מאמר שיטה

הכנת תסיסנית והדמיה אורכית תפקוד הלב in vivo באמצעות מיקרוסקופית קוהרנטיות אופטית (OCM)

DOI:

10.3791/55002

⸱

12 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioengineering Program, Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering, Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, מתוארים פרוטוקולי הניסוי להכנת דרוזופילה בשלבי התפתחות שונים וביצוע הדמיה אופטית אורכית של פעימות הלב של דרוזופילה באמצעות מערכת מיקרוסקופיה קוהרנטית אופטית מותאמת אישית (OCM). ניתן לאפיין את השינויים המורפולוגיים והדינמיים הלבביים באופן כמותי על ידי ניתוח הפרמטרים המבניים והתפקודיים של הלב מתמונות OCM.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר אורך של פעימות הלב בבעלי חיים קטנים תורם להבנת שינויים מבניים ותפקודיים במהלך התפתחות הלב. מיקרוסקופ קוהרנטיות אופטי (OCM) הוכח כמסוגל לדמות לבבות של בעלי חיים קטנים ברזולוציה מרחבית גבוהה ומהירות הדמיה גבוהה במיוחד. ניגודיות התמונה הגבוהה והמאפיינים הלא פולשניים הופכים את OCM לאידיאלי לביצוע מחקרי אורך ללא צורך בחיתוך רקמות או צביעה. דרוזופילה נמצאת בשימוש נרחב כאורגניזם מודל במחקרי התפתחות לב בשל המספר הגבוה של גנים אורתולוגיים למחלות אנושיות, הדמיון שלה במנגנונים מולקולריים ומסלולים גנטיים עם בעלי חוליות, מחזור החיים הקצר שלה ועלות התרבות הנמוכה שלה. כאן, מתוארים פרוטוקולי הניסוי להכנת דרוזופילה והדמיה אופטית של פעימות הלב עם מערכת OCM מותאמת אישית לאורך מחזור החיים של הדגימה. על ידי ביצוע השלבים המפורטים בדוח זה, ניתן לרכוש תמונות רוחביות במצב M ותלת מימד OCM לביצוע מחקרי אורך של המורפולוגיה והתפקוד הלבבי של דרוזופילה. תמונות ה-OCM בחתך הפנים והציר והיסטוגרמות של קצב הלב (HR) ותקופת הפעילות הלבבית (CAP), הוכחו גם כמנתחים את השינויים המבניים של הלב ומכמתים את הדינמיקה של הלב במהלך המטמורפוזה של דרוזופילה, בשילוב עם הסרטונים שנבנו עם תמונות מצב M כדי לעקוב אחר פעילות הלב באופן אינטואיטיבי. בשל הדמיון הגנטי בין דרוזופילה לחולייתנים, מחקר אורך של מורפולוגיה ודינמיקה של לב בזבובי פירות יכול לעזור לחשוף את מקורן של מחלות לב אנושיות. הפרוטוקול כאן יספק שיטה יעילה לביצוע מגוון רחב של מחקרים להבנת המנגנונים של מחלות לב בבני אדם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר אורך של הלב בחיות קטנות תורם להבנת מגוון רחב של מחלות לב וכלי דם אנושיות קשורות, כגון מומי לב מולד הקשורים גן 1,2. בעשורים האחרונים, במודלים של בעלי חיים שונים, כגון 3,4 עכבר, 5,6 Xenopus, 7,8 דג זברה, עופות 9, ו תסיסנית 10-16, שמש לנהל בלב-התפתחות האנושית הקשורים במחקר. מודל העכבר כבר בשימוש נרחב ללמוד התפתחות לב חריגה נורמליות פנוטיפים פגמו לב עקב הדמיון שלה עם 3,4 לב האנושי. עובר Xenopus שימושי במיוחד בחקר התפתחות לב עקב טיפולה הקל 5,6 שקיפות חלקית. השקיפות של עובר ואת הזחל המוקדם של מודל דג הזברה מאפשרת תצפית אופטית קלה של 7,8 פיתוח לב. מודל העופות הוא נושא משותף של מחקרי לב התפתחותי becausדואר בלב ניתן לגשת בקלות לאחר הסרת קליפות ביצים ואת הדמיון המורפולוגי של לבבות עופות לבני אדם 9. המודל תסיסנית יש מספר מאפיינים ייחודיים ההופכים אותו לאידיאלי עבור ביצוע מחקרים ארוכי טווח של הלב. ראשית, הצינור בלב תסיסנית הוא ~ 200 מיקרומטר מתחת לפני השטח הגבה, אשר מספק נוחות עבור גישה אופטית ותצפית על הלב. בנוסף, מנגנונים מולקולריים רבים מסלולים גנטיים שמורים בין תסיסנית ובעלי החוליות. Orthologs של למעלה מ -75% מגני מחל אנושיות נמצאו תסיסנית, אשר הפכה אותו בשימוש נרחב במחקרים מהונדסים 11,13. יתר על כן, יש לו מחזור חיים קצר ועלויות תחזוקה נמוכות, ויש בו נעשה שימוש נפוץ כמודל דגימה למחקר בביולוגיה התפתחותית 14-16.

