמע החיצונית יוכל לשמש. לשעבר עדיפים כשעובדים עם עכברים בשל הקושי בהכנסת בדיקה וכיול קול במערכות סגורות. רמקולי שדה חינם לעורר בשתי האוזניים ואת לעורר תגובת binaural. כדי לקבל תשובות מונו בעיקר עם רמקולים חופשי בשטח, פעילות נגדית צריכה להתבטל על ידי חסימה (כלומר עם אטמי אוזניים) או על ידי מיסוך הרעש.
      1. מניח דובר-שדה חופשי ממרחק קבוע (בדרך כלל 5-20 סנטימטר) מול הראש או אוזניים נבחרות עם המרכז של הדובר מיושר עם תעלת השמע החיצונית. ודא שאף מכשולים הם בין הדובר לבין האוזן וכי הפינה נפתחה לחלוטין.
   3. מניחים אלקטרודות מחט subdermal נירוסטה כדלקמן: א) אלקטרודה פעיל (חיובי) של הקרקפת בין האוזניים (מעל הקודקוד של הגולגולת), ii) את ההתייחסות (האלקטרודה השלילית), בתוך הפרוטידבאזור מתחת הפינה, ו- III) אלקטרודה הקרקע בחלק אחורי, הזנב או אחורי באזור האיבר (איור 1).
      1. בדוק את העכבה החשמלית של אלקטרודות חיוביות ושליליות. ודא כי העכבה היא פחות מ -3 kOhm (רצוי 1 kOhm). אם היא גבוהה, למקם, נקי עם אלכוהול או להחליף את האלקטרודות.
   4. להקלטת ABR, ליצור קליקים בפס רחב ובתדירויות צליל טהור ונכחו הפחתת עוצמות מן 90 ל -10 dB ביחס לרמת לחץ קול (SPL) ב 5-10 dB SPL שלבים ^{27, 29, 30.}
      1. קליק הקצר הנוכחי או הטון פרץ גירויים (1-5 ms) החל ברמה גבוהה (כלומר 80 או 90 dB SPL) והפחתת עוצמת בצעדים SPL 5-10 dB. רשום את התגובה החשמלית ב -10 מילי-שניות הראשונות לאחר גירוי (עורר תגובות ABR להופיע 6-8 ms).
         הערה: מסיבה זו, שיעורי גירוילא צריך להיות גבוה מ -50 גירויים / s (שיעור רגיל 20-50).
   5. להגביר, להקליט את הממוצע של התגובה החשמלית עורר לכל גירוי ועוצמה. השתמש מגבר עם רעש נמוך יחס אות לרעש טוב, ולחבר אותו לכניסה לספירה.
      יש ABRs אמפליטודות נמוך מאוד, בדרך כלל מתחת ל -1 מיקרו-וולט (שיא-לשיא) וחייבים להקליט באמצעות מגבר עם רעש נמוך מאוד: הערה. בעכברי שמיעה נורמלים, גלי ABR ברורים שקמו אחרי הממוצע של 100 - 200 תגובות, אולם כדי להשיג הקלטות באיכות גבוהות, או במקרה של ליקוי שמיעה, חזרות יותר מומלצות (750-1,000) ^27.
   6. מבחינה ויזואלית לקבוע סף ABR במהלך הבדיקה.
      הערה: סף ABR היא עוצמת גירויי קול הכי הנמוכה כי מעורר ABR אמין הקלטה עם גלי I עד IV נראה בבירור ובינוני שיא-לשיא מתח 2 SD מעל פעילות הרקע הממוצעת ^31. נתונים אלה כדי להיות מאושרים duoff-line לצלצל ניתוח, יחד עם פרמטרים אחרים, כולל חביון שיא interpeak, ולנופף אמפליטודות.
   7. ביצוע ניתוח נתונים באופן ידני או אוטומטי.
      1. לקבלת ניתוח ידני, לזהות 4-5 גלי ABR (I, II, III ... וכו.) ולסמן את פסגות (P1, P2, P3 ...) ועמקים (N1, N2, N3 ...) עבור כל גל. לאחר הניתוח הושלם, יצוא נתונים גיליון אלקטרוני או קובץ טקסט.
         הערה: תוכנה ספציפית עבור הקלטת תגובה חשמלית בדרך כלל מבצעת את הניתוח באופן אוטומטי. ניתן לקבוע מדידות נוספות בהקלטה ABR בתגובה בעוצמה קבועה (כלומר 70 או 80 dB SPL) או בעצימויות ביחס ספי קליק (כלומר 15 dB SPL על הסף).
6. ביצוע ניתוח סטטיסטי של נתוני ABR באמצעות התוכנה המתאימה. בהתאם לעיצוב ניסיוני, תקן שימוש לזווג T-test או ניתוח שונות (ANOVA) כדי להשוות parame ABR הראשיters בקרב הקבוצות השונות ^{26, 30.}
   הערה: מחקרים ארוכים טווח, רבי נתונים תפקודיים נאספים מאותו החיה בנקודות זמניות שונות (כלומר לפני ואחרי המיקרו-כירורגיה). במקרה זה, מבחן אמצעי ליניארי כללי חזר מודל מספק ניתוח פערים מפורט.

