מאמר שיטה

הכנת תסיסנית והדמיה אורכית תפקוד הלב in vivo באמצעות מיקרוסקופית קוהרנטיות אופטית (OCM)

DOI:

10.3791/55002

⸱

12 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioengineering Program, Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering, Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, מתוארים פרוטוקולי הניסוי להכנת דרוזופילה בשלבי התפתחות שונים וביצוע הדמיה אופטית אורכית של פעימות הלב של דרוזופילה באמצעות מערכת מיקרוסקופיה קוהרנטית אופטית מותאמת אישית (OCM). ניתן לאפיין את השינויים המורפולוגיים והדינמיים הלבביים באופן כמותי על ידי ניתוח הפרמטרים המבניים והתפקודיים של הלב מתמונות OCM.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר אורך של פעימות הלב בבעלי חיים קטנים תורם להבנת שינויים מבניים ותפקודיים במהלך התפתחות הלב. מיקרוסקופ קוהרנטיות אופטי (OCM) הוכח כמסוגל לדמות לבבות של בעלי חיים קטנים ברזולוציה מרחבית גבוהה ומהירות הדמיה גבוהה במיוחד. ניגודיות התמונה הגבוהה והמאפיינים הלא פולשניים הופכים את OCM לאידיאלי לביצוע מחקרי אורך ללא צורך בחיתוך רקמות או צביעה. דרוזופילה נמצאת בשימוש נרחב כאורגניזם מודל במחקרי התפתחות לב בשל המספר הגבוה של גנים אורתולוגיים למחלות אנושיות, הדמיון שלה במנגנונים מולקולריים ומסלולים גנטיים עם בעלי חוליות, מחזור החיים הקצר שלה ועלות התרבות הנמוכה שלה. כאן, מתוארים פרוטוקולי הניסוי להכנת דרוזופילה והדמיה אופטית של פעימות הלב עם מערכת OCM מותאמת אישית לאורך מחזור החיים של הדגימה. על ידי ביצוע השלבים המפורטים בדוח זה, ניתן לרכוש תמונות רוחביות במצב M ותלת מימד OCM לביצוע מחקרי אורך של המורפולוגיה והתפקוד הלבבי של דרוזופילה. תמונות ה-OCM בחתך הפנים והציר והיסטוגרמות של קצב הלב (HR) ותקופת הפעילות הלבבית (CAP), הוכחו גם כמנתחים את השינויים המבניים של הלב ומכמתים את הדינמיקה של הלב במהלך המטמורפוזה של דרוזופילה, בשילוב עם הסרטונים שנבנו עם תמונות מצב M כדי לעקוב אחר פעילות הלב באופן אינטואיטיבי. בשל הדמיון הגנטי בין דרוזופילה לחולייתנים, מחקר אורך של מורפולוגיה ודינמיקה של לב בזבובי פירות יכול לעזור לחשוף את מקורן של מחלות לב אנושיות. הפרוטוקול כאן יספק שיטה יעילה לביצוע מגוון רחב של מחקרים להבנת המנגנונים של מחלות לב בבני אדם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר אורך של הלב בחיות קטנות תורם להבנת מגוון רחב של מחלות לב וכלי דם אנושיות קשורות, כגון מומי לב מולד הקשורים גן 1,2. בעשורים האחרונים, במודלים של בעלי חיים שונים, כגון 3,4 עכבר, 5,6 Xenopus, 7,8 דג זברה, עופות 9, ו תסיסנית 10-16, שמש לנהל בלב-התפתחות האנושית הקשורים במחקר. מודל העכבר כבר בשימוש נרחב ללמוד התפתחות לב חריגה נורמליות פנוטיפים פגמו לב עקב הדמיון שלה עם 3,4 לב האנושי. עובר Xenopus שימושי במיוחד בחקר התפתחות לב עקב טיפולה הקל 5,6 שקיפות חלקית. השקיפות של עובר ואת הזחל המוקדם של מודל דג הזברה מאפשרת תצפית אופטית קלה של ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מערכת OCM עבור דימות אופטי של תסיסנית 16