דיווחים קודמים תיאר את הפרוטוקולים לניטור תפקוד הלב תסיסנית כגון שהואArtBeat. עם זאת, תהליכים לנתיחה נדרשו 17,18. הדמיה אופטית מספקת דרך יעילה לחזות התפתחות לב בחיות בשל אופיו הלא-פולשנית. שיטות הדמיה אופטיות שונות יושמו במחקר לב חי ביצוע, כגון מיקרוסקופיה שני פוטונים 19, מיקרוסקופיה confocal 20,21, מיקרוסקופיה גיליון אור 22, ו טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) 16,23-26. יחסית, אוק הוא מסוגל לספק עומק הדמיה גדול בלבבות חיה קטנים ללא שימוש בחומרי ניגוד תוך שמירה על רזולוציה גבוהה מהירות הדמית ultrahigh, אשר חשובה לבעלי חי הדמיה לחיות. בנוסף, העלות הנמוכה של פיתוח מערכת אוקטובר יש לפופולרי בטכניקה זו דימות אופטית של דגימות. אוקטובר שימש בהצלחה עבור מחקר אורך של דרוזופילה. באמצעות אוקטובר, הדמיה מורפולוגית ופונקציונלית לב שבוצעה כדי ללמוד את מבנה הלב, funcתפקידים תזונתיים של גנים, ואת המנגנונים של מומים קרדיווסקולרים מודלי מוטציה במהלך התפתחות לב. לדוגמא, ירידה בתפקוד לב תלוי גיל קבלה אוששה הקשורות אנזים למטה מוסדר ההמרה-אנגיוטנסין (ACER) גנים תסיסנית עם אוקטובר 27. Phenotyping של קרדיומיופתיה גנים הקשורים הודגם תסיסנית באמצעות אוקטובר 28-33. המחקר באמצעות אוקטובר חשף גם את התפקיד הפונקציונלי של גן SOX5 אדם בלב תסיסנית 34. לעומת אוקטובר, OCM משתמשת אובייקטיבית עם צמצם מספרי גבוה כדי לספק רזולוציה רוחבית טוב יותר. בעבר, התפקוד לקוי הלב נגרם על ידי השתקת גני יממת אדם ortholog dCry / dClock נחקר באמצעות מערכת OCM מנהג 15,16, כמו גם את ההשפעה של דיאטה עתירה שומן על cardiomyopathies תסיסנית להבין אדם מושרה שמן מחלות לב. 15

הנה, הפרוטוקול דואר ניסוי מסוכם עבור מחקר אורך של שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים לב תסיסנית ב instar השני (L2), instar השלישי (L3), גולם יום 1 (PD1), גולם יום 2 (PD2), יום גולם 3 (PD3) גולם, יום 4 (PD4), גולם יום 5 (PD5), ומבוגרים (איור 1) באמצעות OCM להעמיק את הלימוד של מחלות לב מולדות אדם קשור. פרמטרים פונקציונלי לב, כגון משאבי אנוש CAP נותחו כמותית בשלבים התפתחותיים שונים כדי לחשוף את תכונות התפתחות הלב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מערכת OCM עבור דימות אופטי של תסיסנית 16

