מאמר שיטה

שיטה למדידת מטבוליזם ב ממוינות תת-אוכלוסיות של קהילות Cell מורכבות באמצעות איתור איזוטופ יציב

DOI:

10.3791/55011

⸱

4 בפברואר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Unit of Computational Medicine, Karolinska Institutet, 2Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Division of Physiological Chemistry 2, Karolinska Institutet, 4Department of Medicine, University of California San Diego

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר שיטה לחקר חילוף חומרים תאי בקהילות מורכבות של סוגי תאים מרובים, תוך שימוש בשילוב של מעקב איזוטופים יציב, מיון תאים לבידוד סוגי תאים ספציפיים וספקטרומטריית מסה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סוגי תאי יונקים מציגים חילוף חומרים מיוחד, וישנן עדויות רבות לכך שסוגי תאים שונים הקיימים במקביל עוסקים בשיתוף פעולה מטבולי. יתר על כן, אפילו תרביות מסוג תא בודד עשויות להכיל תאים במצבים מטבוליים מובחנים, כגון תאים במנוחה או במחזור. שיטות למדידת פעילויות מטבוליות של תת-אוכלוסיות כאלה הן כלים רבי ערך להבנת חילוף החומרים התאי. אוכלוסיות תאים מורכבות מופרדות לרוב באמצעות סדרן תאים, ותת-אוכלוסיות מבודדות בשיטה זו ניתנות לניתוח בשיטות מטבולומיות. עם זאת, בעיה בגישה זו היא שהליך מיון התאים חושף את התאים ללחצים שעלולים לעוות את חילוף החומרים שלהם.

כדי להתגבר על בעיות אלה, הגענו למסקנה שהתפלגות איזוטופומרים המוניים (MIDs) של מטבוליטים מתאים שגודלו עם חומרים מזינים יציבים מסומנים באיזוטופים עשויה להיות יציבה יותר מריכוזי מטבוליטים מוחלטים, מכיוון ש-MIDs נוצרים בטווחי זמן ארוכים יותר וצריכים להיות מושפעים פחות מחשיפה לטווח קצר לתנאי מיון תאים. כאן, אנו מתארים שיטה המבוססת על עיקרון זה, המשלבת מיון תאים עם כרומטוגרפיה נוזלית - ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (LC-HRMS). ההליך כולל ניתוח שלושה סוגים של דגימות: (1) תמציות מטבוליט המתקבלות ישירות מהאוכלוסייה המורכבת; (2) תמציות של תאים "ממוינים מדומים" שהועברו דרך מכשיר מיון התאים מבלי לשער אוכלוסייה ספציפית כלשהי; ו-(3) תמציות של האוכלוסיות הממוינות בפועל. התאים הממוינים המדומה מושווים מול מיצוי ישיר כדי לוודא ש-MIDs אכן אינם משתנים על ידי הליך מיון התאים עצמו, לפני ניתוח האוכלוסיות הממוינות בפועל. אנו מראים תוצאות לדוגמה מתאי HeLa ממוינים לפי שלב מחזור התא, וחושפים שינויים במטבוליזם של נוקלאוטידים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצורים עילאיים להכיל קהילות שלמות מורכבות של סוגי תא ברורים כי לשתף פעולה כדי להביא פונקציות מורכבות יותר. לדוגמא, גידולים לכלול לא רק תאים סרטניים, אלא גם פיברובלסטים, תאים המהווים כלי דם, ולעתים קרובות תא חיסון מחלחל 1; דם מכיל תערובת מורכבת של עשרות תת תא חיסון 2; ואפילו שורות תאים בתרבית עשויות להיות מורכבות תת-אוכלוסיות מרובות, כגון לומינל, תת בסיס של תאי סרטן השד 3. יתר על כן, סוגי תא ברורים כי לדור בכפיפה אחת יכול להפגין מטבולית "שיתוף פעולה". לדוגמה, במוח, האסטרוציטים הם חשבו להמיר גלוקוז לקטט, אשר אז "הפד" לנוירונים כי לחמצן מצע זה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הפקת המטבוליט

