מאמר שיטה

שיטה למדידת מטבוליזם ב ממוינות תת-אוכלוסיות של קהילות Cell מורכבות באמצעות איתור איזוטופ יציב

DOI:

10.3791/55011

⸱

4 בפברואר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Unit of Computational Medicine, Karolinska Institutet, 2Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Division of Physiological Chemistry 2, Karolinska Institutet, 4Department of Medicine, University of California San Diego

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר שיטה לחקר חילוף חומרים תאי בקהילות מורכבות של סוגי תאים מרובים, תוך שימוש בשילוב של מעקב איזוטופים יציב, מיון תאים לבידוד סוגי תאים ספציפיים וספקטרומטריית מסה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סוגי תאי יונקים מציגים חילוף חומרים מיוחד, וישנן עדויות רבות לכך שסוגי תאים שונים הקיימים במקביל עוסקים בשיתוף פעולה מטבולי. יתר על כן, אפילו תרביות מסוג תא בודד עשויות להכיל תאים במצבים מטבוליים מובחנים, כגון תאים במנוחה או במחזור. שיטות למדידת פעילויות מטבוליות של תת-אוכלוסיות כאלה הן כלים רבי ערך להבנת חילוף החומרים התאי. אוכלוסיות תאים מורכבות מופרדות לרוב באמצעות סדרן תאים, ותת-אוכלוסיות מבודדות בשיטה זו ניתנות לניתוח בשיטות מטבולומיות. עם זאת, בעיה בגישה זו היא שהליך מיון התאים חושף את התאים ללחצים שעלולים לעוות את חילוף החומרים שלהם.

כדי להתגבר על בעיות אלה, הגענו למסקנה שהתפלגות איזוטופומרים המוניים (MIDs) של מטבוליטים מתאים שגודלו עם חומרים מזינים יציבים מסומנים באיזוטופים עשויה להיות יציבה יותר מריכוזי מטבוליטים מוחלטים, מכיוון ש-MIDs נוצרים בטווחי זמן ארוכים יותר וצריכים להיות מושפעים פחות מחשיפה לטווח קצר לתנאי מיון תאים. כאן, אנו מתארים שיטה המבוססת על עיקרון זה, המשלבת מיון תאים עם כרומטוגרפיה נוזלית - ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (LC-HRMS). ההליך כולל ניתוח שלושה סוגים של דגימות: (1) תמציות מטבוליט המתקבלות ישירות מהאוכלוסייה המורכבת; (2) תמציות של תאים "ממוינים מדומים" שהועברו דרך מכשיר מיון התאים מבלי לשער אוכלוסייה ספציפית כלשהי; ו-(3) תמציות של האוכלוסיות הממוינות בפועל. התאים הממוינים המדומה מושווים מול מיצוי ישיר כדי לוודא ש-MIDs אכן אינם משתנים על ידי הליך מיון התאים עצמו, לפני ניתוח האוכלוסיות הממוינות בפועל. אנו מראים תוצאות לדוגמה מתאי HeLa ממוינים לפי שלב מחזור התא, וחושפים שינויים במטבוליזם של נוקלאוטידים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצורים עילאיים להכיל קהילות שלמות מורכבות של סוגי תא ברורים כי לשתף פעולה כדי להביא פונקציות מורכבות יותר. לדוגמא, גידולים לכלול לא רק תאים סרטניים, אלא גם פיברובלסטים, תאים המהווים כלי דם, ולעתים קרובות תא חיסון מחלחל 1; דם מכיל תערובת מורכבת של עשרות תת תא חיסון 2; ואפילו שורות תאים בתרבית עשויות להיות מורכבות תת-אוכלוסיות מרובות, כגון לומינל, תת בסיס של תאי סרטן השד 3. יתר על כן, סוגי תא ברורים כי לדור בכפיפה אחת יכול להפגין מטבולית "שיתוף פעולה". לדוגמה, במוח, האסטרוציטים הם חשבו להמיר גלוקוז לקטט, אשר אז "הפד" לנוירונים כי לחמצן מצע זה 4; לימפוציטים מסוג T הם בהקשרים מסוימים תלויים תאים דנדריטים סמוכים כמקור ציסטאין 5; ותאים סרטניים יכולים לשתף פעולה עם Assoפיברובלסטים ciated בגידולים 6. כדי להבין את ההתנהגות המטבולית של מערכות כאלה, חשוב להפריד ולמדוד את הפעילות המטבולית של תאים מסוגים שונים בהווה.

