הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו

8.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54980

⸱

27 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  , 
1Section of Nephrology, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Section of Nephrology, Department of Medicine, Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania, 4Division of Rheumatology, Department of Medicine, Research Institute of the McGill University Health Centre, 5Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois at Chicago

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת אירועי איתות תוך-תאיים המושרים בתאים ברי קיימא על ידי אינטראקציה פיזית עם תאים מתים או גוססים סמוכים. הפרוטוקול מתמקד באירועי איתות המושרים על ידי זיהוי בתיווך קולטנים של התאים המתים, בניגוד לספיגה הפגוציטית שלהם או שחרור של מתווכים מסיסים.

תקציר

תאים מתים על ידי אפופטוזיס, התייחסו גם הוא מוות של תאים מוסדרים, לרכוש פעילויות חדשות מרובות המאפשרות להם להשפיע על התפקוד של תאי חיים סמוכים. פעילויות חיוניות, כגון הישרדות, שגשוג, צמיחה, והבחנה, הן בין התפקודים תאיים הרבים מווסתים על ידי תאים אפופטוטיים. היכולת לזהות ולהגיב תאים אפופטוטיים שנראה תכונה אוניברסלית של כל התאים, מבלי להתחשב בשושלת היוחסין או איבר של המקור. עם זאת, המגוון והמורכבות של בתגובת מנדטי תאים אפופטוטיים כי בזהירות רבה להילקח לשלוף את איתות האירועים ושבילים אחראים לכל תוצאה מסוימת. בפרט, יש להבחין בין מספר מנגנונים שבאמצעותם תאים אפופטוטיים יכול להשפיע מסלולי איתות תאיים בתוך תאים המגיב קיימא, כולל: הכרה בתיווך קולטן של תאים אפופטוטיים, שחרור של מתווכים מסיסים על ידי תאים אפופטוטיים, ו / או מעורבות של phagoמכונה cytic. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לזיהוי אירועי איתות תאיים כי הם המושרה בתאים המגיבים קיימא הבא חשיפתם תאים אפופטוטיים. יתרון עיקרי של הפרוטוקול טמון התשומה משתלמת דיסקציה של המנגנון שבאמצעותו תאים אפופטוטיים לווסת איתות אירועים בתוך תאים להגיב. בעוד הפרוטוקול ספציפי עבור קו תא צינורי הפרוקסימלי כליות עכבר הונצח על תנאי (תאי BU.MPT), הוא מותאם בקלות שורות תאים שאינן-אפיתל במקורו ו / או נגזרים איברים מלבד הכליה. השימוש של תאים מתים כגירוי מציג מספר גורמים ייחודיים שיכול לעכב את הגילוי של אירועי איתות תאיים. בעיות אלה, כמו גם אסטרטגיות כדי למזער או לעקוף אותם, הם דנו בתוך הפרוטוקול. יישום של פרוטוקול זה אמור לסייע הידע והרחבת שלנו של השפעה רחבה מתים או גוססים תאים להפעיל על השכנים לחיות שלהם, הן בבריאות disease.

מבוא

אפופטוזיס, או מוות של תאי מוסדר 1, תורם באופן מהותי את התחזוקה והפיתוח של רקמות. הנצפים ביותר פשוט, היתרי אפופטוזיס בגילאי, פגומים, או להתבטל תאים עודפים מבלי לפגוע סביב 2,3 רקמות. תרומת אפופטוזיס הומאוסטזיס רקמות, לעומת זאת, היא הרבה יותר דינמית ומגוונת. תאים מתים על ידי אפופטוזיס לרכוש פעילויות חדשות מרובות, הן מופרשות הקשורים תא, אשר מאפשר להם להשפיע על התפקוד של תאי חיים סמוכים 4-10. מחקרים קודמים התמקדו ביכולת של תאים אפופטוטיים לדכא דלקת 11-16, אבל תאים אפופטוטיים גם לווסת מגוון רחב של תפקודים תאיים, כוללים פעילויות חיוניות כגון הישרדות 4,9,10, התפשטות 4,9,10, בידול 17, הגירה 18, והצמיחה 19. יתר על כן, תופעות אלה אינן מוגבלים פגוציטים מקצועיים, כמו מקרופאגים, אבל להאריך כמעט לכל סוגי תאים שושלות, כולל מסורתי שאינו phagocytic תאים, כגון אפיתל ותאי האנדותל 7,9,10,18-21.

התגובה הספציפית של תאי חיים הסמוך בעקבות חשיפת תאי אפופטוטיים תלויה בגורמים מרובים להתייחס לשני התאים להגיב הקיימא ואת תאי אפופטוטיים עצמם. לדוגמה, אם כי חשיפה תאים אפופטוטיים מעכב התפשטות של שניהם מקרופאגים בעכברים ותאי אפיתל צינורי הפרוקסימלי כליות (PTECs), סוגי תאים שני אלה שונים באופן דרמטי בתגובה ההישרדות שלהם תאים אפופטוטיים 4,6,9,10. תאים אפופטוטיים לקדם את ההישרדות של מקרופאגים, אבל לגרום למותם אפופטוטיים של PTECs 4,6,9,10. יש לציין, כי בתגובת תאים אפופטוטיים עשויה להיות שונה גם בקרב להגיב תאים מאותו השושלת, תלוי האיבר של התא להגיב ממוצא 10 (למשל, כליות PTECs לעומת אפיתל חלבתאים) או מצב הפעלה 22 (למשל, נויטרופילים). לעומת זאת, תאים אפופטוטיים עלולים לעורר תגובות שונות לאותו תא בהתאם לאופי של אפופטוטיים גירוי 10,23 או בשלב של אפופטוזיס 10,14.

