זיהוי של חומצות שומן ב<em&gt; Cereus בצילוס</em

סיכום

אנו מציעים פרוטוקול לזיהוי חומצות שומן ללא צורך בטיהורן. הוא משלב מידע על זמני השמירה עם ספקטרום המסה של שלושה סוגים של נגזרות חומצות שומן: אסטרי מתיל של חומצות שומן (FAMEs), נגזרות 4,4-דימתיל אוקסזולין (DMOX) ואסטרי 3-פירידילקרביניל (פיקוליניל).

תקציר

מין Bacillus מכיל מסועף שרשרת חומצות שומן בלתי רוויות (FAS) עם עמדות מגוונות של הסניף מהתיל (iso או anteiso) ושל הקשר הכפול. שינויים בהרכב FA לשחק תפקיד מכריע ההסתגלות של חיידקים לסביבתם. שינויים אלה כרוכים בשינוי היחס של iso לעומת anteiso המסועף FAS, וב השיעור ביחס FAS בלתי רווי ל- FAS הרווי, עם קשרים כפולים נוצרו ב בתפקידים שונים. זיהוי מדויק של פרופיל FA יש צורך להבין את מנגנוני ההסתגלות של מיני Bacillus.

רבים מן FAS מ Bacillus אינם זמינים מסחרית. האסטרטגיה המוצעת במסמך מזהה FAS באמצעות שילוב אינפורמציה על זמן השמירה (לפי חישוב של אורך השרשרת שווה ערך (ECL)) עם ספקטרה המונית של שלושה סוגים של נגזרים FA: אסטרים מתיל חומצת שומן (fames), 4,4-דימתיל oxazoline נגזרים (DMOX), ו3-pyridylcarbinyl אסתר (picolinyl). שיטה זו יכולה לזהות את FAS ללא הצורך לטהר את FAS הידוע.

השוואת פרופילי chromatographic תהילה שהוכנה cereus Bacillus בתערובת מסחרית של תקנים מאפשרת זיהוי של ישר-שרשרת רווי FAS, החישוב של ECL, והשערות על זהותו של FAS האחר. Fames של הקנים רווי FAS, iso או anteiso, להציג תזוזה שלילית קבועה של ECL, לעומת FAS רווי ליניארי עם אותו מספר פחמנים. Fames של FAS בלתי רווי יכול להיות מזוהה על ידי המסה של היונים המולקולריים שלהם, ולגרום לשינוי חיובי ECL לעומת FAS הרווי המתאים.

עמדת ההסתעפות של FAS ועמדת הקשר הכפולה של FAS בלתי רווי ניתן לזהות על ידי ספקטרה המונית יינון אלקטרונים נגזרים picolinyl ו DMOX, בהתאמה. גישה זו מזהה את כל הענף הרווי הידועFAS ed, FAS ישר שרשרת בלתי רוויה ו- FAS המסועף בלתי רווי מתמצית cereus ב.

מבוא

שומן מתיל אסטר חומצה (FAME) גז כרומטוגרפיה (GC) היא שיטה חיונית לאפיון שומנים. הוא מפריד במהירות מכמת את חומצות שומן שונות (FAS) של מדגם אחרי צעד מיצוי קצר. נגזרים של אסטרים מתיל תנודתיות מאוד, יציבה אינרטי לעבר מוט chromatographic, ובכך למנוע פסגות עוקב. סולם ההזדהות שלהם היא די פשוט כאשר המדגם מורכב FAS הידוע משום פרופילי chromatographic או מתפרסמים או בהשוואה לסטנדרטים. בנוסף, ההזרקה החוזרת של סטנדרטי כיול כימות של שונות FAS אינה נדרשת, בהתחשב בתגובה המתמדת שלהם כמעט לגילוי יינון להבה (FID) ^1.

