מאמר שיטה

שיטת שבב exo: זיהוי אינטראקציות חלבון-דנ"א עם Precision סמוך לבסיס זוג

16.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55016

⸱

23 בדצמבר 2016

 , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשגת רזולוציה קרובה לזוג הבסיס של אינטראקציות חלבון-DNA. זה מתקבל על ידי טיפול אקסונוקלאז בשברי DNA המועשרים באופן סלקטיבי על ידי משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP-exo) ואחריו ריצוף תפוקה גבוה.

תקציר

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי הכרחי בתחומי אפיגנטיקה ויסות הגנים המבודדת אינטראקציות חלבון-דנ"א ספציפי. שבב מצמידים את רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך) משמש בדרך כלל כדי לקבוע את המיקום הגנומי של חלבונים אינטראקציה עם הכרומטין. עם זאת, שבב seq הקשה על ידי ברזולוצית מיפוי נמוכה היחסי של כמה מאה זוגות בסיסים ו אות רקע גבוהה. שיטת השבב exo היא גרסה מעודנת של שבב seq המשפר באופן משמעותי את שני ברזולוציה ורעש. ההבחנה המפתח של המתודולוגיה שבב exo הוא שילוב של עיכול exonuclease למבדה בתהליך העבודה הכנת הספרייה כדי טביעת רגל שמאל ביעילות וימין 5 גבולות DNA של האתר crosslink חלבון-דנ"א. הספריות-exo שבב חשופים מכן רצף קצב העברת נתונים גבוה. כתוצאת הנתונים ניתן למנף לספק תובנה ברזולוציה ייחודיות ועל עליון לתוך o הארגון הפונקציונליf הגנום. כאן אנו מתארים את שיטת השבב exo כי לנו אופטימיזציה וייעלו למערכות יונקות הדור הבא רצף-ידי-סינתזת פלטפורמה.

מבוא

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) היא שיטה רבת עוצמה כדי לחקור מנגנונים של ויסות הגנים על ידי העשרת סלקטיבי עבור שברי דנ"א אינטראקציה עם חלבון נתון בתאים חיים. שיטות איתור של קטעי DNA מועשר שבב התפתחו ככל שהטכנולוגיה משתפרת, מן הגילוי של מוקד יחיד (תקן שבב qPCR) הכלאה על microarrays oligonucleotide (שבב שבב) כדי רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך) 1. למרות-seq השבב רואה יישום נרחב, ההטרוגניות הכרומטין אינטראקציות DNA ספציפיות יש הכבד איכות נתונים המוביל תוצאות חיוביות שגויות ומיפוי מדויק. כדי לעקוף מגבלות אלו, ד"ר פרנק Pugh פיתח את שיטת שבב exo 2. התכונה הבולטת של-exo השבב היא שזה משלב 5 'ל 3' exonuclease, footprinting ביעילות גורם שעתוק מחייבים מקומות. כתוצאה מכך, המתודולוגיה השבב exo משיגה רזולוציה גבוהה יותר, טווח דינמי גדול יותר של detection, ורעש רקע תחתון.

למרות שבב exo הוא יותר מאתגר מבחינה טכנית כדי להתמחות מ שבב seq, בחודשים האחרונים הוא לאימוץ נרחב כמו מחקרים שואפים לקבל תובנה ברזולוציה גבוהה אולטרה ייחודיות באמצעות מערכות ביולוגיות מגוונות 3-8. ואכן,-exo השבב יושם בהצלחה חיידקים, שמרים, עכבר, חולדה, ומערכות תאים אנושיות. כהוכחה עקרונית,-exo השבב שמש במקור כדי לזהות את מוטיב המחייב המדויק בעבור חופן שעתוק שמרים גורם 2. הטכניקה שימש גם בשמרים ללמוד את הארגון של המתחם מראש ייזום שעתוק, וכדי לפענח מבנה subnucleosomal של היסטונים שונים 9,10. לאחרונה, אנו ממונפים-exo השבב לפתור TFIIB הסמוך Pol II מחייב אירועי יזמים אנושיים, והראינו כי שעתוק מסתעף נרחב נובע ייזום ברור קומפלקסי 11.