  1. בחר ספקטרומטר ומצלמת קו סריקה במהירות גבוהה המספקת מסגרת בשיעור של מסגרת 80 לפחות / sec כך שמערכת OCM תוכל לפתור את פעימות הלב של דרוזופילה.
  2. השתמש מקור אור בפס רחב על מנת להבטיח את הרזולוציה צירית של 2 מיקרומטר לזהות את מבנה הלב של דרוזופילה.
  3. השתמש אובייקטיבי 10X להשגת פתרון רוחבי גבוה.
  4. השתמש במראה מוט 45 ° כדי לשקף את קרן אור זרוע התייחסות כדי ליצור קרן אור זרוע מדגם טבעתית להאריך את עומק המיקוד של הדגימות.
  5. פיתוח תוכנת מחשב מותאם אישית כדי לשלוט במערכת OCM ולבצע מדידות.

2. תרבות תסיסנית

  1. הכנת אוכל לטוס תקן
    1. שים ~ 5 מ"ל נוסחה תסיסנית מיידית לתוך בקבוקון קלקרצינור בסיוע מצנח נייר.
    2. יוצקים ~ מי מיליליטר 8 לתוך הנוסחא להרוות את המזון כראוי.
    3. להוסיף תוספי מזון שונים על האוכל לטוס סטנדרט לניסויים שונים. כאשר מתכוננים All-טרנס -retinal (ATR) מזון עבור optogenetic צעדה הניסוי 35, השתמש פיפטה כדי לחלץ 100 מ"מ ATR ולפרוץ ~ 8 מ"ל מים כדי לקבל את ריכוז ATR של 1 מ"מ במזון. לאחר ערבוב פתרון אחיד, יוצקים את הפתרון לתוך נוסחה ומערבבים אותו במידה מספקת.
    4. כדי להכין דיאטה עתירת שומן ללימוד תפקוד הלב הקשורות להשמנה תסיסנית, 10,15 תמהיל ~ 10 מ"ל נוסחה עם 15 מ"ל מים בכוס וחום במשך 30 שניות במיקרוגל. שים קצת שמן קוקוס כתית מעולה אורגני בכוס אחרת ומחמם במשך 90 שניות במיקרוגל.
    5. חלץ 7.5 שמן קוקוס מ"ל ומערבבים עם הנוסחה מוכן מספיק כדי להפוך את יחס משקל / נפח של שמן קוקוס למזון ~ 30/100, ואת הen תמצית ~ 2 מ"ל מעורב המזון ולשים אותו לתחתית של התחתית.
    6. חכו דקות 1 עד בינוני רווי ביסודיות. לדחוס את המזון בקפדנות עם משטח שטוח כדי לייעל את תנאי החיים של דרוזופילה. להוסיף 6 - 8 גרגרי שמרי הנוסחא המוכנה, וחבר את הצינור עם מקבץ של כותנה.
  2. צלבי זבוב פרות ותרבות
    1. קח צינור עם אוכל לטוס תקן מוכן, ולהסיר את הכותנה הפקוקה. להעביר בזהירות את הזבובים הבוגרים (זכר ונקבה) אל הצינור, וחבר את הצינור עם כותנה מייד. בדוק את הכותנה לוודא כי אין פער בין כותנת קיר הצינור כדי למנוע זבובים לברוח מן הצינור.
    2. שמור על זבובי פירות בחממה ב 25 מעלות צלזיוס במשך הכלאות. רוב הגנים פעילים ואת החלבונים התאיים מסונתזים על 25 מעלות צלזיוס 36-39.
    3. להוציא את הצינורית מן החממה לאחר העברת יד 8 אdult טסה מתוך הצינור כדי להשיג את הביצים בגיל דומה לשליטה ניסיון.
    4. המשך culturing את הביצים באינקובטור ב 25 מעלות צלזיוס, שהיא הטמפרטורה תקן לפיתוח תסיסנית עם תקופת הפיתוח של 8.5 ימים 40,41.
      הערה: טמפרטורה משפיעה על תקופה התפתחותית (מביצה לבוגר) וביטוי ברמה של גנים שונים.