3. הכנת רכב

1. הכן ולהשתמש בפתרונות רכב בתנאים סטריליים.
   הערה: פתרונות נוזלי בדרך כלל נמחקים במהירות דרך חצוצרת השמע. מערכות משלוח בזריקות שונות יכולות לשמש כדי להאריך את משך זמן מגורים של התרופה באוזן התיכונה, כולל הידרוג חלקיקים ^32.
   1. כדי להכין-הידרוג'ל CGP, לפזר 75% chitosan deacetylated בחומצה 0.2 M אצטית מניב פתרון chitosan 1.5-2% (wt / wt). הוסף 9% glycerophosphate (wt / wt) לפתרון ⁷ זה. הכן את הפתרוןרק לפני מתן ולאחסן את הידרוג'ל ב 4 ° C עד השימוש.
      הערה: The-הידרוג'ל CGP הוא בינוני צמיג אבל עדיין בזריקות בטמפרטורה זו. מתחת ל -4 מעלות צלזיוס הוא משתנה בשלב מוצק, חסימה בבקשתו. לאחר יישום, CGP עובר המעבר לשלב כדי ג'ל חצי מוצק בתוך כ -15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
   2. Aliquot (0.5 מ"ל) חיץ RL מסחרי ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש.

4. נהלים Microsurgical

1. להשרות הרדמה כללית עם שילובים מבוסס קטמין של תרופות הרגעה ומשככי כאבים (מ"ג כלומר קטמין 100 / ק"ג, medetomidine 0.05 מ"ג / ק"ג phentanile 0.025 מ"ג / ק"ג) על ידי הזרקת intraperitoneal, ואחריו סוכנים נשימתית (isoflurane כלומר).
   1. לאחר מתן סוכנים להזרקה, להתאים את facemask הרדמה אל חוטם העכבר ולחבר את אספקת O ₂ אדי isoflurane. לשמור על הרדמת משאיפת במהלךהמיקרו-כירורגיה ולנטר את המטוס הרדמה עם רפלקס הבוהן קמצוץ דפוס הנשימה. בגין הכנת כירורגית כאשר רפלקס הוא בוטל לחלוטין והעכבר מציג נשימות קצובות.
   2. לשמור על טמפרטורת גוף עם כריות חימום במהלך ההליך כולו להגן על העיניים מפני דלקת קרנית קרנית עם ג'ל methylcellulose המבוסס Hydroxypropyl.
2. כן אזור ניתוח נקי באמצעות בסדינים מעוקרים. לעקר את מכשירי מיקרו עם מעקר חרוזי זכוכית לפני הניתוח. לשמור על תנאים סטריליים במהלך ההליך הכירורגי כולו (כפפות סטריליות, וילונות, מכשירי ניתוח, וכו ').
3. microsurgery
   1. Bullostomy
      הערה: Bullostomy היא הליך חד-צדדי. Operate אוזן אחת על העכבר ולהשתמש האוזן הנגדית כמו השליטה.
      1. מניחים את העכבר במצב שכיבה משכוב. מכין את אזור הניתוח על פני שטח הגחון של הצוואר באמצעות קוצץ כדילהסיר את הפרווה. נקו את העור עם פתרון חיטוי מבוסס יוד povidone, ולכסות אותו בסדינים מעוקרים.
      2. באמצעות אזמל, לעשות חתך אורכי 2 ס"מ מן הלסת התחתונה אל עצם הבריח.
      3. תחת גדלה עם מיקרוסקופ כירורגי, לזהות את בלוטות submandibular ולהפריד הוא עם מלקחיים. לחזור בו בלוטות submandibular בתרגום המקור של השריר הדו-בטנים ואת עצב הפנים.