בנוסף FID, ספקטרומטריית מסה (MS) זיהוי מספק ערכה משלימה של מידע כדי לאשר fames. עם זאת, כאשר fames נזקפת באמצעות יינון אלקטרון (EI), ספקטרה וכתוצאה מכך לא תמיד מאפשרת הזיהוי דואר של המבנה העדין האנגלי. למשל, הסתעפות עמדה (כלומר, קבוצה מהתיל מסועפת) קשה לנבא כי יוני האבחון קשים לזהות ¹ ושינוי המאפיין בשפע יון היעד הוא מכונה תלוי, מניעת השימוש בספריות ספקטרה מונית ^2. אתגר נוסף טמון בזיהוי מיקום הקשר הכפול בגלל EI גורם גירת קשר כפולה. לפיכך, איזומרים FA עם משתנה עמדות קשר כפולות לא יכולים להיות מובחנים על ידי ספקטרום המסה שלהם. למרבה המזל, בכלים אחרים פותחו לזיהוי FA. לדוגמה, הנוכחות ואת המיקום של הסתעפות או של קשרים כפולים FAS ניתן השערה על ידי חישוב אורך השרשרת שווה ערך (ECL) ^3.

שיטות derivatization אחרות לגרום ספקטרה מסה שונה, תלוי במיקום של קשר כפול או קבוצה מתיל מסועפת. 4,4-דימתיל נגזר oxazoline (DMOX) ⁴ לאפשר EASזיהוי y של המיקום של קשרים כפולים חומצת שומן חד בלתי רוויה. 3-pyridylcarbinyl אסתר (אסתר picolinyl) נגזרים לאפשר זיהוי חד משמעי על המיקום של מתיל מסועף ⁵ FAS. שילוב שמירת chromatographic (ECL) ו ספקטרה ההמונית (DMOX ו picolinyl) מידע מאפשר זיהוי של רוב FAS ללא הצורך להשתמש בשיטות מורכבות של טיהור, כנדרש עבור ספקטרום תהודה מגנטית גרעינית (NMR), שיטת העוררין לאפיון מבני ¹ .

חיידקים של Bacillus הסוג, הכוללים כמה פתוגנים בני אדם ובעלי חיים, מסוגלים ליישב נישות מגוונות מאוד ולכן מופצים באופן נרחב בסביבה ^6. בין הסוג בצילוס, רכב FA מושפע הנישה האקולוגית של המין עם מודולציות בדפוסי FA להתאים למגוון רחב של שינויים סביבתיים (למשל, מדיום גידול, טמפרטורה,pH, וכו ') ^7-9. בגלל ההומוגניות היחסית של דפוס FA בין זנים של Bacillus הסוג במהלך צמיחה בתנאים סטנדרטיים, קביעת רכב FA היא אחד הקריטריונים החיוניים המשמשים להגדרת מין Bacillus. מאפיין ייחודי של הסוג בצילוס הוא השפע של FAS מסועפת שרשרת המכילה 12-17 פחמנים ^10-12 עם היחס בין ISO ו anteiso איזומרים להיות קובע מפתח של הסתגלות לתנאי סביבה. מיני Bacillus גם להסתגל לתנודות סביבה על ידי שינוי היחס של חומצות שומן בלתי רוויות. במינים מסוימים, כגון cereus Bacillus, שני desaturases חומצת שומן ליצור קשרים כפולים במיקומים שונים של שרשרת אלקיל ¹³ עם תפקידים שונים בעיבוד ^9. הדוגמא של הסוג בצילוס ממחישה את החשיבות של זיהוי בדיוק עמדת הקשר הכפולה ו FA הסתעפות. לאסוףively, זיהוי דפוסי Bacillus FA יש כמה יישומים שימושיים. בזאת, אנו מציעים גישת GC-MS רומן לזיהוי דפוס Bacillus FA אשר מתגבר על המגבלות המובנות של ניתוח קלסי GC-MS.

גישה חדשנית זו יכולה לשמש באופן ישיר על חומר ביולוגי גלם, מורכבת משילוב של טכניקות קיימות: מידע על זמני שמירה (ECL) ו ספקטרה ההמונית של נגזרי FAS שונים (FAME, DMOX ו-אסתר picolinyl).

אנו משתמשים במינוח האנגלי הבא. אני, א, ו n מצביע iso, anteiso מתיל מסועף, וישר-שרשרת חומצת שומן, בהתאמה. FAS הרווי קבל את שמן C: ד כאשר C הוא מספר אטומי הפחמן חומצת השומן ו- D הוא מספר קשרים כפולים. Δ ^x מציין את המיקום של הקשר הכפול, שבו הקשר הכפול ממוקם על קשר פחמן-פחמן העשירי, לספור מסוף חומצה קרבוקסילית.