זרימת העבודה המוצגת כאן היא מותאמת ו- streamlined עבור שבב exo היונק (איור 1). ראשית, התרבות תאים ראשוניים או רקמות חיות מטופלות עם פורמלדהיד לשמר באינטראקציות חלבון-דנ"א vivo באמצעות crosslink קוולנטיים. התאים lysed ו הכרומטין טעון ~ 100 - 500 שברי גודל בסיס זוג. שבב אז מעשיר באופן סלקטיבי עבור קטעי DNA crosslinked לחלבון של עניין. בשלב זה, ספריות-seq שבב ערוכים בדרך כלל, אשר מטבעו מגביל את הרזולוציה זיהוי לגודל שבר הממוצע של כמה מאות זוגות בסיסים. עם זאת, שבב exo מתגבר על מגבלה זו על ידי זמירה משמאל ומימין 5 גבולות DNA של האתר crosslink חלבון-דנ"א עם exonuclease למבדה. ספריות רצף בנויות אז מ- DNA מתעכל exonuclease כמפורט להלן. הגבולות המקוננים 5 'וכתוצאה מכך מייצגים טביעת in vivo של אינטראקצית החלבון-דנ"א (איור 1, שלב 14), והם מזוהים על ידי רצף קצב העברת נתונים גבוה. Altיו המתודולוגיה שבב exo הוא מעורב יותר מאשר שבב seq, מעברים בין רוב השלבים דורש כביסה חרוז פשוט, אשר ממזערת אובדן מדגם ולהבדלים ניסיוני. יודגש, כי בגלל-exo השבב היא גרסה מעודנת של-seq שבב, כל מדגם כי הוא מוצלח עם-seq שבב צריכה גם להצליח עם-exo שבב.

תפקידו של המוסד vivo footprinting של אינטראקציות חלבון-דנ"א עם תוצאות שבב exo במבנה נתונים ברורים במהותו מן-seq שבב. למרות המתקשר שבב seq משותף ניתן להחיל נתוני שבב exo, כדי לקבל את שיחות שיא המדויקות ביותר אנו ממליצים כלי ביואינפורמטיקה שתוכננו במיוחד עם המבנה הייחודי של נתוני שבב exo בראש. אלה כוללים Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla, ו ExoProfiler 12-15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: H הזוגי המזוקק 2 O או שוות ערך כיתה מולקולרי מומלצת לכל המאגרים ותערובות תגובות.

יום 0: הכנת חומר קציר נייד

1. הצפת הכנה

  1. כן תמוגה חוצצי 1 - 3 (לוחות 1 - 3) ולהוסיף 100 μl מניות מעכבים פרוטאז שלמים (CPI) 50 מיליליטר של כל חיץ רק לפני השימוש. הכן המניה למדד ידי המסת טבליה אחת ב 1 מ"ל כיתה מולקולרית H 2 O.
  2. כן חוצץ שבב (לוחות 4 - 7). הוספת 100 μl המניה למדד ל -50 מ"ל של חסימה מאגרים Ripa. אל תוסיף למדד מאגרי טריס וצ'יפ Elution.

חישול 2. Oligonucleotides מתאם

הערה: רצפי oligonucleotide ספציפיים ניתן למצוא את הפרטים הנוספים.

  1. הכן תערובות חישול מתאם (לוחות 8 - 9). וורטקס לערבב בקצרהספין צינורות לאסוף תוכן. Aliquot 100 μl של כל ערבוב לתוך צינורות 0.5 מ"ל.
  2. להכליא oligonucleotides ידי הפעלת התכנית (לוח 10) ב thermocycler.
    חנות annealed oligonucleotides ב -80 מעלות צלזיוס.

3. Vivo הכרומטין Crosslinking עם פורמלדהיד

הערה: לצורך ניסוי שבב טיפוסי, חומר המוצא אמור להכיל כ -50 מיליון תאים.

  1. הוסף פתרון המניות פורמלדהיד 37% ללא מתנול טרי פוספט בופר (PBS) שטף תרבית תאים לריכוז סופי של 1% (v / v), ומערבבים היטב, ולתת לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    הערה: לדוגמה, אנו נוהגים להוסיף 1.4 מ"ל של 37% ללא מתנול פורמלדהיד לתאים 50 מ"ל של בטמפרטורת החדר PBS. כמו כן, להימנע פורמלדהיד crosslinking בתקשורת מאז חלבונים בתקשורת יהיה להרוות חלק פורמלדהיד.
  2. להרוות crosslinking תגובה על ידי הוספת 2.5 M glycinדואר ריכוז סופי של 125 מ"מ. מערבבים היטב.
  3. עבר תאים 50 מ"ל צינור על קרח. ספין התאים למשך 5 דקות XG ב 1000 ב 4 מעלות צלזיוס. supernatant למזוג.
  4. הוסף 1 מ"ל קר כקרח 1x PBS לתא גלולה ו resuspend ידי pipetting. מעבירים צינור 1.5 מ"ל.
  5. ספין תאים במשך 3 דקות XG ב 2000 ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant.
  6. מיד פלאש להקפיא כדורי תא צינורות 1.5 מ"ל עם חנקן נוזלי. חנות ב -80 מעלות צלזיוס. תאים Crosslinked יציבים ללא הגבלת זמן ב -80 מעלות צלזיוס.