ללא ספק השיטה הנפוצה ביותר להפרדת סוגי תאים היא מיון תא מופעל קרינה. שיטה זו היא החלימה רחב, ובלבד סוג התא או המדינה של עניין ניתן "שכותרתו" באמצעות נוגדני ניאון, ביטוי של חלבוני ניאון מהונדסים, או צבעים אחרים. אפשרות אחת היא סוגי תאים נפרדים בתחילה באמצעות סדרן תא, מחדש תרבות סוגי התאים הבודדים מתקבלים, ולאחר מכן לבצע מחקרים מטבוליזם של תרבויות אלה 7. עם זאת, זה אינו ריאלי רק אם הסוג או פנוטיפ התא יציב בתנאי תרבות, ולא יכול ללכוד התנהגות חולפת כמו מצבי מחזור התא, ולא את שיתוף הפעולה המטבולית שיתוף תרבויות. במקרים כאלה, מטבוליזם חייב להימדד ישירות על כךתאי rted. זה מאתגר מאז מיון תא הליך נושאים לתאים מדגיש כי עלול לעוות את חילוף החומרים שלהם 8, ואנו מודעים רק מעט מחקרי נקיטת גישה זו 9, 10. בפרט, מצאנו כי מטבוליטים גדולים כמו חומצות אמינו עלולים לדלוף מתאים שמרה במאגר מיון תא, כך שמדידות של שפע המטבוליט מוחלט הם כבר לא אמינות 11 (אם כי השוואה יחסית בין שברי מיון עדיין עשויה להיות בעלי ערך).

כדי לעקוף בעיות אלה, אנו תווית תאים עם איזוטופים יציבים לפני מיון, ולהתמקד MIDs מטבוליטים הסלולר, ולא שכיחותם המטבוליט. מאז MIDs נוצרות על סולמות זמן רב יותר, הם צריכים להיות מושפעים פחות על ידי חשיפה קצרת טווח לתנאים מיון. אנחנו לכמת MIDs באמצעות ספקטרומטריית מסה מלאה ברזולוציה גבוהה סריקה, שהוא רגיש מספיק כדי לספק data על מאה מטבוליטים החלו מתאי סביב 500,000 מסודרים, המחייב כ 30-60 דקות של זמן על מיון תא. השוואה בין "מדומה מסודרת" שליטה (תאים עברו מכשיר סדרן תא ללא gating כל אוכלוסייה ספציפית) והפקת המטבוליט ישירות מצלחת התרבות הוא עשתה כדי להבטיח כי MIDs הנצפה הם שמייצגים את התרבות המקורית. בהתאם הבחירה של קליעים נותבים איזוטופ יציב, מסלולים מטבוליים שונים ניתן ללמוד עם שיטה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הפקת המטבוליט