בהתחשב diverseness ומורכב בתגובת תאים אפופטוטיים, בזהירות רבה יש לנקוט לנתח את האירועים ואת מסלולי איתות אחראים לכל תוצאה מסוימת. ראשית, תגובות הדורשים אינטראקציה פיזית ישירה בין תאי קיימא אפופטוטיים חייבות להיות מובחנות מאלה שהושרו על ידי מתווכים מסיסים שוחררו או שמופקים על ידי תאי אפופטוטיים 3,6-10. אם אינטראקציה פיזית נדרש, אז בידול נוסף צריך להתבצע. אירועי איתות יכולים להיות תלויים הכרת קולטן בתיווך של התאים אפופטוטיים, העצמאיים של היבלעות עוקבת או על ספיגת phagocytic, העצמאיים של קולטן המסוים שקושר את התאים אפופטוטיים 3-7,9,10,19. במקרה האחרון, התגובה אינה ספציפית תאים אפופטוטיים, והוא יכול להיות מופעל על ידי כל חומר phagocytic 4,6.

חשיבותה של ההבחנות האלה יכול שוב להיות מוערך על ידי מנוגדים התגובות של מקרופאגים PTECs כליות. עבור שני סוגי התאים, חשיפת תאים אפופטוטיים משנה את הפעילות של קינאז פרו-הישרדות Akt. האפנון תלוי אינטראקציה פיזית, מאז פרידה של להגיב תאי אפופטוטיים ידי קרום פוליקרבונט 0.4 מיקרומטר מבטל את התגובה 4,9,10,19. עם זאת, התגובה של PTECs היא קולטן בתיווך ועצמאי של phagocytosis, ואילו התגובה של מקרופאגים היא מונעת על ידי phagocytosis 4,9,10,19. מסקנה זו מתחזקת לאור העובדה כי חשיפה חרוזים לטקס, גירוי phagocytic נייטרלי, אין כל השפעה על פעילות Akt ב PTECs, אבל מחקה את ההשפעה של תאים אפופטוטיים מקרופאגים 4,9.

"> אמנם פחות טוב למד, תאים מתים על ידי נימק, או מוות של תאי בשוגג 1, גם לווסת את הפונקציה של תאי קיימא הסמוכים 3-10,19. כמו תאים אפופטוטיים, תאי נימקים להשפעות שלהם באמצעות מגוון רחב של מנגנונים, במיוחד הדליפה תוכן תאיים דרך קרום התא מהקרע שלהם 3,5,6,9,24. תאים רבים, כולל PTECs מקרופאגים, להחזיק קולטנים שאינם מתחרה ברורים עבור תאים מתים על ידי נימק 5,9. אירוסין של קולטנים אלה גורמים אירועי איתות כי הם לעתים קרובות הפוכה לגמרי מזו הנגרמת על ידי מעורבות של קולטנים תאים אפופטוטיים 4-10,19. לדוגמה, ב PTECs, תאים נמקי להגדיל זירחון של Akt, ואילו תאים אפופטוטיים להקטין זירחון 9,10,19.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי אירועי איתות תאיים מושרים PTECs כליות קיימא באמצעות הכרת קולטן בתיווך של PTECs אפופטוטיים סמוך 9,10,19. בעוד פרוטוקול ספציפי עבור קו התא PTEC הונצח על תנאי המכונה תאים BU.MPT 9,10,19,25,26, הוא מותאם בקלות שורות תאים שאינן-אפיתל במקורו ו / או נגזר איברים מלבד הכליה. חשוב לציין, שימוש תאי אפופטוטיים כגירוי תא מציב קשיים הניסיונות טמון מסוימים לא מקיימים עם ליגנדים מסיסים. החשוב ביותר של אלה הוא כי תאים אפופטוטיים יש להוסיף כמו השעיה ולא כפתרון. קשיים אלה, כמו גם אסטרטגיות כדי למזער או לעקוף אותם, הם דנו בתוך הפרוטוקול. כמעט כל הטכניקות המתוארות בפרוטוקול הם פשוט תקן תרבית תאים. היתרון של פרוטוקול זה טמון לידיעתה אל מספר מנגנונים שבאמצעותם תאים אפופטוטיים לווסת הולכת אותות בתוך התאים להגיב. מנגנונים אלה כוללים את הכריכה באמצעות גורמי משטח או גישור מולקולות קולטנים ספציפיים על מחדשתא sponding, שחרור מתווכים מסיסים, ו / או ההתקשרות של מכונות phagocytic. תאי נימקים כלולים בכל הניסויים על מנת להבטיח כי תוצאות הן ספציפיות במצב של מוות של תאים, ולא תגובה להכליל את התאים מתים. גישה זהירה, כמומלץ בפרוטוקול זה, הוא קריטי להבנתנו את ההשפעה ההולך ומתרחב כי תאים מתים להפעיל על שכני לחיות שלהם, בשתי בריאות ומחלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנות

הערה: בפרוטוקול זה, שתיים או יותר שורות תאים, או בתרביות תאים ראשוניות, ערוכים באופן עצמאי תחת תנאים מסוימים. היערכות זו כוללת תאים אפופטוטיים (פרוטוקול 1), תאי נימקים (פרוטוקול 2), ותאי מגיב בריאים (פרוטוקול 3). לאחר הכנה עצמאית, תאים אפופטוטיים או נימקים מתווספים תאים המגיב ואת תמרת האות שהתקבלה מנוטר (פרוטוקולים 4, 5, ו -6).

  1. כן תקשורת ריאגנטים תרבות
    1. כן 500 מיליליטר של תרבות מדיום (לשימוש כאשר גדלו תאים בתנאי מתירני, ראה סעיף 1.2) על ידי שילוב של הבאים: הבינוני של הנשר השונה של 1x Dulbecco (DMEM) המכילים 4.5 גרמו / גלוקוז L, 584 מ"ג / L ʟ-גלוטמין, 110 מ"ג / L פירובט נתרן, 100 יחידות / מ"ל ​​פניצילין, סטרפטומיצין, 10% (V / V) בסרום שור עוברית (FBS), ו -10 יחידות / מ"ל ​​של אינטרפרון-γ (IFN-γ).
    2. הכן 500 מ"ל של B בינוני תרבות (עבור ש"ש שימושen התאים מורעבים סרום בתנאים אוֹסְרָנִי, ראה סעיף 1.2) על ידי השמטת FBS ו-γ IFN מן המתכון של א בינוני תרבות לגדל תאים בתנאים אוֹסְרָנִי (לפני הרעבה בסרום), להוסיף v 10% / v FBS ל B. בינוני תרבות
    3. הכן 0.4% (v / v) paraformaldehyde, pH 7.2, ב בופר פוספט של 1x Dulbecco (DPBS) מן paraformaldehyde המניה 4% עבור קיבעון של תאים מתים.
      הערה: Paraformaldehyde רעיל, בזהירות המתחייבת יש להימנע ממתן השימוש בו.
  2. תרבות תאי BU.MPT
    1. להפשיר מ חנקן נוזל בקבוקון אחד של תאי BU.MPT.
      הערה: BU.MPT הוא תא צינורי הפרוקסימלי כליות עכבר אפיתל (PTEC) קו נגזר עכבר מהונדס נושאת מוטצית טמפרטורה רגישה (TS) (tsA58) של אנטיגן גידול הגדול SV40 (תג) תחת השליטה של ​​העכבר הגדול מורכב histocompatibility (MHC) בכיתה ב H-2K ואני האמרגן 25,26.
    2. פלייט תאים על polystyr סטריליפלזמת ואקום גז פנטן תרבות מנות מטופלי רקמות (~ 5 x 10 6 תאים לכל 100 צלחת בקוטר מ"מ).
    3. לגדל תאים בתנאים מתירנית ב 5% humidified (v / v) CO 2 באטמוספרה.
      הערה: תנאי מתירנית, המוגדרים התרבות ב 33 - 37 ºC בנוכחות-γ IFN, לאפשר ביטוי יציב של transgene תג-מוטציה tsA58. בניגוד תרבויות העיקרי של PTEC כליות העכבר, אשר אינם שורדים יותר מעבר אחד או שניים, BU.MPT מתורבת תחת ניתן passaged תנאי מתירני ללא הגבלת זמן.
      1. תאי המעבר לפחות שלוש פעמים לאחר ההפשרה לפני השימוש בהם בניסוי.
        1. עד היום תאים המעבר, להוסיף 1 מ"ל של טריפסין 0.05% ל -100 מ"מ צלחת, דגירה של 5% humidified (v / v) CO 2 האווירה ב 37 ºC למשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל של מדיום א לשאוב את התאים מנותקים, ולפצל 1: 3 ל -1: 5 לתוך 100 מ"מ חדש Tiss סטרילית קלקר ואקום גז שטופלו פלזמהתרבות מנות UE. הוספת בינוני כדי להעלות את נפח לסך של 10 מ"ל לכל צלחת 100 מ"מ.
    4. כהכנה לשימוש ניסיוני כתאים להגיב, לגדל תאים כדי מפגש בתוך 5% humidified (v / v) באווירה CO 2 בתנאים אוֹסְרָנִי (כלומר ב 39 ºC בהעדר IFN-γ [B במדיום המכיל נ 10% / v FBS]).
      הערה: בתנאים אוֹסְרָנִי, ביטוי של transgene תג tsA58-המוטציה מעוכב על ידי> 95%, ותאי BU.MPT להתנהג כמו תרבויות עיקריות של PTEC כליות עכבר.