3. ביצוע דימות אופטי עם OCM

  1. זחל זבוב הר עבור דימות אופטי
    הערה: הביצה של פתחי תסיסנית ב -22 - 24 שעות של 25 מעלות צלזיוס כדי הזחל instar הראשון (L1). זחל instar השני מתגלה לאחר עוד 24 שעות. צורת הזחל הגדולה היא זחל instar השלישי, אשר molts לאחר כ -24 שעות. מאפיינים מבניים זחל יכולים לשמש כדי להבדיל בין שלבי ההתפתחות השונים שלהם. גודלו של איברי הפה בין instar הראשון ואת instar השני שונה. הפהווים של זחל instar הראשון הם מאוד קטנים נראים כמו שני זוגות של כתמים שחורים זעירים, תוך פי הווים של זחל instar השני הם גדולים יותר, המבנה ברור יותר. Spiracles משמש בדרך כלל כדי לזהות את instar השני ואת instar השלישי. זחל instar השני באלות spiracles הקדמי, בעוד, עבור instar השלישי, spiracles הקדמי הם מסועפים. טבעת כתום כהה תתחיל להופיע בקצה של spiracles האחורי של זחל instar השלישי.
    1. החלת נייר דבק דו צדדי לשקופית זכוכית מיקרוסקופ נקיה. להרחיק את בועות האוויר מתחת לסרט כדי למנוע ההשתקפויות שנגרמו על ידי בועות אוויר במהלך ההדמיה.
    2. קח את אחד הצינורות עם הזבובים התרבותיים החוצה מהחממה בשלב הזחל.
    3. זהה את הזחל בתקשורת, להסיר אותו מהתקשורת עם מברשת ומקום רך על טישו נקי. הסר את כל אוכל שדבק בו הזחל עם מברשת רכה רטובה וייבש אותו על הרקמה.
    4. הזז את Cleaned לטוס רקמה תחת העדשה האובייקטיבית של מיקרוסקופ שדה רחב.
    5. התאם את המיקוד של מיקרוסקופ כדי למצוא תצוגה ברורה של הזבוב. זהה את השלב ההתפתחותי התקין של הזחל על ידי המאפיינים המבניים שלה עם מיקרוסקופ.
    6. מקם את הזבוב באמצעות מברשת רכה. ודא הגוף ישר עם הצד הגבה פונה כלפי מעלה כדי להתכונן הרכבה בשקופית הזכוכית על ידי הצד הגבה. בצע פעולה זו תחת מיקרוסקופ.
    7. ודא הזחל הוא יבש לחלוטין לפני ההרכבה בקלטת. אחרת, הזחל לא ידבק לקלטת.
    8. היצמד הגבו בצד של הזבוב ממוקם לקלטת בצד הכפולה בשקופית הזכוכית עם לחץ מתון. שים לב יותר מדי לחץ יכול להרוג את הזבוב כוח מעט מדי יוביל לטוס התנועה במהלך ההדמיה.
  2. דימות אופטי של תסיסנית בשלבים הזחל (L2 ו- L3) עם OCM
    הערה: לומן רחב של צינור הלב יכול להיות FOund ממוקם במגזרי בין A5 ל A8 בשלבי הזחל (איור 1). התמונות הרוחביות OCM M-mode (2D + זמן) נרכשו על קטע A7 של צינור הלב עבור כל זחל כדי להקל על הסיסטולי וניתוח הדיאסטולי.
    1. מניח את הזחל רכוב על הבמה המדגמת מתכווננת של מערכת OCM לאורך בכיוון y-רוחבי עם הצד הגבה פונה כלפי מעלה מתחת העדשה האובייקטיבית. חור קטן במת המדגם הכרחי צבת הזחל להימנע מהמגע שלו עם המטוס הבמה.
    2. התאם את הבמה המדגמת להעביר את צינור הלב של זבוב הפרות למישור המוקד של קרן ההדמיה. כדי למצוא בקלות במגזר A7, למצוא באזור האחורי של צינור הלב עם בזמן אמת תמונות OCM חתכו בתוכנת רכישת תמונה. ואז להזיז את הבמה קדימה עד במגזר A7 גלוי.