  1. הפקת מצלחת
    1. התרבות תאים בצלחת 6-היטב triplicates בתקשורת תרבות יציבה שכותרתו איזוטופ + תוספי dialyzed (סרום או תוספי גדילה אחרים) עד התאים להיות ומחוברות 75%.
      הערה: כאן תאי הלה תרבות עבור 48 שעות RPMI המכילות 40% U- 13 C-גלוקוז ו -70% U- 13 C, 15 N2-גלוטמין ו -5% FBS dialyzed (בסרום שור עוברי). Dialyzed FBS משמש להיפטר מטבוליטים משקל מולקולרי קטן אשר עשוי לזהם את התקשורת שכותרתו. Culturing תאים במוסף dialyzed לפני הניסוי האמיתי מומלץ להבטיח התאים גדלים בדרך כלל בטווח הבינוני. תוספים הם dialyzed ב 0.15 פתרון M NaCl לילה באמצעות צינורות עור דיאליזת נחש.
    2. באותו יום של התקשורת בתרבות החילוץ שנזרקו, ולשטוף בארות פעמיים עם 500 μL HBSS קר ולאחר מכן למחוק אותו.
      הערה: כאן להשתמש HBSS המכיל 40% U-C-גלוקוז 13 שכן הוא גם בתקשורת ובתרבות.
    3. להוסיף 600 μL 100% מתנול מראש מקורר על קרח יבש.
    4. מעבירים את צלחת לייבוש קרח ולהסיר את החומרים בתא עם מגרד תא.
    5. בזהירות פיפטה תמציות לתא צינור ולאחסן microcentrifuge ב -80 ° C עד לניתוח ספקטרומטריית מסה.
  2. הפקת תאים ממוינים מדומים
    1. התרבות תאים בצלחת 100 מ"מ triplicates ב + התקשורת והתרבות יציב שכותרתו איזוטופ תוספי dialyzed.
      הערה: כאן תאים הלה תרבות במשך 48 שעות בצלחת 100 מ"מ כי מספר גבוה של תאים (~ 4 x 10 6) נדרשים כדי להשיג 500,000 תאים ממוינים. מספר זה של תמצית תאים הלה נדרש להשיג מדידה של מטבוליטים טוב. תקשורת התרבות המשמשת הייתה RPMI המכיל 40% U- 13 C-גלוקוז ו -70% U- 13 C, 15 N2-גלוטמין ו -5% dialyzed FBS.
    2. באותו היום של מיצוי, תקשורת ותרבות שנזרקה, ולשטוף בארות wה- i 1.5 מ"ל חם HBSS ולאחר מכן למחוק אותו.
    3. ניתוק התאים על ידי הוספת 1.5 טריפסין מ"ל / EDTA במשך 4 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בצע את השלבים הבאים ב 4 ° C או בקרח.
    4. Deactivate טריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל קרח קר HBSS (תמיסת מלח מאוזן של האנק) + תוספת dialyzed.
    5. איסוף תאים בתוך שפופרת צנטריפוגות 15 מ"ל ב 750 XG במשך 3 דקות.
    6. Resuspend גלולה ב HBSS + dialyzed תוספת + 1 mM EDTA בריכוז 1-2 x 10 6 תאים / מ"ל, לעבור דרך 40 מיקרומטר מסננות תא להשיג תאים בודדים, ולהעביר צינור 5 מ"ל.
    7. מיין תאים באמצעות gating סדרן התא רק singlets, ו תאים ממוינים צנטריפוגות ב 750 XG 3 דקות ב 4 ° C..
      הערה: כאן מעין תאים הלה בשיעור 1,000 אירועים / s, עם psi 27 בלחץ המכשיר, ושימוש זרבובית 100 מיקרומטר. תאי הלה הם גדולים ולכן הם צריכים להיות מסודרים בקצב אירוע איטי זרבובית גדולה כדי לקבל גלולה ללא פגע ככל האפשר. שמור את התאים בבלוקים קרים throughout מיון כדי להקטין את חילוף החומרים. תיאור מפורט של הליך מיון מתואר בעבר 12.
    8. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 50 μL קרח קר DH 2 O להשיג גלולה הומוגנית לפני הוספת מתנול. תוספת של מתנול קר ישירות גלול יוצרת גלולה מוצקה שקשה resuspend.
    9. חלץ מטבוליטים על ידי הוספת 540 μL מתנול שמרו על קרח יבש ולשמור תמציות ב -80 ° C עד כרומטוגרפיה נוזלית - ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה ניתוח (LC-HRMS).
  3. הפקת מחזור התא מסודרת תאים
    1. התרבות תאים בצלחת 100 מ"מ triplicates בתקשורת תרבות + תוספי dialyzed.
      הערה: כאן התרבות תאים הלה המכיל Geminin Fucci גרין (mAG1-hGem) בדיקה 13 המאפשר למיון של G1 (שלילי) ו SG2M (חיובי) תאים. תאים יכולים להיות מתורבתים במדיה התחקות איזוטופ יציבים עבורזה עוד נדרש. כאן יש לנו את התרבית אותם במשך 46 שעות ב מדיה ללא תווית, אז אנחנו עברנו RPMI המכיל 40% U- 13 C-גלוקוז ו -70% U- 13 C, 15 N2-גלוטמין 2 שעות לפני תחילת המיון. הדבר נעשה על מנת להיות מסוגל ללמוד את שלבי מחזור התא מחייב תיוג דופק קצר.
    2. באותו יום של מיצוי, התקשורת והתרבות שנזרקו, ולשטוף בארות עם 1.5 מ"ל חם HBSS ולאחר מכן למחוק אותו.
    3. ניתוק התאים על ידי הוספת 1.5 טריפסין מ"ל / EDTA במשך 4 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בצע את השלבים הבאים ב 4 ° C או בקרח.
    4. Deactivate טריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל קרח קר HBSS + תוספת dialyzed.
    5. איסוף תאים בתוך שפופרת צנטריפוגות 15 מ"ל ב 750 XG במשך 3 דקות.
    6. Resuspend גלולה ב HBSS + dialyzed תוספת + 1 mM EDTA בריכוז 1-2 x 10 6 תאים / מ"ל, לעבור דרך 40 מיקרומטר מסננות תא להשיג תאים בודדים, ולהעביר צינור 5 מ"ל.
    7. תאי מיין הדרך גרם סדרן התאating החוצה פסולת כפילויות, אז gating עבור סמן תא של עניין, תאים ממוינים צנטריפוגות ב 750 XG 3 דקות ב 4 ° C..
      הערה: כאן מעין תאים הלה בשיעור 1,000 אירועים / s, עם psi 27 בלחץ המכשיר, ושימוש זרבובית 100 מיקרומטר. שמור את התאים בבלוקים קרים לאורך מיון כדי להקטין את קצב חילוף חומרים.
    8. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 50 μL קרח קר DH 2 O להשיג גלולה הומוגנית לפני הוספת מתנול. תוספת של מתנול קר ישירות גלול יוצרת גלולה מוצקה שקשה resuspend.
    9. חלץ את מטבוליטים על ידי הוספת 540 μL מתנול שמרו על קרח יבש ולשמור תמציות ב -80 ° C עד לניתוח LC-HRMS.