פרוטוקול

1. תרבויות חיידקים

1. כן דשא של החיידקים (ATCC Bacillus cereus זן 14,579) על ידי הפצת 100 μl של תרבות לילה של המתח וטופח על 30 מעלות צלזיוס LB (בינוני לוריא- Bertani), על פני השטח של צלחת של מדיום אגר LB. דגירה את צלחת הלילה ב C 30 °.

2. ECL: אורך שרשרת Equivalent

1. חישוב ECL כדלקמן: עם:
   אני, מומס עניין;
   n, מספר הפחמן של מתיל אסטר חומצת שומן רוויות ישר שרשרת משחררים לפני מומס לי;
   n + 1, מספר הפחמן של מתיל אסטר חומצות שומן רווי שרשרת ישר משחררים לאחר המומס לי;
   RTI, RTN, RT (n + 1) פעמים השמירה של פסגות FAME שתוארו לעיל.
   הערה: קבל את זמני השמירה של אסטרים מתיל חומצות שומן רווי ישר שרשרת בזריקה מתערובת של סטנדרטים (BAME).

הכנת FAME 3. וניתוח

1. על מנת לקבל חומצות שומן שומנים, תאים חיידקיים הקציר על ידי גירוד מושבות מהצלחת אגר ולהעביר 40 מ"ג (משקל טרי, שווה ערך ל -10 ⁹ תאים קיימא) של חיידקים לתוך צינור זכוכית 10 מ"ל עם פקקי הברגה וחותמות PTFE.
2. בצע transesterification הניתן בשיטת קישור אסתר ^14,15 כמפורט להלן.
   1. הוסף 5 מ"ל של 0.2 M KOH מתנול אל תאים חיידקיים טרי לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. תגובה זו מורכבת methanolysis אלקליין, לשבור את הקישור אסתר ב השומנים והפקת אסטרים מתיל חומצות שומן.
   2. הוסף 1 מ"ל של 1 חומצה אצטית M כדי להוריד את ה- pH ל -7.0. בדוק את ה- pH עם רצועות מבחן ה- pH.
   3. הוסף 3 מ"ל של הקסאן לחלץ fames.
   4. העברת supernatant (שלב אורגני) לתוך צינורות נקיים להתרכז על ידי אידוי בטמפרטורת חדר תחת זרימה רציפה של חנקן לקבל כ 200 μlשל תמצית. מעבירים את המדגם לתוך בקבוקון GC עם הכנס.
   5. להזריק תמציות לתוך ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסת גז מערכת (GC-MS).

4. GC / MS תנאים

1. להזריק דגימות FAME לתוך מכשיר GC-MS מצויד נימי טור ZB-WAX (אורך, 30 מ '; קוטר, 0.25 מ"מ, עובי הסרט, 0.25 מיקרומטר).
2. הגדר את פיית ההזרקה (במצב splitless) הטמפרטורה ל 250 מעלות צלזיוס. השתמש הליום כגז מוביל, עם מהירות הקווית של 37 סנטימטר / sec. החזק את טמפרטורת התנור ב -50 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, להגביר עד 190 ° C בשיעור של 20 ° C / min, ולהגדיל עוד יותר לטמפרטורה סופית של 230 מעלות צלזיוס בשיעור של 2 ° C / min.
3. עבור MS, להקליט את ספקטרה ההמונית על ידי יינון אלקטרון (EI) בשעת 70 eV, ולהגדיר את הרכישה הנוכחית היון הכולל בין 50 ל 400 יחידות מסה אטומיות (האמו) (2 סריקות / sec).
4. כאשר נדרש, להזריק נגזרים DMOX ו picolinyl באותם excep מצבt בתנור בטמפרטורה תוכנית כדלקמן:
   DMOX: 50 ° C (1 דקות), 20 ° C / min עד 210 ° C ו -2 ° C / min עד 240 ° C (5 דק ');
   Picolinyl: 6 ° C (1 דקות), 20 ° C / min עד 220 ° C ו -2 ° C / min עד 250 ° C (20 דק ').