    3. פרמטרי סט של תוכנת רכישת תמונה ל -100 A-סריקות לכל B-scan (מסגרת), 100 B-סריקות, ואת scanneמתח r לכסות ~ 0.28 מ"מ בכיוון x-רוחבי, ו -0 V לכיוון y-רוחבי. לחץ על הכפתור "התחל" בתוכנה לרכוש את נתוני רעש רקע רקע חיסור על ידי חסימת נתיב קרן המדגם עם בד כהה.
      הערה: 3 של 100 מסגרות ניתן להשתמש עבור רקע חיסור.
    4. פרמטרי סט של תוכנת רכישת נתונים 128 A-סריקות לכל B-scan, 4096 B-סריקות, ואת מתח הסורק לכסות ~ 0.28 מ"מ בכיוון x-רוחבי, ו -0 V לכיוון y-רוחבי. לחץ על הכפתור "התחל" בתוכנה לרכוש את תמונות M-mode הרוחבי על פני קטע A7 של צינור לב לטוס מעל אזור המשתרע 0.28 x 0.57 מ"מ 2 במשך כ -30 שניות.
    5. חסום את קורה ההדמיה באמצעות מטלית כהה בתהליך חיסכון הנתונים כדי למנוע חשיפה ממושכת של הלב לטוס אל אור ההדמיה.
    6. חזור על המדידה עבור 5 פעמים כדי לקבל מדידה אמינה של כיף הלבction.
    7. פרמטרי סט של תוכנת רכישת תמונה ל -400 A-סריקות לכל B-scan, 800 B-סריקות, ואת מתח הסורק לכסות ~ 1.7 מ"מ בכיוון x-רוחבי, ו ~ 4 מ"מ בכיוון y-רוחבי. הזז את הבמה בשני הכיוונים כדי להבטיח זבוב הפירות כולו ניתן הדמיה. לחץ על כפתור "התחל" בתוכנת לרכוש במערך אחד כדי להשיג תמונות של זבוב הפירות ב 3 מימדים. הערה: מבנה לטוס 3D יכול להיות שניתנו באמצעות תוכנת עמירה 3D
    8. השתמשו במברשת רכה רטובה כדי ללחלח לטוס מדודה בעדינות להסיר אותו משקופית הזכוכית. העבר אותו לתוך צינור נפרד עבור פיתוח מתמשך. לייבל הצינור עבור מחקר אורך דרך שלבי ההתפתחות הבאה.
  3. תמונת תסיסנית בשלבי גלמים
    הערה: כל זבובי פירות הוצאו הדמיה מן PD1 כדי PD5. כפי שניתן לראות את התרשים הזחל באיור 1b, לומן רחב נשאר A5 למגזרים A8 של הצינור לב דואר עד PD1. מ PD2, תא חרוטים מתחיל להתפתח בין A1 למגזרי A4. כדי לרכוש תמונות עקביות להקל על ניתוח לב, תמונות M-mode רוחביים התקבלו ממגזר A7 ב PD1, ומן מגזר A1 לאחר PD2, כמסומן באיור 1b.
    1. תסיסנית תמונה ב PD1
      הערה: תהיה תסיסנית puparium לבן עבור חלון זמן קצר (1 - 0 hr) במהלך PD1. חלון פעם הוא אידיאלי לביצוע הדמיה אופטית של גולם מוקדם כי תכלית השקיפות הגבוהה מובילה חדיר אור גבוה עבור הדמית OCM.
      1. כמו זבובי הפרות נמצאים על קיר הצינור כאשר הם הופכים גולם, להסיר את הגולם מן הצינורות בודדים עבור הדמית PD1 עם מברשת רכה רטובה, ולנקות את הגולם עם המברשת אם יש אוכל דבוק בגוף.
      2. הר זבוב הפרות בשקופית זכוכית קטנה ישירות עם המברשת הרטובה ולשמור בצד הגבה פונה כלפי מעלה (איור 1 א
      3. סר מים מופרזים מהצד של גוף הזבוב.
      4. שים את השקופית זכוכית על הבמה מדגם של מערכת OCM, שמירה על זבוב הפירות על גבי. מצא תמונה בזמן אמת ברורה של מגזר A7 של הלב לטוס ניצול אותה האסטרטגיה תארה במדידת הזחל.