      4. עושה חתכו את מקורו של השריר הדו-הבטנים עם מספריים, ו לחזור בו ventrally, חשיפת ההיבט נח-המדיאלי הבסיסי של בולת התוף.
      5. נתן פתיחה בולה ידי קידוח לתוכו עם מחט 27 G (איור 2 א). למקם את עורק stapedial ואת זנב קרום RW אליו (איור 2 ב). לנקות את הדם מאזור הקדח עם ספוג הג'לטין נספג.
      6. באמצעות קטטר 34 G ומזרק מיקרו זכוכית, לאט להזריק 3-5 μL של פתרון הרכב (CGP-הידרוג'ל או RL) דרך bullostomy ישירות על נישה RW, ממלא אותו (איור 2 ג). חותם את bullostomy עם 1-2 טיפות של דבק רקמות.
      7. מחזיר את בלוטות submandibular למיקומו ההתחלתי שלהם ולסגור את חתכי עור עם תפר כירורגי 5-0 משי. למרוח חיטוי מבוסס כלורהקסידין סביב החתך כדי למנוע זיהום פצע. הערה: נספגים ותפרים שאינם נספגים יוכל לשמש. תפרים לא נספגים חייבים להסירו ב 2 שבועות. משי אינו מומלץ לסגירת עור מאז השימוש בו קשור לזיהום חתך ותגובות רקמות מקומיות.
   2. הזרקת transtympanic בילטראליים
      1. מניחים את העכבר במצב משכוב לרוחב ולהכין אזור הניתוח מזוהם מתחת meatus השמיעה החיצונית כמתואר 4.3.1.1.
      2. ביצוע חתך אורכי 0.5 ס"מ החלק האנכי של תעלת האוזן החיצונית קרוב tragus ו- sשיקוף הקיפול עורית הפנימי של אפרכסת האוזן (לא חובה).
      3. אתר את עור התוף בסוף תעלת האוזן החיצונית באמצעות מיקרוסקופ כירורגי (איור 2E) ולזהות את pars העליון flaccida ואת pars הנחה Tensa, אשר מחולק למקטעים קדמיים וגם אחוריים באמצעות הידית של "פטיש (איור 2F) .
      4. ערכו myringostomy קטנה בקטע הזנב של flaccida pars. עושים חתך נוסף Tensa pars של עור התוף, כדי לאפשר פינוי אוויר במהלך ההזרקה ^33. בעדינות להזריק 10-15 μL של הרכב (CGP-הידרוג'ל או RL) פתרון עם מזרק מיקרו זכוכית מחובר קטטר 34 G דרך pars flaccida, קרוב נישה RW עד האוזן התיכונה מלא בבירור.
      5. סגור את חתכים בעור עם תפר 5-0 משי כירורגית ונקי כמתואר 4.3.1.7.
      6. מניחים את העכבר על הצד ואת אופר אחרים שלהאכול את האוזן הנגדית (צעדים 4.3.2.1-ל 4.3.2.5).
4. שמור את העכבר על כרית חימום עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. אל תחזרו בעל חיים אשר עבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים עד התאושש לחלוטין.
5. לפקח על מצב הגוף, פעילות ונוכחות של סימנים של כאב או מתח. לספק משככי כאבים לפי הצורך (כלומר עצירות 0.05 מ"ג / ק"ג, Carprofen 5-10 מ"ג / ק"ג). סקור את הפצע כירורגית יומי ולהסיר סגרי עור 7-14 ימים לאחר ניתוח אחרי שאימת כי הפצע הגליד.