יום 1: תא תמוגה, Sonication, וצ'יפ

4. תא תמוגה

הערה: במהלך כל חלקי תמוגה התא, הדגימות חייבות להישמר על קרח או על 4 מעלות צלזיוס כדי למזער היפוך crosslink.

  1. בקצרה להפשיר תא גלול crosslinked. ביסודיות resuspend כל גלולה ב 0.5 מ"ל תמוגה הצפת 1 ולשלב עם 4.5 מ"ל תמוגה הצפת 1 בתוך שפופרת פוליסטירן 15 מ"ל.
  2. צינורות רוק עבור 10 דקות ב 4 ° Cעבור על פלטפורמת נדנדה. ספין למשך 4 דקות XG ב 2000 ב 4 מעלות צלזיוס. supernatant למזוג.
  3. ביסודיות resuspend כל גלולה ב 0.5 מ"ל הצפת תמוגה 2 ולהוסיף 4.5 מ"ל הצפת תמוגה 2 פעם resuspended.
  4. רוק במשך 5 דקות ב 4 ° C על פלטפורמת נדנדה. ספין במשך 5 דקות XG ב 2000 ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant והקש עודף בעדינות על מגבת נייר.
  5. ביסודיות resuspend כל גלולה ב 0.5 מ"ל הצפת תמוגה 3 ולהוסיף 1 מ"ל הצפת תמוגה 3 פעם resuspended. שמור lysates גרעיני על קרח מיד להמשיך sonication.

5. Sonication של גרעיני Lysates

הערה: במהלך כל חלקי sonication, הדגימות חייבות להישמר על קרח כדי למזער היפוך crosslink. הדגם הספציפי של sonicator משמש בשיתוף עם פרוטוקול להלן ניתן למצוא טבלה של חומרים. פרטים על שימוש sonicator ספציפי והנחיות עבור מכשירים אחרים ניתן למצוא את הפרטים הנוספים.

  1. Plמתאמי תהודת אס 15 מיליליטר צינורות קלקר המכילים תמציות גרעיניות (הבר המתכתי לא צריך לגעת הקיר של הצינור).
  2. lysates גרעיני Sonicate באמבט מים קרים קרח במשך 2 x 15 מפגשים דקות עם 30 שניות ON / OFF 30 שניות בהספק בינוני. רק sonicate שני 15 מ"ל צינורות בכל פעם. הגדרות אלה לעבוד על מגוון רחב של שורות תאים סוגי תאים ראשוניים, אבל ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה נוספת אם הגז הכרומטין אינו שלם.
  3. כדי לבדוק תוצאות sonication, העברת 2 x 10 דגימות μl מן lysate לתוך צינורות 1.5 מ"ל.
    1. להיפוך crosslinks, לשלב את aliquot הראשונה 10 μl עם 10 μl TE-RNase A ו- 0.2 μl של proteinase ק לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף 4 μl לצבוע DNA קסילן 6x.
    2. כדי לשמר crosslinks, לשלב את aliquot השני 10 μl עם 2 μl לצבוע DNA קסילן 6x.
    3. להפעיל את שתי דוגמאות על ג'ל 1.5% agarose ב 140 V עבור כ 30 - 45 דקות עד לצבוע bromophenol ב הסולם i¾ s של הדרך למטה הג'ל.
  4. אם sonication היה מוצלח (רוב שברי DNA טעון 100 - 500 נ"ב), העברת sonicated lysates 2 מ"ל צינורות המכיל 150 μl של 10% Triton X-100. וורטקס לערבב.
  5. כדי גלולת הכרומטין ופסולת מסיסים, ספין sonicated lysate הגרעיני במשך 10 דקות ב 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
  6. העברת supernatant אל צינור 2 מ"ל חדש. פנה מיד דגימות שבב או בחנות ב -80 ° C ללא הגבלת זמן. תמציות sonicated לא צריך להיות קפוא מופשר יותר מפעם אחת.

6. נוגדן צימוד חרוזים

הערה: לעולם אל מערבולת או להקפיא / להפשיר חרוזים מגנטיים מאז הם ינפצו ולהגדיל אות רקע.