      5. הגדר אותם הפרמטרים של התוכנה רכישת נתונים כאמור בסעיף 3.2, ותמונה פעימות בפלח A7 לרכוש תמונות M-mode ו 3D רוחבי.
      6. לאחר הדמיה, השתמש פינצטה למקום שקופיות זכוכית עם גולם בחזרה לתוך הצינור לתרבות רציפה.
    2. תסיסנית תמונה ב PD2 לשלבים PD5
      הערה: מאז הדגימה הופכת להיות יותר ויותר אטומים בשלבי הגלמים, עומק החדירה של מערכת ההדמיה יופחת.
      1. השתמש פינצטה להסרת s הזכוכית בזהירותLIDE רכוב עם זבוב ממרחק PD2 מהצינור הדמיה. בשעת PD2, קליפת הדגימה הופכת צהבהבה והגוף הופך להיות פחות שקוף לעומת PD1 (איור 1).
      2. שים את השקופית על הבמה מדגם של מערכת OCM.
      3. התאם את הבמה המדגמת להעביר את הזבוב לתוך מטוס המוקד של קרן הדמיה של מערכת OCM. מצא את הקצה הקדמי של צינור הלב עם תמונת OCM חתך בזמן אמת. זז ~ 50 מיקרומטר חזרה לכיוון האחורי כדי למצוא את קטע A1 של צינור הלב.
        הערה: בשלב זה של התפתחות הלב (PD2), תא חרוטי יהיה קטן מאוד ולא ניתן להכות.
      4. אסוף מערכי נתוני M-mode רוחביים ממגזר A1 וכן נתוני 3D תוך שימוש באותה השיטה כמו שלבי התפתחות קודמים.
      5. שים את השקופית חזרה לתחתית בזהירות לתרבות רציפה.
        הערה: בשעת PD3, הצבע של הדגימה במעטפת הוא כהה יותר, כי בשלב PD2. בשלב PD4, פסים שחורים can להיבחן בתוך הקונכייה של דגימות. כמה זבובים יתפתחו למבוגרים בשלב זה להיכנס ביום המחרת, בעוד שאחרים יתפתחו PD5. בשלב PD5, פסים שחורים הם אפילו יותר ברור לראות זבובי פירות. זבובים אלה יהפכו למבוגרים למחרת.
  4. תסיסנית תמונה בשלב למבוגרים
    הערה: בשלב המבוגר, זבובים נשיים וגבריים ניתן להבחין לפי גודל הגוף ואת הצבע של הבטן התחתונה. יש נקבה מבוגרת בגודל גדול יותר, בעוד זכרים קטנים וכהים בצבע בבטן התחתונה.
    1. קח את הצינור החוצה מהחממה כאשר זבוב הפירות מתפתח מבוגר, ולהעביר המבוגר לטוס בקבוקון ריק ~ 45 מ"ל.
    2. טובל את הקצה הסופג (~ 1 סנטימטר אורך, ~ 3 מ"מ קוטר) של שרביט לתוך ההרדמה, לשים את השרביט לתוך הבקבוקון, וחבר את הצינור עם מקבץ של כותנה לשמור בסוף ההרדמה ממש מתחת הכותנה הפקוקה וכדי Anesthetize לטוס במשך 3 דקות. משך ההרדמה תלוי בגודל של הזבוב, ועשוי להשתנות בין 2.5 כדי 3.5 דקות (למשל: זכר עבור 2.5 דקות, נקבה במשך 3 או 3.5 דקות).
    3. כן שקופית זכוכית עם חתיכת סרט דו צדדי.
    4. הזז את הזבוב מורדם לשקופית זכוכית עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה באמצעות מברשת רכה.
    5. הפרד את הכנפיים בעזרת פינצטה ולתקוע את הכנפיים בקלטת תחת מיקרוסקופ כדי לתקן את הזבוב לחשוף באזור הלב הדמיה.
    6. תמונה לטוס ממגזר A1 של לב הזבוב (איור 1). בסוף הניסוי, זבובים עלולים להיות קורבן.