5. הערכת מורפולוגי של שבלול cytoarchitecture

1. להרדים את העכבר בסוף הניסוי (ב 28 עבודה זו ימים postmicrosurgery), עם מנת יתר פנטוברביטול הזרקה (100 מ"ג / ק"ג) כדי לחקור את ההשפעות ארוכות הטווח של ניתוח.
2. בצע זלוף transcardial מקור 0.1 M פוספט שנאגרמלוחים (PBS), pH 7.5, ואחריו 4% (wt / v) paraformaldehyde (PFA) ב 0.1 M PBS, pH 7.5 כמתואר ^26.
   זהירות: Paraformaldehyde היא רעילה ביותר; להימנע ממגע עם עור, עיניים או ריריות. הימנע נושם את האבקה במהלך המדידה והכנה.
3. השתמש stereomicroscope כדי לנתח את האוזן הפנימית מן העצם הטמפורלית כמתואר ^{34, 35} ללא הפרדת שיווי המשקל ורכיבי שבלול של האוזן הפנימית.
4. תקן את האוזן הפנימית מבודדת עם 4% (wt / v) PFA ב 0.1 M PBS, pH 7.5 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות עם רעד עדין. 3x לשטוף במשך 5 דקות עם 0.1 PBS M, 7.5 pH.
5. Decalcify דגימות עם 10% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) שהוכנו 0.1 M PBS, 6.5 pH ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 ד עם רעד קבוע, שינוי הפתרון EDTA כל 3 ד.
6. כאשר cochleae לרכוש עקביות רכה, להסיר EDTA לשטוף 3x במשך 5 דקות עם 0.1 M PBS, pH 7.5, Wiה רועד ב RT.
7. הטמע את דגימות פרפין כמו ³⁴ תארו ולעשות 7 מיקרומטר חלקי שבלול עבים במקביל כִּישׁוֹר.
8. כדי להעריך cytoarchitecture שבלול, סעיפי כתם עם haematoxylin ו eosin (H & E) ³⁰ ולהשתמש מיקרוסקופ אור המחוברת למצלמה דיגיטלית כדי ללכוד תמונות עם 4X ו 20X עדשות.

ביטוי 6. השבלול ג'ין

1. נקה את משטח העבודה ואת מכשירי ניתוח עם פתרון טיהור RNase.
2. להרדים את העכבר כמתואר 5.1 ובמהירות לנתח את האוזן הפנימית מן העצם הטמפורלית באמצעות מיקרוסקופ. לטבול את האוזן הפנימית בצלחת זכוכית המכילה חומצה ריבונוקלאית (RNA) מגן מגיב מייצב.
3. הסר את עצם petrous הנותרים עם מלקחי תכשיטים בעדינים להפריד השבלול מהמבואה באמצעות מספרי העין של Vanna ^35.
4. מיד transfאה שבלול לתוך צינור 2 מ"ל microcentrifuge עם 80 μL RNA מגן פתרון מייצב ולהקפיא את הרקמה על ידי הצבת צינור בקרח יבש. שמור על דגימות שבלול ב -70 ° C עד השימוש.
5. לבודד RNA שבלול כמתואר ³⁵ ולקבוע איכות וכמותו spectrophotometrically.
6. צור cDNA שבלול מן הכמויות שווות של RNA עכבר הכולל באמצעות ערכת מסחרי שעתוק לאחור.
7. בצע qRT-PCR כדי להגביר חומצת deoxyribonucleic משלימה (cDNA) בשלושה עותקים למדוד תמלילי גן ^{35, 36.}
   הערה: פרו עבודה זו תעתיקי גנים אנטי דלקתיות של Il1b, Il6, Tgfb1, Tnfa, Il10 ו Dusp1 נמדדו.
8. חישוב יחסי ביטוי יחסיים ידי נרמול סף מחזור תמליל היעד (CT) רמות כדי אריתמטי של רמת גן התייחסות ואת כימות ביחס ידי נרמולקבוצת הבעיה רמות התעתיק אריתמטי של הקבוצה כיל ^37.

תוצאות

שמיעה נבדקה על ידי ABR לפני ובכמה פעמים אחרי המיקרו-כירורגיה כדי להעריך את ההשפעה על תפקוד שמיעתי (איור 1 א). אוגרי ABR בוצעו בהרדמה להימנע חפצי תנועה ומתח חיה ולכן לשפר השחזור שלה ^27. Intraperitoneally מנוהל שילובים מבוסס קטמין או isoflurane inhalatory בדרך כלל הועסקו להרדים חיות במהלך בדיקות ABR. שילוב קטמין / xylazine מספק קצרת טווח (2-3 דקות) אינדוקציה ושלב תחזוקה יציבה, בטוח בעת ביצוע רושמת ABR. יצוין כי isoflurane יכול להשפיע מדידת ABR רגישות ^38. עבור אוגרי ABR, ממוקמות אלקטרודות subdermal במקומות ספציפיים (איור 1B) ואת העכבה החשמלית נמדדת. אם העכבה היא 3 kOhm ומעלה, מיצוב אלקטרודה צריך להיבדק כדי למנוע alterations משרעת הגל ABR.