5. Picolinyl אסתר הכינה מ FAME ¹⁶

1. לאדות את תמצית FAME מסעיף 3 עם זרימת חנקן (לפחות חומר יבש 10 מ"ג) ו להתמוסס 1 מ"ל של dichloromethane יבש.
2. כן פתרון 1.0 M של אשלגן ter T-butoxide ב tetrahydrofuran.
3. מוסיפים את תמצית תהילה 0.2 מ"ל 3-pyridinemethanol 0.1 מ"ל של תמיסת עשה צעד 5.2.
4. מחמם את הפתרון ב 40 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בתוך בקבוקון סגור.
5. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, להוסיף מים ללא יונים מטוהרים (2 מ"ל, ראה לוח חומרים) ו הקסאן (4 מ"ל). מערבבים עם מערבולת, לאפשר בשלב להיפרד, לאסוף את השלב האורגני.
6. ד"רy אותו על ידי הוספת נתרן גופרתי נטול מים עד השלב האורגני ברור לחלוטין. העבר אותו לתוך צינור נקי. ונמוג 200 μl. מעבירים את המדגם לתוך בקבוקון GC עם הכנס.

6. הכנת DMOX מ FAME ¹⁷

1. לאדות את תמצית FAME מסעיף 3 עם זרימת חנקן (לפחות חומר יבש 10 מ"ג).
2. כדי לחלץ FAME יבש, להוסיף 250 מ"ג של 2-אמינו-2-מתיל-1-פרופנול. שטוף את הכלי עם חנקן, להוסיף פקק, ולמקם אותו בתוך גוש חימום לילה ב 190 מעלות צלזיוס.
3. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, להוסיף 3 מ"ל dichloromethane אל הצינור, ו -5 מ"ל מטוהרים מים ללא יונים (ראה לוח חומרים).
4. Shake עבור הפרדת פאזות ולאחר מכן להסיר את השלב מהימי.
5. שטפו את השלב האורגני במים מ"ל 5. Shake עבור הפרדת פאזות ולאחר מכן להסיר את השלב מהימי.
6. ניקוי על ידי הוספת נתרן גופרתי נטול מים עד השלב האורגני הוא צלול לגמרילהעביר אותו לתוך צינור נקי. להתאדות תחת זרם של חנקן עד שמגיעים בהיקף של 200 μl. מעבירים את המדגם לתוך בקבוקון GC עם הכנס.

תוצאות

האסטרטגיה של זיהוי FA מתאי חיידקים מוצג באיור 1. כל צעד מספק מידע ספקטרלי משלים או מידע אודות שימור chromatographic. שלב 1 מורכב של זיהוי ראשוני FA באמצעות פתרון סטנדרטי. שלב 2 מאפשר פרשנות FAME EI ספקטרה ECL שלהם, על מנת לזהות את המוצרים בהיסוס. שלב 3 מזהה את המיקום המדויק הסתעפות בשרשרת-FAS מסועף. לבסוף, בשלב 4 מזהה את המיקום המדויק של קשרים כפולים FAS בלתי רווי.

דיון

פרופילי הכרומתוגרמה FAS שניתן לראות בטבלת 1 מתאים B. cereus ATCC 14,579 גדל על פני צלחת אגרה. פרופילים דומים התקבלו כאשר החיידק היה גדל בתקשורת נוזלת סודה באותה הטמפרטורה ^8. במקרה של חיידקים גדלו בתקשורת נוזלית, ביומסה החיידקים נאספה על ידי צנטריפוגה של מדיום הצמיחה ניתן לכבס על פי פרוטוקולים שתוארו קודם לכן תלויים ^8,19 תנאי גידול. זיהוי של FAS השונה המיוצר על ידי B. cereus מותר שינויים בסדר בשיעור של FAS להתגלות זני מוטציה ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
GC/MS	Shimadzu	QP2010
עמוד נימי ZB WAX	Phenomenex	7HG-G007-11	30 מ' x 0.25 מ"מ x 0.25  ומיקרו; m
מתנול Lichrosolv	VWR	1.06018.2500
אשלגן הידרוקסיד	Aldrich	P1767
THF	Hipersolv Chromanorm	28559.320
דיכלורומתאן	Hipersolv Chromanorm	23373.320
הקסאן	Hipersolv Chromanorm	24575.320
3-פירידין-מתנול	אולדריץ'	P6-680-7
אשלגן טרטיובוטוקסיד	Aldrich	156671
2-אמינו-2-מתיל-1-פרופנול		A-9879
MilliQ Academic	Millipore	ZMQS50001
תערובת חומצה חיידקית מתיל אסטר (BAME)	Sigma-Aldrich	47080-U Supelco