  1. הפקת מצלחת
    1. התרבות תאים בצלחת 6-היטב triplicates בתקשורת תרבות יציבה שכותרתו איזוטופ + תוספי dialyzed (סרום או תוספי גדילה אחרים) עד התאים להיות ומחוברות 75%.
      הערה: כאן תאי הלה תרבות עבור 48 שעות RPMI המכילות 40% U- 13 C-גלוקוז ו -70% U- 13 C, 15 N2-גלוטמין ו -5% FBS dialyzed (בסרום שור עוברי). Dialyzed FBS משמש להיפטר מטבוליטים משקל מולקולרי קטן אשר עשוי לזהם את התקשורת שכותרתו. C....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדוגמא, כאן אנו מתארים ניסוי חוקר את חילוף החומרים של תאים הלה ממוין לפי שלב מחזור התא. כדי לתייג מגוון רחב של מטבוליטים מרכזיים משני פחמנים חנקנים, אנו בתרבית תאים עבור 48 שעות באמצעות U- 13 C-גלוקוז U- 13 C, 15 N-גלוטמין קליעים נותבים. כדי להשיג MIDs העשיר לניסוי האימות, אנחנו כאן בוחרים תערובת של 40% U- 13 C-גלוקוז ו -70% U- 13 C, 15 N2-גלוטמין, כמו רמות ביניים של איזוטופים נוטות .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה שלנו מבוססת על העיקרון כי MIDs מטבוליטים הסלולר לשקף את "ההיסטוריה" של פעילות מטבולית של התא. זה מאפשר לחקור פעילויות מטבוליים תת-אוכלוסייה של תאים, בעת התרחשותם בקהילה הסבוכה של תאים, לפני הליך מיון התא. לעומת זאת, באזורי שיא של מטבוליטים שונים באופן ניכר בין התמציות של תאים ממוינים והפקה ישירה מצלחת התרבות 11. בחלק זה הוא כי ההרכב הכימי השונה משנה את תגובת האות ספקטרומטריית מסה, "אפקט מטריקס" כביכול, אבל אנחנו גם הראינו כי חומצות.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לד"ר אנס קמלה על עזרתו רבת הערך באופטימיזציה של שיטות ספקטרומטריית מסה, ולאניקה פון וולנהובן על הסיוע במיון התאים. מחקר זה נתמך על ידי הקרן השוודית למחקר אסטרטגי (מענק מס. FFL12-0220) והתוכנית האסטרטגית לחקר הסרטן (IR, RN); קרן הלב-ריאה השוודית (CEW, HG); וקרן מרי קיי (JW, MJ).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
HBSSSigmaH6648
INFLUX (inFlux v7 Sorter)BD Biosciences
U-13C-GlucoseCambridge איזוטופים40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-GlutamineCambridge איזוטופיםCNLM-1275-H-0.1
מתנול (JT Baker), כיתה HPLCVWRBAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV. Durapore PVDF 0.1 ומיקרו; mMilliporeUFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLCThermo Fisher מדעי
Q-Exactive Orbitrap ספקטרומטר מסהThermo Fisher מדעי
Merk-Sequant ZIC HILIC עמודה (150 מ"מ x 4.6  מ"מ, 5 ומיקרו; m)Merck KGaA1.50444.0001
עמוד הגנה Merk-Sequant ZIC HILIC (20 מ"מ x 2.1 מ"מ)Merck KGaA
Acetonitrile Optima LC-MS, זכוכית ענברFisherScientific A955-212
Milli-Q מיםMilliporeמיוצר עם מערכת שיפוע Milli-Q
Myrsyra 99.5% Optima (חומצה פורמית)Fisher Scientific11423423
בקבוקון בורג X100 1.5 מ"ל, 8-425 32x11.6 מ"מ, ענבר, 100 יחידותתרמו פישר מדעי10560053
X100 מנעול Skruv Vitt PTFE אריזה 8-425 (מכסי בורג)Thermo Fisher מדעי12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal MixSigma-AldrichMSCAL5ערכת כיול
SNAKESKIN 10K MWCO תרמו פישר מדעי88245
Mathematica v.10 מחקר
מסננים צנטריפוגליים וולפרם

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
  2. Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
  3. Prat, A., et al.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Stable Isotope TracingCell SortingMetabolite ExtractionLC HRMS AnalysisMass Isotopomer DistributionsCell Cycle SortingMock Sorted CellsMetabolic CollaborationNucleotide MetabolismFlow Cytometry

מאמרים קשורים