2. הכנת תאים אפופטוטיים BU.MPT (פרוטוקול 1)

הערה: פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור תאים BU.MPT כמקור של תאים אפופטוטיים, ו staurosporine כמו שיטת האינדוקציה אפופטוזיס. לחלופין, קו לתא אחר, או תרבית תאים ראשונית, יכול לשמש כמקור תאים אפופטוטיים, עם אפופטוזיס המושרה על ידי protoco הסטנדרטיתls עבור סוג ושיטת תא מסוים של אינדוקציה אפופטוזיס.

  1. לאחר המעבר על מנות בתרבית רקמה שטופלו פלזמה ואקום גז פוליסטירן סטרילי בקוטר 100 מ"מ, לגדל תאים BU.MPT כדי מפגש בתוך 5% humidified (v / v) באווירה CO 2 בתנאים היתר (כלומר ב 37 ºC במדיום התרבות 10 מ"ל לכל 100 מ"מ צלחת), כמפורט בסעיף 1.2.3.
  2. שוטפים את monolayer תא חסיד שלוש פעמים עם B בינוני תרבות, באמצעות 10 מ"ל לכל לשטוף.
  3. להשרות אפופטוזיס על ידי דוגרים התאים B בינוני תרבות המכיל staurosporine, מעכב קינאז חלבון לא סלקטיבי, ב 1 מיקרוגרם / מ"ל למשך 3 שעות באווירה 5% CO 2 humidified (v / v) בשעה 37 ºC.
  4. לשאוב את המדיום המכיל staurosporine המכיל "צף" תאים אפופטוטיים כי יש מנותקת מן בשכבה. צנטריפוגה המדיום הזה במשך 10 דקות ב 500 XG, וזורקים supernatant, לשטוף את הכדור שלוש פעמים עם B בינוני תרבות, ולהוסיף הגלולה חזרה תאים שנאספו בשלב הבא, 2.5.
  5. לנתק את התאים חסיד שנותרו מן הצעדים 2.3 ו -2.4 על ידי תוספת של 5 מ"מ (חומצה ethylenediaminetetraacetic) EDTA ב 1x Ca 2 + - ו Mg 2 + -חינם DPBS ב 1 מ"ל לכל צלחת למשך 5 דקות. לשאוב את המדיום EDTA המכילים המכיל תאים אפופטוטיים מנותקת, ובריכת התאים מנותקים עם תאים "צף" אפופטוטיים משלב 2.4 ב צינור צנטריפוגות פוליסטירן סטרילי 15 מ"ל.
  6. שוטפים את התאים אפופטוטיים שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 500 XG ו resuspension ב 10 מ"ל של 1x Ca + 2 - ו Mg + 2 -חינם DPBS לכל לשטוף.
  7. לאחר לשטוף האחרון, להשעות את תאי אפופטוטיים B בינוני תרבות הטרי ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר לפני השימוש כדי לעורר תאים מגיבים. לחלופין, לתקן שטף תאים אפופטוטיים 0.4% (v / v) paraformaldehyde ב 1x DPBS למשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם תרבותB בינוני, לפני להשעיה ב בינוני תרבות
  8. בהתאם לצורך, לאשר אינדוקציה של אפופטוזיס על ידי cytometry זרימה באמצעות תכשיר נפרד של תאים אפופטוטיים (או על ידי הזמנה כמה תאים למטרה זו), כפי שתוארה לעיל 6,9,10,15.
    הערה: יש תאים אפופטוטיים מוקדם קרום תא ללא פגע, ומופיעים כמו יודיד propidium (PI) תאי -שלילית ו Annexin V-החיובי של ירידת גודל תא (יחסית תאי קיימא). מאוחר תאי אפופטוטיים יש ממברנות תאים הלא-שלמים, ומופיעים כמו PI-חיובי Annexin V חיוב תאים של ירידת גודל תא. באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, הכנות טיפוסיות מכילות ~ 85% אפופטוטיים מוקדם ~ 15% תאי אפופטוטיים מאוחר.
  9. הוספת תאים אפופטוטיים כדי BU.MPT תאים המגיב (פרוטוקול 3) ב יחס תאים אפופטוטיים אל המגיב של 1: 1, במישרין או לאחר קיבוע של תאים אפופטוטיים למשך 30 דקות עם 0.4% (v / v) paraformaldehyde ב 1x DPBS .
    הערה: קיבוע תאים אפופטוטיים לפני הגירוי של מגיבים צריכיםלא השפיע על תוצאות, אלא אם אירועי האיתות שנצפה הם בשל השחרור של מתווך מסיס (טבלה 1).

3. הכנת תאים נקרוטי BU.MPT (פרוטוקול 2)

הערה: פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור תאי BU.MPT כמקור של תאי נימקים, והחימום כמו שיטת האינדוקציה נימקת. לחלופין, קו לתא אחר, או תרבית תאים ראשונית, יכול לשמש כמקור לתאי נימקים, עם נימק מושרה על ידי פרוטוקולים סטנדרטיים עבור סוג תא מסוים ואת שיטת האינדוקציה נימקת.