2. ניתוח ספקטרומטריית מסה

הערה: כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לניתוח תמציות תא על מערכת LC-HRMS. כל שיטות metabolomics לניתוח של תמציות התא יכול לשמש. סריקה מלאהניתוח יכול להיות שימושי לצורך גילוי מגוון רחב של מטבוליטים.

  1. כייל את המכשיר באמצעות שילוב כיול התייחסות ספקטרומטריית מסה.
  2. תמציות תאי הפשרה על קרח למשך 30 דקות ו מערבולת למשך 15 שניות.
  3. העברת 100 μL של תמצית התא מסנן ספין צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 13,000 XG ב 4 ° C..
  4. להזריק 12.5 μL של תסנין על מערכת LC-HRMS.
  5. מטבוליטים נפרדים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית אינטראקציה zwitterionic הידרופיליות (ZIC-HILIC) טור (150 מ"מ x 4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר גודל החלקיקים) המצויידים טור השומר ZIC-HILIC (20 מ"מ × 2.1 מ"מ) באמצעות elution שיפוע של פורמית 0.1% חומצה במים (ממס) ו אצטוניטריל (B ממס). הפעל את elution שיפוע של 20% ממס A ו- להגדיל עד 80% ב -17 דקות. לשמור על אחוז זה במהלך 4 דקות עם זרימה של 400 μL דקות -1 וטמפרטורת טור ומגש מדגם ב 23 מעלות צלזיוס ו 4 ° C, בהתאמה.
  6. השתמש instrument מצמידים את ההפרדה chromatographic לגילוי מטבוליטים, electrospray מחוממת (H-ESI II) בשני מצבים חיוביים ושליליים כמקור יינון, לבין מצב הרכישה סריקה מלאה בכל הכוח בפתרון המוני של 70,000 מלא רוחב חצי מקסימום (FWHM) ( מ '/ z 200).
  7. השתמש חנקן (טוהר> 99.995%) עבור גז נדן וגז עזר בקצב זרימה של 45 ו -10 au (יחידות שרירותיות) וטמפרטורה מאדה להגדיר ב 350 ° C ואת מתח electrospray ב 4 ק במצב חיובי -3.5 kV במצב שלילי.