  1. בחר ספקטרומטר ומצלמת קו סריקה במהירות גבוהה המספקת מסגרת בשיעור של מסגרת 80 לפחות / sec כך שמערכת OCM תוכל לפתור את פעימות הלב של דרוזופילה.
  2. השתמש מקור אור בפס רחב על מנת להבטיח את הרזולוציה צירית של 2 מיקרומטר לזהות את מבנה הלב של דרוזופילה.
  3. השתמש אובייקטיבי 10X להשגת פתרון רוחבי גבוה.
  4. השתמש במראה מוט 45 ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה של הלב האורך נערך באמצעות זבובי פירות עם זן 24b-GAL4 / + בטמפרטורת החדר עם OCM. מדידות בוצעו L2, L3, ובאותו 8 במרווחים hr מ PD1 כדי PD4, ומבוגר יום 1 (AD1) כדי לעקוב אחר תהליך המטמורפוזה (טבלה 1). זחל, גולם מוקדם, גולם מאוחר זבובים בוגרים היו רכובים על שקופיות הזכוכית כפי שניתן לראות באיור 1 א. תכונות הקטע של הלב לזבובי זחל ובוגר הוצגו מצגי סכמטי באיור 1B.

.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קצב פעימות לב המהיר של תסיסנית, עם HR מקסימום בסביבות 400 פעימות לדקה בשלבי זחל ובוגר, דורש מהירות גבוהה הדמיה כדי לפתור את הלב diastoles ו systoles (לא פחות מ -80 מסגרות / שנייה מבוסס על חוויות). בשל עובי דופן לב בקנה מידה קאמרי לב קטן בגודל מיקרון (5 - 10 מיקרומטר), ברזולוציה מרחבית גבוהה (טובה יותר מ -2 מיקרומטר) נדרש לפתרון מבני צינור לב. במחקר זה, רזולוציה גבוהה ומערכת OCM מהירות ultrahigh פותחה, שבו ספקטרומטר עם 600 שורות / מ"מ שידור צורם ומצלמת קו-סריקת פיקסל .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים הקשורים למחקר הנוכחי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן הסטארט-אפ של אוניברסיטת ליהיי, ה-NIH (R00EB010071 ל-C.Z., R15EB019704 ל-C.Z ו-A.L., R03AR063271 ל-A.L., ו-R01AG014713 ו-R01MH060009 ל-R.E.T.), ה-NSF (1455613 ל-C.Z. ו-A.L.), הקרן לריפוי אלצהיימר (ל-R.E.T.), ובית החולים הכללי של מסצ'וסטס (פרס הוועדה המנהלת למחקר ל-A.L). M.C. ו-Y.M. נתמכו על ידי התוכנית הלאומית למחקר בסיסי של סין (תוכנית 973) תחת מענק מס' 2014CB340404.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת הדמיה מותאמת אישית OCMשפותחה במעבדה
שלנו שלי Temp Mini Digital IncubatorBenchmarkH2200-HC
כיסוי זכוכיתAmScope200PCS
Cotton BallRITE AID
Instant Drosophila FormulaCAROLINAפורמולה 4-24
שמריםActiveDry
מיקרוסקופSONYWILD M420
BrushLoew-Cornell245Bמשמש להעברת דגימות
תוכנת Labview NationalInstruments
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות
MatlabMathworks
פינצטהWihaAA SAלתיקון הפרי כנפי זבוב
FlyNapקרוליינה חברת אספקה ביולוגית4,224,898
סרט דו צדדי קבוע סקוטי, 3 מסקוטית
פישרברנדMU18837
אורגני תוספת שמןקוקוס עמק האביב13183
מיקרוסקופ שקופיתקפיטול מותגM3504-E
Drosophila בקבוקוניםSEOH8401SS
All-trans-retinalSigma-Aldrich Co.₪500
'פיפטה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MOCM

מאמרים קשורים