  1. לאחר המעבר על מנות בתרבית רקמה שטופלו פלזמה ואקום גז פוליסטירן סטרילי בקוטר 100 מ"מ, לגדל תאים BU.MPT כדי מפגש בתוך 5% humidified (v / v) באווירה CO 2 בתנאים היתר (כלומר ב 37 ºC במדיום התרבות 10 מ"ל לכל צלחת), כמפורט בסעיף 1.2.3.
  2. שוטפים את monolayer תא חסיד שלוש פעמים עם B בינוני תרבות, באמצעות10 מ"ל לכל לשטוף.
  3. לנתק את התאים על ידי תוספת של 5 מ"מ EDTA ב 1x Ca + 2 - ו Mg + 2 -חינם DPBS ב 1 מ"ל לכל צלחת למשך 5 דקות. לשאוב את המדיום EDTA המכילים המכיל תאים מנותקים, ומוסיפים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות 15 מ"ל פוליסטירן סטרילי.
  4. שוטפים את התאים שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 500 XG ו resuspension ב 10 מ"ל של Ca + 2 - ו Mg + 2 -חינם DPBS לכל לשטוף.
  5. לאחר לשטוף האחרון, להשעות את התאים B בינוני תרבות הטרי ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
  6. להשרות נמק ידי חימום תאים ל -70 ºC במשך 45 דקות באמבט מים, vortexing ההשעיה תא בעדינות כל 10 דקות.
  7. דגירה תאים עבור 2 שעות באווירה 5% CO 2 (v / v) humidified על 37 מעלות צלזיוס. בעדינות מערבולת ההשעיה תא כל 15 דקות.
  8. בהתאם לצורך, לאשר גיוס של נמק על ידי cytometry זרימה באמצעות הכנה נפרדת של neתאי crotic (או על ידי הזמנה כמה תאים למטרה זו), כפי שתוארו לעיל 6,9,10,15.
    הערה: תאי נקרוטי יש מקרע קרום תא, ומופיע כתאי PI-החיובי של גודל תא גדל (יחסית תאי קיימא). באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, הכנות טיפוסיות מכילות תאי נימקי ≥ 95%. לחלופין, אינדוקציה של נמק ואובדן שלמות הממברנה עשויה להיות מאושרת על ידי מכתים כחול Trypan.

4. הכנת תאים המגיב BU.MPT (פרוטוקול 3)

הערה: פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור תאי BU.MPT כמקור תאים מגיבים. לחלופין, קו לתא אחר, או תרבית תאים ראשונית, יכול לשמש תאים מגיבים. קודם לשימוש ניסיוני, קפאון עלול להיגרם הלילה על ידי פרוטוקולים סטנדרטיים בתוך המעבדה.

  1. לגדל תאים BU.MPT במנות בתרבית רקמה סטרילית 100 מ"מ בתנאים מתירנית במדיום התרבות ב 10 מ"ל לכל צלחת עד להשגת ~85% מפגש.
  2. לשאוב בינוני תרבות A, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם B בינוני התרבות ב 10 מ"ל לכל לשטוף. סרום להרעיב את התאים לילה עבור 18 עד 24 שעות ב 5% humidified (v / v) באווירה CO 2 בתנאים אוֹסְרָנִי (כלומר ב 39 ºC בתרבות B הבינוני ב 10 מ"ל לכל צלחת), כמתואר בסעיף 1.2 .4, על מנת לגרום קפאון. לחלופין, לגדל תאים B בינוני תרבות בתוספת 10% (v / v) FBS ב 39 ºC ליום אחד לפני בתאי הרעבה סרום לילה B במדיום תרבות ללא FBS.
  3. לייבל צלחת בתרבית רקמה נפרדת של תאים ומחוברות BU.MPT עבור כל תנאי ניסוי.
  4. כלול את השישה התנאים הבאים: גירוי של מגיבי BU.MPT קיימא עם גורם גדילה או רכב או באפידרמיס (EGF) במשך 15 דקות, לאחר חשיפתם למשך 30 דקות כדי מוסדות לא תאים, תאים אפופטוטיים, או תאי נימקים.
    הערה: חשיפת תאים מתים עשויה גם לעורר או לעכב את רמת הפעילות של החייל אמריקאיven איתות מולקולה. גירוי מזוהה הטוב ביותר מעל בסיס נמוך (למשל, בהעדר EGF), ואילו עיכוב מזוהה הטוב ביותר מנקודת התחלה גבוהה (למשל, נוכחות של EGF). מאז את ההשפעה של גירויים עם תאים מתים שהוא מלכתחילה לא ידוע, מומלץ לבצע את כל המחקרים בשני בהעדר ואת הנוכחות של EGF.