.3 ניתוח נתונים

  1. בחר מספר מטבוליטים עבורו סטנדרטים זמינים אשר מראים פסגות באיכות טובה בדגימות. יש פסגות באיכות טובות אות גבוהה יחס רעש. חשוב לוודא איכות שיא ולוודא שלא לכלול איזוטופים שווא. פסגות איזוטופים אשר נבדלות צורה ו / או זמן שמירה הן שקריות סבירות.
  2. לקבלת דוגמיות שכותרתו איזוטופ לחשב isotopomer מסה (MI) שברים על ידי חלוקת אזור השיא של כל MI עם אזורי שיא כוללים של כל MIS.
  3. חישוב שברי פחמן / חנקן שכותרתו, העשרה של 13 C ו -15 N, בהתאמה, כפי
    figure-protocol-1
    כאשר n הוא המספר הכולל של פחמנים (או חנקנים, בהתאמה) המטבוליט, ומערבבים הוא שבריר MI של x.
    הערה: כל החישובים יכולים להתבצע באמצעות שפות תכנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדוגמא, כאן אנו מתארים ניסוי חוקר את חילוף החומרים של תאים הלה ממוין לפי שלב מחזור התא. כדי לתייג מגוון רחב של מטבוליטים מרכזיים משני פחמנים חנקנים, אנו בתרבית תאים עבור 48 שעות באמצעות U- 13 C-גלוקוז U- 13 C, 15 N-גלוטמין קליעים נותבים. כדי להשיג MIDs העשיר לניסוי האימות, אנחנו כאן בוחרים תערובת של 40% U- 13 C-גלוקוז ו -70% U- 13 C, 15 N2-גלוטמין, כמו רמות ביניים של איזוטופים נוטות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה שלנו מבוססת על העיקרון כי MIDs מטבוליטים הסלולר לשקף את "ההיסטוריה" של פעילות מטבולית של התא. זה מאפשר לחקור פעילויות מטבוליים תת-אוכלוסייה של תאים, בעת התרחשותם בקהילה הסבוכה של תאים, לפני הליך מיון התא. לעומת זאת, באזורי שיא של מטבוליטים שונים באופן ניכר בין התמציות של תאים ממוינים והפקה ישירה מצלחת התרבות 11. בחלק זה הוא כי ההרכב הכימי השונה משנה את תגובת האות ספקטרומטריית מסה, "אפקט מטריקס" כביכול, אבל אנחנו גם הראינו כי חומצות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לד"ר אנס קמלה על עזרתו רבת הערך באופטימיזציה של שיטות ספקטרומטריית מסה, ולאניקה פון וולנהובן על הסיוע במיון התאים. מחקר זה נתמך על ידי הקרן השוודית למחקר אסטרטגי (מענק מס. FFL12-0220) והתוכנית האסטרטגית לחקר הסרטן (IR, RN); קרן הלב-ריאה השוודית (CEW, HG); וקרן מרי קיי (JW, MJ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
HBSSSigmaH6648
INFLUX (inFlux v7 Sorter)BD Biosciences
U-13C-GlucoseCambridge איזוטופים40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-GlutamineCambridge איזוטופיםCNLM-1275-H-0.1
מתנול (JT Baker), כיתה HPLCVWRBAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV. Durapore PVDF 0.1 ומיקרו; mMilliporeUFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLCThermo Fisher מדעי
Q-Exactive Orbitrap ספקטרומטר מסהThermo Fisher מדעי
Merk-Sequant ZIC HILIC עמודה (150 מ"מ x 4.6  מ"מ, 5 ומיקרו; m)Merck KGaA1.50444.0001
עמוד הגנה Merk-Sequant ZIC HILIC (20 מ"מ x 2.1 מ"מ)Merck KGaA
Acetonitrile Optima LC-MS, זכוכית ענברFisherScientific A955-212
Milli-Q מיםMilliporeמיוצר עם מערכת שיפוע Milli-Q
Myrsyra 99.5% Optima (חומצה פורמית)Fisher Scientific11423423
בקבוקון בורג X100 1.5 מ"ל, 8-425 32x11.6 מ"מ, ענבר, 100 יחידותתרמו פישר מדעי10560053
X100 מנעול Skruv Vitt PTFE אריזה 8-425 (מכסי בורג)Thermo Fisher מדעי12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal MixSigma-AldrichMSCAL5ערכת כיול
SNAKESKIN 10K MWCO תרמו פישר מדעי88245
Mathematica v.10 מחקר
מסננים צנטריפוגליים וולפרם

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
  2. Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
  3. Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
  4. Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
  5. Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
  6. Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
  7. Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
  8. Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
  9. Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
  10. Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32(2014).
  11. Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
  12. Shapiro, H. Practical flow cytometry. , Wiley-Liss. New York. (2003).
  13. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  14. Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cell SortingMetabolite ExtractionLC HRMS AnalysisMass Isotopomer DistributionsCell Cycle SortingMock Sorted CellsMetabolic CollaborationNucleotide MetabolismFlow Cytometry

מאמרים קשורים