משלוח Intratympanic מתבצע בעכברים על ידי שני הליכים מיקרו (איור 2). חשיפה של בולה במהלך bullostomy כרוך הכחשה של בלוטות submandibular ו השריר הדו-בטני. הליך זה מתבצע בזהירות רבה כי העורק הראשי ואת עצב מחנק קרוב מאוד (איור 2 א). לאחר מכן, הבולה היא קדחה למקם את עורק stapedial ואת קרום RW (איור 2 ב). כדי למנוע פיצוח העצם, צמצם 0.5 מ"מ קטן נעשה עם מחט 27 G לפני הקידוח. קטטר 34 G מופנה דרך bullostomy כלפי קרום RW ו- נפח קטן של רכב מועבר על נישת החלון (איור 2 ג). זריקת transtympanic מתבצעת באמצעות חתך pars flaccida של עור התוף עם מחט 27 G; אחד גדול יכול לעורר באוזן בקרום. לפני הזריקה, אנו ממליצים לבצע חתך נוסף Tensa pars לאפשר יצוא של אוויר במהלך ההזרקה של הרכב (איור 2F). זה קריטי כדי למנוע נזק של העורק stapedial, סניף של עורק התרדמה הפנימי, מה שיוביל דימום מסכן חיים.

עכברים עם ניתוחי bullostomy או transtympanic נשמרו שמיעה לאורך הניסוי, בדומה בקרות שאינן מופעל (איור 3). ABR ספים בתגובה קליקים ופורצת טון לא השתנו באופן משמעותי לאחר המיקרו-כירורגיה לעומת ערכי בסיס. לא נמצאו הבדלים משמעותיים נצפו בין bullostomy וגישות transtympanic. מחקרים מורפולוגי בוצעו כדי לאשר משלוח רכב נכון לתוך האוזן התיכונה ועל מנת להעריך את השינויים האפשריים הנגרמים על ידי ההליך כלשהו cytoarchitecture שבלול. אף אחד של אזורי השבלול הראשישינויי מורפולוגיים howed וחיות מהניתוחים הציגו מורפולוגיה דומה של כל מבני השבלול (איור 4 א). בנוסף, הפרופילים שבלול עבור ביטוי גנים של ציטוקינים פרו ואנטי דלקתיים גם נחקרו. למרות חוסר ההבדל התפקודי נתונים ABR בין שני ההליכים, bullostomy נגרמת תגובה דלקתית חזקה מאשר הגישה transtympanic (איור 4B).

באיור 1. עיצוב ניסיוני והערכת שמיעה. (א) תרשים של ההליך הניסיון. שמיעה הוערכה עם ABR לפני ואחרי המיקרו-כירורגיה. דגימות שבלול התקבלו 28 ימים לאחר המיקרו-כירורגיה. (ב) עכבר הרדים אפרקדן על כרית חימום בתוך חדר הפחתת-סאונד, עם electrod subdermales להציב הקרקפת בין האוזניים מעל הקודקוד של הגולגולת (פעיל, חיובי); באזור הפרוטיד מתחת פינה (הפניה, שלילי) ו בחלק האחורי (הקרקע). הדובר חינם-שדה מושם במרחק קבוע (5 ס"מ) מול האוזן הימנית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Microsurgery איור 2. ל Application רכב. (א) להציג הגחון של הבולה התוף. Bullostomy מתבצע זנב עצב הפנים עם מחט 27 G. (ב) RWN ועורק stapedial ניתן לצפות דרך הניקוב. (ג) קטטר 34 G מופנה דרך bullostomy אל גומחת RW. (ד) חודש לאחר bullostomy, גרמי קטנההצלקת שוהה באתר הפתיחה (ראש החץ). (E) עם נוף צדדי של האוזן, המראה את חתך בתעלת האוזן החיצונית ועם עור התוף (מרובע). (F) פירוט של עור התוף. נקב נעשה לפי ברבע העליון הזנב של עור התוף באמצעות מחט 27 G (כוכבית שחור, ב pars flaccida); נעשתה הזריקה דרך החירור באמצעות קטטר 34 G. חור נוסף נעשה ברבע גולגולתי הנחה של הממברנה (הכוכבית הלבנה, ב Tensa pars) לפני הזריקה כדי לאזן את לחץ התוף. (G) צפייה קטטר 34 G דרך ניקוב עור התוף. (H) צפייה h 24 אזור שבלול לאחר המיקרו-כירורגיה. RWN מלא פתרון רכב (כוכבי). לאט, לרוחב; Ro, מקורי; האם, גב; מא, "פטיש; Co, שבלול; OW, חלון סגלגל; RWN, נישה חלון עגול. ברי סולם = 200 מיקרומטר A, D, F; ברי סולם = 100 מיקרומטר B, C, H; ברי סולם = 1,000 מיקרומטר E, ג ' אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. הערכת שמיעה. אבולוציה של ספי ABR (ממוצע ± SEM, ב dB SPL) בתגובה ללחוץ (א) ו פרץ הטון (B) גירויים, לפני 7, 14 ו -28 ימים אחרי הניתוח מיקרו בשמונה שבועות בן C57BL / 6J זכר עכברים. Bullostomy (כתום; n = 11); הזרקת transtympanic (כחול; n = 6); הלא פעל (אפור; n = 11), אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