גירוי 5. של תאים מגיבים עם אפופטוטיים תאי נקרוטי (פרוטוקול 4)

  1. לשאוב B הבינוני תרבות מן הכלים מראש שכותרתו של שקט (מורעב בסרום) BU.MPT תאים מגיבים (פרוטוקול 3).
    הערה: לאחר תרבות הלילה בתנאים אוֹסְרָנִי, תאי BU.MPT צריכה להתנהג כמו תרבויות עיקריות של PTEC כליות עכבר.
  2. לכל 100 צלחת מ"מ, להוסיף 2 מ"ל של אחת מהפעולות הבאות: B בינוני תרבות (לא התאים); ההשעיה תאים אפופטוטיים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מ"ל ב B בינוני תרבות (פרוטוקול 1); או השעית תא נימקים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל i מיליליטרn התרבות בינוני B (פרוטוקול 2).
    1. הפץ את ההשעיה מ"ל 2 של תאים מתים באופן שווה על פני צלחת 100 מ"מ, ולשמור את הזמן עבורם להתיישב עד למינימום. כדי להשיג זאת, להפיץ את ירידת השעית תא המתה אחר טיפה עם טפטפת קצה רחב על פני כל השטח של מנות התא המגיב. השתמש נפח של 2 מ"ל כפשרה בין מזעור זמן שיקוע הימנעות ובהצטברויות תאים מתים.
      הערה: שימוש השעיה של תאים מתים כגירוי כרוך מספר שיקולים מיוחדים, אשר יתוארו להלן ביתר פירוט (טבלה 2 ודיון).
    2. להשיג יחס תאים מתים אל המגיב של ~ 1: 1 על ידי הוספת 2 מ"ל של תאים מתים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מ"ל לצלחת מ"מ ומחוברות 100, המכיל ~ 10 x 10 6 תאים. לחלופין, על מנת לבסס את התלות במינון של אירועי איתות ציינו, לשנות את היחס בין מתי תאים המגיב באופן רציף על ידי דילול פרוגרסיבית כתB הבינוני יור של השעיות תאים המתות ערוכות פרוטוקולי 1 ו -2.
  3. מערבולת בעדינות את הכלים, אז לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% humidified (v / v) CO 2 באטמוספרה.
  4. לאחר 30 דקות, לגרות את התאים המגיבים עם רכב משני או 50 EGF ננומטר, פי-התיוג מראש של מנת התרבות.
  5. דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה 2 5% humidified (v / v) CO.
  6. לשטוף את התאים המתים על ידי הוספת 5 מ"ל של DPBS 1x קר כקרח, מתערבל צלחת, ו aspirating נוזל הכביסה. חזור שלוש פעמים.
  7. מיד למקום את הכלים התא המגיב על הקרח לעיבוד נוסף.
  8. כן lysates תא
    1. הכן חיץ תמוגה התא המכיל את הפעולות הבאות: 1 × טריס שנאגרו מלוחים (TBS), 10 מ"מ pyrophosphate נתרן, 0.5% w / v deoxycholate, 0.1% w / v SDS, 10 גליצרול%, פלואוריד נתרן 25 מ"מ.
      1. בסמוך לפני התא תמוגה, להוסיף את הדברים הבאים לפי הסדר המדויק שניתנו בבית indריכוזים icated: מעכבי פרוטאז קוקטייל EDTA ללא מיני (1 טבליה לכל 10 מ"ל של חיץ תמוגה), 10% (v / v) טריטון X-100, 1 dithiothreitol מ"מ (DTT), 1 מ"מ פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF), ו -10 orthovanadate נתרן מ"מ.
    2. הוסף 700 μL של חיץ תמוגה תא קר כקרח ל -100 מ"מ צלחת של תאי מגיב מגורה טרי על קרח משלב 5.7. לגרד תאים עם מגרד תא, ולהעביר את lysate מראש צונן 1.5 microtubes מ"ל. שמור את הצינורות על קרח במשך 15 דקות.
    3. lysates Sonicate על קרח עם 10 פעימות של 20 הרץ, פחות כל שנייה אחת משך. הימנע יצירת קצף על ממשק גז / נוזל, כמו זה יכול לחמם יותר מדי את הדגימות. לגמרי לטבול את החללית sonicator לתוך microtubes המכילים lysates לפני ההפעלה החוזרת של sonicator על ולהפעיל את sonicator מעל לפני הסרת החללית מן lysates.
    4. צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C, להעביר את supernatants לתוך microtubes מראש צונן טריים, ולאחסן ב -70 ºC.
    5. בצע ג'ל אלקטרופורזה ו immunoblotting על supernatants של lysates, כפי שתואר לעיל 6,9,10,15.

6. מניעת מגע פיזי ישיר בין מטרות המגיבים באמצעות ממברנה פוליקרבונט Semipermeable (פרוטוקול 5)