4. הדמית ניתוח 16

  1. לפתח תוכניות Matlab להמיר את הקבצים הבינאריים 2D and 3D שנאספו עם תוכנת רכישת תמונה לקבצי תמונה.
  2. השתמש ImageJ לזהות את האזור הצינור לב בתמונות M-mode רוחבי אלגוריתם מטה קסמים createa מסכה של אזור לב לכל תמונת M-mode רוחבי. מגזר באזור הרעול הפנים ולהשתמש אלגוריתם מציאת שיא לזהות את מיקומי הסיסטולי והדיאסטולי. חשב את שינויי לב בקוטר תלוי זמן מהתמונות הרוחביות M-mode.
  3. בהתבסס על בקטרי לב התלויים רכש זמן, לחשב את הפרמטרים של לב כגון משאבים אנושים, תקופת פעילות לב (CAP), בקוטר דיאסטולה סוף (EDD), בקוטר התכווצות הסוף (ESD), אזור דיאסטולה סוף (EDA), ולסיים באזור התכווצות ( ESA). חשבתי את הקיצור החלקי (FS) עם figure-protocol-1
  4. השתמש ImageJ לנתח את תמונות 3D OCM לדמיין את ההתפתחות המבנית של הלב לטוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה של הלב האורך נערך באמצעות זבובי פירות עם זן 24b-GAL4 / + בטמפרטורת החדר עם OCM. מדידות בוצעו L2, L3, ובאותו 8 במרווחים hr מ PD1 כדי PD4, ומבוגר יום 1 (AD1) כדי לעקוב אחר תהליך המטמורפוזה (טבלה 1). זחל, גולם מוקדם, גולם מאוחר זבובים בוגרים היו רכובים על שקופיות הזכוכית כפי שניתן לראות באיור 1 א. תכונות הקטע של הלב לזבובי זחל ובוגר הוצגו מצגי סכמטי באיור 1B.

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קצב פעימות לב המהיר של תסיסנית, עם HR מקסימום בסביבות 400 פעימות לדקה בשלבי זחל ובוגר, דורש מהירות גבוהה הדמיה כדי לפתור את הלב diastoles ו systoles (לא פחות מ -80 מסגרות / שנייה מבוסס על חוויות). בשל עובי דופן לב בקנה מידה קאמרי לב קטן בגודל מיקרון (5 - 10 מיקרומטר), ברזולוציה מרחבית גבוהה (טובה יותר מ -2 מיקרומטר) נדרש לפתרון מבני צינור לב. במחקר זה, רזולוציה גבוהה ומערכת OCM מהירות ultrahigh פותחה, שבו ספקטרומטר עם 600 שורות / מ"מ שידור צורם ומצלמת קו-סריקת פיקסל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים הקשורים למחקר הנוכחי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן הסטארט-אפ של אוניברסיטת ליהיי, ה-NIH (R00EB010071 ל-C.Z., R15EB019704 ל-C.Z ו-A.L., R03AR063271 ל-A.L., ו-R01AG014713 ו-R01MH060009 ל-R.E.T.), ה-NSF (1455613 ל-C.Z. ו-A.L.), הקרן לריפוי אלצהיימר (ל-R.E.T.), ובית החולים הכללי של מסצ'וסטס (פרס הוועדה המנהלת למחקר ל-A.L). M.C. ו-Y.M. נתמכו על ידי התוכנית הלאומית למחקר בסיסי של סין (תוכנית 973) תחת מענק מס' 2014CB340404.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת הדמיה מותאמת אישית OCMשפותחה במעבדה
שלנו שלי Temp Mini Digital IncubatorBenchmarkH2200-HC
כיסוי זכוכיתAmScope200PCS
Cotton BallRITE AID
Instant Drosophila FormulaCAROLINAפורמולה 4-24
שמריםActiveDry
מיקרוסקופSONYWILD M420
BrushLoew-Cornell245Bמשמש להעברת דגימות
תוכנת Labview NationalInstruments
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות
MatlabMathworks
פינצטהWihaAA SAלתיקון הפרי כנפי זבוב
FlyNapקרוליינה חברת אספקה ביולוגית4,224,898
סרט דו צדדי קבוע סקוטי, 3 מסקוטית
פישרברנדMU18837
אורגני תוספת שמןקוקוס עמק האביב13183
מיקרוסקופ שקופיתקפיטול מותגM3504-E
Drosophila בקבוקוניםSEOH8401SS
All-trans-retinalSigma-Aldrich Co.₪500
'פיפטה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021(2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213(2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236(2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425(2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425(2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014(2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313(2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020(2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639(2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MOCM

מאמרים קשורים