jpg "/>
איור 4. שבלול מורפולוגיה וניתוח ביטוי גנים. (א) מורפולוגיה של מבני שבלול העיקריים בבסיס של השבלול. Haematoxilin-eosin מכתים סעיפים פרפין modiolar באמצע (7 מיקרומטר), אוזניים מעכברים שאינם מופעלים, ועכברים חודש לאחר התערבות המיקרו-כירורגיה ידי bullostomy או הזרקת transtympanic. תא תקשורת סקאלה (a, b, c) מציג את כל המרכיבים העיקריים. פרטים של כל המבנים הללו (תיבות ממוספרות) מוצגים תמונות עוקבות: גנגליון ספירלה (1), איבר של קורטי (2), רצועת ספירלה (3) ו vascularis stria (4). תא השיער הפנימי (כוכבית); תאי שיער חיצוניים (ראש החץ). ברי סולם = 100 מיקרומטר a, b, c; ברי סולם = 50 מיקרומטר א-1,2,3,4. (ב) ביטוי שבלול של סמנים דלקתיים 28 ד לאחר המיקרו-כירורגיה. השוואה בין bullostomy (כתום) הזרקת transtympanic (כחול) לעכברים הלא המופעל (לבן). *: המופעל הלא לעומתקבוצות פעלו; ^: השוואה בין קבוצות פעלו. רמות התבטאות גנים מיוצגים 2 ^{- ΔΔCt,} או ביחס הבדל של פי n כדי group.Values שאינם מופעלים מוצגים כממוצע ± SEM של triplicates ממדגמים הבריכה של 3 עכברים לכל מצב. מובהקות סטטיסטיות: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^{^^} P ≤0.01; ^^^ ≤0.001 p. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

משלוח סמים מקומי לאוזן הפנימית יכול להתבצע ישירות על ידי הזרקת intracochlear או בעקיפין על ידי ממשל intratympanic, צבת התרופה באוזן התיכונה ^{4, 19, 39.} ממשל Intracochlear מספק מבוקרת משלוח סמים מדויק השבלול, הימנעות דיפוזיה דרך קרום חלון, בסיס ל-פסגה הדרגתית ריכוז ופינוי דרך חצוצרת השמע. עם זאת, הוא בדרך כלל הליך פולשני מאוד הדורש המיקרו-כירורגיה מורכב ועדין ^{7, 39.} בהקשר זה, תעשיית המפתח חדש, מצופה, תקנית מושתל עבור שחרור תרופה מתמשך ^{40, 41.} מצד השני, ממשל intratympanic הוא הליך פולשני וקל לביצוע מינימאליים המאפשר ההזרקה של כמויות גדולות יותר של דהשטיח לתוך האוזן התיכונה, למרות פרמקוקינטיקה לא קל לשלוט. רוב התרופה אינה מסומנת דרך חצוצרת השמע ואת חלק הנותרים יש לנטרל דרך הממברנה RW להגיע שבלול ^18. RW הוא האתר של ספיגה מקסימלית של חומרים מן האוזן התיכונה אל תוך צינור התוף מלא perilymph של השבלול ^7. זהו המבנה התלת שכבת semipermeable, למרות החדירות שלה תלויה במאפייני התרופה (גודל, ריכוז, מסיסות מטען חשמלי) ועל מערכות תחבורה הטרנסממברני (דיפוזיה, תחבורה או phagocytosis פעיל) ^42. החלון הסגלגל הכמוס otic כניסות ברירה אלא פחות יעילות שבלול ^{43, 44.}