  1. כן תאים מגיבים BU.MPT פי פרוטוקול 3, עם יוצא מן כלל אחד; לגדל תאים בתרבית רקמה פוליסטירן סטרילי מטופלים אשכולות 12 גם.
  2. בבארות שנבחרו, להציב מערכת תמיכה חדירה המכילה קרום פוליקרבונט 0.4 מיקרומטר כדי למנוע אינטראקציה פיזית בין תאים מתים מגיבים. כלול בארות שליטה ללא קרום באותו ניסוי.
  3. לשאוב בינוני תרבות B מבארות ניסיוני של תאים המגיב BU.MPT מורעבים בסרום.
  4. עקוב פרוטוקול 4 לגירוי של תאים מגיבים עם תאים אפופטוטיים או נימקים, בשינויים הבאים:
    1. לכל טוב של 1אשכול 2-היטב, להוסיף 0.1 מ"ל של אחת מהפעולות הבאות: B בינוני תרבות (לא התאים); ההשעיה תאים אפופטוטיים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מ"ל ב B בינוני תרבות (פרוטוקול 1); או השעית תא נימקים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר ב B הבינוני תרבות (פרוטוקול 2).
      הערה: כתוצאה היטב ומחוברות של אשכול 12 גם מכיל ~ 0.5 x 10 6 תאים, תוספת של 0.1 מ"ל של תאים מתים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר מניב יחס תאים מתים אל המגיב של ~ 1: 1.
    2. כדי בארות המכילות את מערכת התמיכה החדירה, להוסיף את התאים המתים על גבי הממברנה פוליקרבונט 0.4 מיקרומטר בתוך מערכת התמיכה החדירה, כך שאין אינטראקציה פיזית ישירה בין תאים מתים מגיבים.

7. עיכוב של Phagocytosis עם Cytochalasin D (פרוטוקול 6)

  1. כן תאים מגיבים BU.MPT פי פרוטוקול 3.
  2. הכן את D cytoskeletal מעכב cytochalasin ב dimethsulfoxide י.ל. (DMSO) בשעה 4 מ"ג / מ"ל ​​(1,000 ×). הוסף מנות מראש שכותרתו של תאים המגיב BU.MPT או 10 μL של הרכב (DMSO) או 10 μL של D cytochalasin כדי להשיג ריכוז סופי של 4 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב 10 מ"ל של מדיום תרבות B.
    הערה: ריכוז זה של cytochalasin D, phagocytosis על ידי תאי BU.MPT וקו תא מקרופאג היה עצור על ידי ≥90% 9,10.
  3. דגירה של 2 שעות ב 37 ºC באווירה 2 5% humidified (v / v) CO.
  4. עקוב פרוטוקול 4 לגירוי של תאים מגיבים עם תאים אפופטוטיים או נימקים.
  5. בהתאם לצורך, לאשר עיכוב של phagocytosis של תאים מתים על ידי cytometry זרימה באמצעות תכשיר נפרד של תאים מתים מגיבים (או תאים שמורים למטרה זו), כפי שתוארה לעיל 9,10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באיור 1, אנו מספקים סכמטי המתאר את צעדי העיתוי קריטי מעורבים בהכנת תאים אפופטוטיים (פרוטוקול 1) ותאי נימקים (פרוטוקול 2) ואת הגירוי של תאים מגיבים עם השעיות של תאים אפופטוטיים, נימקים (פרוטוקול 4).