  1. לאחר ערבוב המניות ביסודיות, aliquot Y μl slurry חרוז לתוך 1.5 מ"ל צינור, היכן Y = 1.1 x 2.5 x μl (מספר דגימות שבב). כריכת יכולת slurry חרוז 2.5 μl היא עד 13 מיקרוגרם IgG. לשטוף חרוזים ונקווה 3x עם 1 מ"ל חסימתבַּלָם.
  2. לקבלת aliquotting העקבית יותר של חרוזים לאחר שטיפות, חרוזי resuspend ב 10x נפח slurry מקורי (25 μl / שבב) עם חסימת הצפה. Aliquot 25 μl לדגימה שבב לתוך צינורות 1.5 מ"ל.
  3. להוסיף 5 - 10 מיקרוגרם של נוגדנים מתאימים aliquot חרוזים גלולים. תביא נפח סופי עד 250 μl עם חיץ חסימה. דגירה דגימות במשך 4 שעות (לחילופין, לילה במשך 16 שעות) על במה מסתובבת ב 4 ° C.
  4. לשאוב supernatant. כדי להסיר נוגדן מאוגד או עודף, לשטוף חרוזים פעם עם 1 מ"ל חסימת חיץ.
  5. לאחר aspirating לשטוף האחרון, ומיד להוסיף 50 מיליון ושווי התא של תמציות sonicated (~ 1.6 מ"ל) כדי נוגדן: conjugates חרוז. אם תמציות sonicated אינן מוכנות, חרוזי resuspend ב 100 μl חסימת הצפה עד שהם מוכנים. זה קריטי לא לתת את החרוזים יבשים.

7. הכרומטין immunoprecipitation (שבב)

  1. עבור כל דגימה שבב, לשלב 1.5 מ"ל של sonicateתמציות ד עם נוגדן: conjugates חרוז ב 1.5 מ"ל או 2 צינורות מ"ל.
  2. דגירת צינורות על כתף מיני צינור הלילה (כ 16 שעות) בשעת הגדרת מהירות של 9 ב 4 ג. בדוק אחרי כמה דקות על מנת להבטיח דגימות אינן דולפות והם ערבוב כראוי.

יום 2: השבב רוחץ ו- On-שרף תגובות אנזימטיות

8. רוחצת שבב

הערה: כדי למזער זיהום צולב, ספין צינורות בקצרה בין כל שטיפה. לקבלת השאיפה הראשונה, לשנות טיפים בין כל דגימה. במהלך שוטפים עוקב באותו הקצה יכול לשמש עוד כפי שהוא לא נגע חרוזים. ראה סעיף מידע נוסף עבור כיוונים על כביסת שבב נכונה.

  1. בקצרה מאוד ספין צינורות באמצעות microcentrifuge (~ 3 שניות ב 500 XG) לאסוף נוזלי כמוסות ומניחים על המדף מגנטי 1 דקות. אמנם עדיין על המדף המגנטי, תמצית לשאוב.
  2. להוסיף 0.75 מ"ל Ripa הצפת על צינור אחד. הסר צינורות מ מתלה מגנטיו להפוך מספר פעמים כדי לערבב. חלף צינורות על מתלה מגנטית supernatant לשאוב. חזור 7x.
  3. להוסיף 0.75 מ"ל 10 מ"מ טריס HCl (pH 7.5) על צינור אחד. הסר צינורות מ מתלה מגנטי ו להפוך מספר פעמים כדי לערבב. חלף צינורות על מתלה מגנטית supernatant לשאוב. חזור 2x.
  4. לאחר aspirating לשטוף האחרון, המשך צחצוח.
    הערה: לאחר כל תגובת דגירה בסעיפים 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3, ו -15.3, בקצרה צינורות ספין ומקום נגד מתלת מגנטי 1 דקות ו supernatant לשאוב. 2x לשטוף עם 0.75 מ"ל Ripa הצפת 2x עם 0.75 מ"ל טריס HCl (pH 7.5).

תגובת צחצוח 9.

  1. מלא את פוליש חישובי תערובת אמן (לוח 11). הפוך פוליש תמהיל 1.5 מ"ל צינור על הקרח. Pipet לערבב.
  2. מייד לאחר כביסת השבב האחרונה היא aspirated, להוסיף 50 μl של פוליש תערובת לכל שרף מדגם ועדיין על המדף המגנטי. דגירה דגימות עבור 30 דקות ב 3 XG30 צלזיוס thermomixer.
  3. לאחר aspirating לשטוף האחרון כמתואר בביאור לאחר סעיף 8.4, המשך A-עוקב.