כאן אנו מדגימים ולהשוות שתי שיטות מיקרו עבור שיגור תרופות לתוך האוזן התיכונה העכבר: bullostomy ו transtympaנהלי הזרקת nic. שלבים קריטיים משותפים נהלים אלה כוללים: i) הערכת השמיעה לפני ואחרי המיקרו-כירורגיה, ii) הכנת פתרון רכב הומוגני בתנאים סטריליים, iii) פיקוח קפדני של ההליך וניטור הרדמת טמפרטורה וקבועה גוף חיה, iv מיקום איטי) של הנפח המתאים של רכב מיקוד RW, ו- IV) לקיחת דגימות שבלול להשלים ניתוח מולקולרי מורפולוגיים.

גישות Retroauricular ועל הגחון עבור bullostomy תוארו ^{7, 45.} השתמשנו קירוב הגחון בגלל הניסיון שלנו זה הביא תחלואה פחות וספק גישה נוחה יותר ⁴⁶ RW. זריקות Transtympanic בדרך כלל מתבצעות דרך pars Tensa של עור התוף, קדמי או אחורי אל "פטיש manubrium ^12. בעבודה זו בצעה שינוי של הטכניקה, זריקה דרך pars flaccida מעבר "פטיש עם דיקור נוסף קודם של Tensa pars לאפשר פינוי אוויר במהלך ההזרקה.

הזריקה transtympanic היה פחות פולשנית מאשר bullostomy, למרות microsurgeries הן היו מהירות (20 ו -5 דקות לכל אוזן bullostomy ובגישה transtympanic בהתאמה), עם זמני החלמה לאחר ניתוח קצר ולא תחלואה. והכי חשוב, בשני ההליכים ומתוחזק שמיעה הפרמטרים ABR היו זהים לאלה שנקבעו לפני המיקרו-כירורגיה. הגישה transtympanic לוקח פחות זמן מאשר bullostomy וניתן לבצעו בשתי האוזניים של החיה אותו באותה התערבות. יתרונותיו של הזרקת transtympanic הם ובכך שהיא יכולה להתבצע באופן בילטרלי והן חוזרות ונשנות, אם נדרש. מצד השני, bullostomy מספק גישה ויזואלית ישירה הממברנה RW ומאפשר Filling של נישת RW. לעומת זאת, הזרקת transtympanic אינו מאפשר שליטה מיקום הרכב בגומחה RW.