באיור 2, אנו מספקים תוצאות נציג מראה את ההשפעה של תאים אפופטוטיים על זירחון של שני isoforms של synthase גליקוגן קינאז ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מספקים כאן פרוטוקול לאפיון אירועי האיתות התאי מושרים תאי קיימא לאחר חשיפתם לתאים העוברים אפופטוזיס, או צורות אחרות של מוות של תאים. הפרוטוקול מדגיש את מספר מנגנונים שבאמצעותם חשיפת תאי אפופטוטיים יכולה לווסת מסלולי איתות תאיים בתוך תאי המגיב קיימא. מנגנונים אלה כוללים: האינטראקציה (באמצעות גישור מולקולות או גורמי שטח על התאים המתים או שלפוחיות microvesicles הסככה שלו, לעתים קרובות כינו גופים אפופטוטיים) עם קולטן ספציפי על התא המגיב; השחרור מתווך מסיס (או אפילו דור תאיים שלהם <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה, כולה או חלקה, על ידי מימון מוסדי של ד"ר חוסה א. ארודה והמחלקה לנפרולוגיה, אוניברסיטת אילינוי בשיקגו (ל-J. S. L.); ומימון מהמחלקה לרפואה של אוניברסיטת מקגיל ומכון המחקר של מרכז הבריאות של אוניברסיטת מקגיל (ל-J. R.)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חומרי תרבית תאים חזקים>
DMEM, 1x עם [4.5 גרם/ליטר] גלוקוז, ʟ-גלוטמין ונתרן-פירובטMediatech (Manassas, VA)10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, סרום בקר עובריGE Healthcare (לוגן, יוטה)SH30066.03הוסף 10% (v/v)  למדיום התרבות
פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין, 100xLife Technologies (גרנד איילנד, ניו יורק)10378-016מוסיפים 100 יחידות/מ"ל למצע התרבות A ו-B
γ-אינטרפרון, רקומביננט עכבר, מ-Escherichia coliCalbiochem, Millipore (Billerica, MA)407303להוסיף 10 יחידות/מ"ל למדיום התרבית כלים
שטופלו בתרבית רקמות פוליסטירן פלקון, קורנינג לא פירוגני(דורהאם, קרוליינה הצפונית)353003סטרילי,
צינורות צנטריפוגה מפוליסטירן פלקון(דורהאם, קרוליינה הצפונית)352095סטרילי, 15 מ"ל
טריפסין-EDTA, 0.05%, ג'יבקופישר (וולת'אם, מסצ'וסטס)25300062סטרילי, 100 מ"ל
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>קטלוג<חזק>הערות
<חזק>כימיקלים ומעכבים
סטאורוספורין, מStreptomyces sp.סיגמא (סנט לואיס, מיזורי)S4400השתמש ב-[1 μ גרם/מ"ל] למשך 3 שעות כדי לגרום לאפופטוזיס
גורם גדילה אפידרמלי (EGF), [1 מ"ג/מ"ל]Millipore (Billerica, MA)EA140שימוש ב-50 ננומטר כדי לעורר תאי תגובה
UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0Life Technologies (גרנד איילנד, ניו יורק)15575-038השתמש ב-5 מ"מ כדי לנתק תאים נצמדים
תמיסה כחולה טריפאן, 0.4%MP ביו-רפואיים (סנטה אנה, קליפורניה)91691049לצביעה של
תאים מתיםתמיסת פרפורמלדהיד, 4% ב-DPBSAffymetrix (סנטה קלרה, קליפורניה)19943משתמשים ב-0.4% (v/v) ב-1x DPBS לקיבוע תאים
תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) של Dulbecco, 1x, GibcoLife Technologies (גרנד איילנד, ניו יורק)14040133תמיסת
מלח חוצצת פוספט (DPBS) של Dulbecco, Ca2+- ו-Mg2+-free, 1x, GibcoLife Technologies (גרנד איילנד, ניו יורק)14190367תמיסת מלאי
Cytochalasin D, 4 מ"מ בדימתיל סולפוקסיד (DMSO), משימוש Zygosporium mansoniiSigma (סנט לואיס, מיזורי)C8273ב [4 μ גרם/מ"ל] לעיכוב פגוציטוזיס
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא (סנט לואיס, מיזורי)D2650ממס עבור ציטוכלזין D
[header]
<מרכיבי חיץ ליזיס תאים חזקים>
Tris-buffered מלח (TBS), 10x, pH 7.4BioRad (הרקולס, קליפורניה)1706435עבור מאגר ליזה של תאים
נתרן פירופוספטסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)22136810 מ"מ למאגר ליזה של תאים
נתרן דאוקסיכולטסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)D67500.5% w/v עבור מאגר ליזה של תאים
נתרן דודציל סולפט (SDS)סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)L3771 0.1% W/V עבור מאגר ליזה של תאים
גליצרולסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)G551610% למאגר ליזה של תאים
נתרן פלואורידסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)45002225 מ"מ למאגר ליזה של תאים
טבלית קוקטייל מעכב פרוטאז מיני נטול EDTA רושדיאגנוסטיקה (אינדיאנפוליס, אינדיאנה)4693159001למאגר ליזה של תאים, טבליה אחת לכל 10 מ"ל של מאגר
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, MO)T878710% עבור מאגר ליזה תאים
Dithiothreitol (DTT)MP Biomedicals (סנטה אנה, קליפורניה)11DTT000051 מ"מ עבור מאגר ליזה של תאים
פניל מתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF)MP Biomedicals (סנטה אנה, קליפורניה)48002631 מ"מ עבור מאגר ליזה של תאים
נתרן אורתוונדאטMP ביומדיקל (סנטה אנה, קליפורניה)215966410 מ"מ עבור מאגר
ליזה של תאים<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>קטלוג<חזק>הערות
<חזק>ציוד
סורוול T6000B צנטריפוגהדו פונט (ווילמינגטון, DE)T6000B
Fisher Tissuemat, אמבט מיםפישר (וולת'אם, מסצ'וסטס)
Sonic Dismembrator (סוניקטור), דגם 100פישר (וולת'אם, מסצ'וסטס)
<תא ספירת תאים חזק>שונות
תא ספירת תאים, נויבאוארהוקסלי (Lancing, סאסקס, בריטניה)AC2000
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit IIMillipore (Billerica, MA)CBA059עבור צביעת PI ו-Annexin V לקביעת שלב האפופטוזיס
צינורות מיקרוקנטריפוגה של אפנדורף, 1.5 מ"לסיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי)T9661
תמיכה חדירה בטרנסוול, 0.4 μ m קרום פוליקרבונטקורנינג (קורנינג, ניו יורק)3413סטרילי, פוליסטירן, תרבית רקמות מטופלת
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>קטלוג<חזק>הערות
<חזק>נוגדנים
פוספו-גליקוגן סינתאז קינאז-3&אלפא;/&בטא; (GSK-3α/β) (Ser21/9), נוגדן רב-שבטיטכנולוגיית איתות תאים9331נוגדן רב-שבטי ארנב
גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) אנטובודי חד-שבטי ((14C10))טכנולוגיית איתות תאים2118נוגדן חד שבטי ארנב
בקוטר 100 מ"מ, קורנינג תחתון חרוטי

מקורות

  1. Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
  2. Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
  3. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748(2013).
  4. Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
  5. Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
  6. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
  7. Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
  8. Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
  9. Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
  10. Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
  11. Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
  12. Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
  13. Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
  14. Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
  15. Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
  16. Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
  17. Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13(2010).
  18. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
  19. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
  20. Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
  21. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51(2009).
  22. Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
  23. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
  24. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
  25. Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
  26. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
  27. Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GSK3
זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.