הנהלים דיווחו בעבודה זו מתארים כיצד לבצע משלוח רכב סמים מקומי אל האוזן התיכונה ליישומים טרום קליניים כגון הערכת ototoxicity והערכה של יעילות ירידה בשמיעה. שני הליכים המיקרו-כירורגיה מתוארים המספקים שיטות חלופיות עם יתרונות ספציפיים ואת חסרונות. שניהם לשמר לשמוע ואינו גורם שינויים מורפולוגיים. דלקת מקומית מתואר סיבוך פוטנציאלי של bullostomy. סט של טכניקות משלימות מתוארים גם עבור הליכים לאחר הניתוח, כולל שימוע, הערכות ביטוי סמן מורפולוגיים דלקתיות. יישומים עתידיים עבור טכניקות אלה כוללים את ההערכה פרה-הקלינית של טיפולים חדשים עבור אובדן שמיעה, כולל גישות גנטיות, הסלולר תרופתי, במודלים של בעלי חיים. administrat Intratympanicיונים להבטיח את המסירה של טיפול באוזן התיכונה, במגע עם קרום חלון עגול, הקלת המעבר אל perilymph ללא נזק שבלול מאליו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קטמין (אימלג'ן)	מריאל	# 2529	זהירות: הימנע ממגע של התרופה עם העור או העיניים או זריקות עצמיות בשוגג
קסילאצין (Xilagesic)	Calier	# 6200025225
ג'ל עיניים סיכה (מלאכותי)	Angelini	# 784710
משאבת מים	Gaymar	# TP472
חומר חיטוי משטחים	José Collado SA	# CR-36
אלקטרודות מחט תת-עוריות	Spes Medica	# MN4013D10SM
Headstage עם עכבה נמוכה  (RA4LI)	רמקולים של Tucker-Davis Technologies
(רמקול מגנטי רב-שדה MF1)	מערכת Tucker-Davis Technologies
3 עוררה פוטנציאל לתחנת עבודה	טכנולוגיות Tucker-Davis		המערכת מורכבת מ: מעבד RP2, תחנת בסיס RA16, מנחת PA5, מגבר SA1, מגבר מיקרופון MA3, ראש במת עכבה RA4LI ומגבר מקדים מדוזה RA4A
תוכנת SigGenRP	רפידות חימום Tucker-Davis Technologies
(רפידות TP)	Gaymar	# TP3E
סטטיסטיקה תוכנה (SPSS)	IBM
Chitosan (deacetylated)	Sigma-Aldrich	# C3646
חומצה אצטית (קרחון)	VWR	# 20103.295	זהירות: נוזל דליק, קורוזיה בעור, נשימה ועור רגיש
Glycerophosphate	Sigma	# SLBG3671V
Ringer´ s מאגר לקטט	Braun	# 1520-ESP
Medetomidine (Domtor)	Esteve	# 02400190
Phentanile (Fentanest)	Kern Pharma	# 756650.2	זהירות:     הימנע ממגע של התרופה עם פצעים פתוחים או זריקות עצמיות בשוגג
איזופלורן (IsoVet)	Braun	# 469860	זהירות: הימנע מחשיפה בריכוזים בתקרה הגדולים מ-2 חל"מ של כל חומר הרדמה הלוגני לאורך תקופת דגימה שלא תעלה על שעה.
מיקרוסקופ כירורגי (OPMI pico)	וילון סטרילי Zeiss
(פוליודרפ)	Hartmann	# 277546
סטריליזטור	כלי מדע עדינים	# 18000-45
להב אזמל	Swann Morton	# 0205	זהירות
ידית אזמל	כלי מדע עדינים	# 91003-12
חומר חיטוי על בסיס יוד Povidone (Betadine)	Meda Pharma SAU	# M-12207
מספריים Adventitia (SAS18-R8)	S& T	# 12075-12
מספריים מעוקלים	CM Instrumente	# AJ023-18
מלקחיים	CM Instrumente	# BB019-18
ספוג ג'לטין (ספונגוסטן)	ProNaMAc	# MS0001
מיקרולנס 27 גרם	בקטון דיקינסון	# 302200
מזרק מיקרוליטר (701 RN SYR)	המילטון	# 80330
קטטר (מיקרופיל 34 גרם)	מכשירי דיוק עולמיים	# דבק רקמות MF34G-5
(Vetbond)	3M	# 1469SB
מחזיק מחט (מחזיק מחט עם ידית עגולה)	Fine Science Tools	# 12075-12
תפר כירורגי משי (משי קלוע 5/0)	Arago	# 990011
כלורהקסידין (Cristalmina)	Salvat	# 787341
Pentobarbital  (דולטלי)	Ventoquinol	# VET00040	זהירות:     הימנע ממגע של התרופה עם פצעים פתוחים או זריקות עצמיות בשוגג
סטריאומיקרוסקופ (לייקה)	מכשירי מאייר	# MZ75
Vannas מספריים מיקרו-חיתוך (עין) פעולת קפיץ	מכשיר הרווארד	# 28483
תכשיטן s מלקחיים (Dumont)	כלי מדע עדינים	# 11252-00
פתרון טיהור RNase  (RNaseZap)	Sigma-Aldrich	# R2020
(RNAlater)	RNA של Thermo Fisher Scientific	# R0901
(RNeasy)	Qiagen	# 74104
cDNA ערכת שעתוק הפוך	Thermo Fisher Scientific	# 4368814
בדיקת ביטוי גנים (בדיקות TaqMan)	Thermo Fisher Scientific	Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1
מערכת PCR בזמן אמת (7900HT)	Applied Biosystems	# 4329001
Paraformaldehyde (PFA)	Merck	# 1040051000	TOXIC: PFA הוא פוטנציאל  מסרטן
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)	Merck	# 405491	אזהרה:  מזיק בשאיפה, עלול לגרום נזק לדרכי הנשימה בחשיפה ממושכת או חוזרת בשאיפה .
תמיסת המטוקסילין	Sigma-Aldrich	# HHS16
Eosin Y	Sigma-Aldrich	# E4382	סכנות: גורם לגירוי חמור בעיניים