10. A-עוקב תגובה

  1. מלא את חישובי תערובת אמן עוקב-A (לוח 12). הפוך-עוקב לערבב בתוך צינור 1.5 מ"ל על הקרח. Pipet לערבב.
  2. מייד לאחר פוליש סעיף, להוסיף 50 μl של A-עוקב תערובת לכל שרף מדגם ועדיין על המדף המגנטי. דגירה דגימות עבור 30 דקות ב 3 XG ב 37 צלזיוס thermomixer.
  3. לאחר aspirating לשטוף האחרון כמתואר בביאור לאחר סעיף 8.4, המשך קשירת מתאם P7.

11. תגובת קשירת מתאם P7

  1. מלא את חישובי תערובת אמן קשירה (לוח 13). הפוך קשירת לערבב צינור 1.5 מ"ל על הקרח. פיפטה לערבב.
  2. מייד לאחר-עוקבים סעיף, להוסיף 48 μl תערובת אמן P7 קשירה ו -2 μl של t אינדקס מתאם שונהo כל שרף מדגם ועדיין על המדף המגנטי. דגירה דגימות עבור שעה 2 ב 3 XG ב 25 צלזיוס thermomixer.
    הערה: שימוש אינדקסים שונים עבור כל דגימה יאפשר יותר דגימות להיות רצף בתוך תא זרימה חד.
  3. לאחר aspirating לשטוף האחרון כמתואר בביאור לאחר סעיף 8.4, המשך תיקון Φ-29 ניק.

12. Phi-29 תגובת תיקון ניק

  1. מלא את Φ-29 חישובי מיקס מאסטר (לוח 14). צור לקט Φ-29 ב 1.5 מ"ל צינור על הקרח. Pipet לערבב.
  2. מיד לאחר סעיף קשירת P7, להוסיף 50 μl של תמהיל Φ-29 לכל שרף מדגם ועדיין על המדף מגנטי. דגירה דגימות עבור 20 דקות ב 3 XG ב 30 צלזיוס thermomixer.
  3. לאחר aspirating לשטוף האחרון כמתואר בביאור לאחר סעיף 8.4, המשך התגובה קינאז.

תגובה קינאז 13.

  1. מלא את חישובי תערובת אמן קינאז ( לוח 15). הפוך קינאז לערבב ב 1.5 מ"ל צינור על הקרח. Pipet לערבב.
  2. מיד לאחר סעיף Φ-29, להוסיף 50 μl של קינאז לערבב לכל שרף מדגם ועדיין על המדף מגנטי. דגירה דגימות עבור 20 דקות ב 3 XG ב 37 צלזיוס thermomixer.
  3. לאחר aspirating לשטוף האחרון כמתואר בביאור לאחר סעיף 8.4, המשך התגובה exonuclease למבדה.

תגובת 14. למבדה exonuclease

  1. מלאו את חישובי תערובת אמן Lambda exonuclease (לוח 16). הפוך Lambda exonuclease לערבב ב 1.5 מ"ל צינור על הקרח. Pipet לערבב.
  2. מיד לאחר סעיף קינאז, להוסיף 50 μl של למבדה exonuclease לערבב לכל שרף מדגם ועדיין על המדף מגנטי. דגירה דגימות עבור 30 דקות ב 3 XG ב 37 צלזיוס thermomixer.
  3. לאחר aspirating לשטוף האחרון כמתואר בביאור לאחר סעיף 8.4, המשך התגובה f RecJ.

15. RecJ fתגובת nuclease

  1. מלא את חישובי תמהיל RecJ f מאסטר (לוח 17). הפוך f תמהיל RecJ ב 1.5 מ"ל צינור על הקרח. Pipet לערבב.
  2. מיד לאחר סעיף exonuclease למבדה, להוסיף 50 μl של תמהיל RecJ f לכל שרף מדגם ועדיין על המדף מגנטי. דגירה דגימות עבור 30 דקות ב 3 XG ב 37 צלזיוס thermomixer.
  3. לאחר aspirating לשטוף האחרון כמתואר בביאור לאחר סעיף 8.4, המשך שבב Elution.

16. Elution ואת היפוך Crosslink

  1. הכינו תערובת אמן: מספר דגימות x 1.1 x (200 μl שבב הצפת elution + 1 μl 20 מ"ג / מ"ל ​​proteinase K) ב 1.5 מ"ל צינור. הוסף 200 μl שבב הצפת elution + proteinase K מיקס מאסטר לכל שרף המדגם.
  2. דגירה דגימות לילה (כ 16 שעות) בשעה 3 XG ב 65 צלזיוס thermomixer עם מכסה מחומם כדי למנוע התעבות.

יום 3: DNA חלץיון קשירת מתאם

17. Elution ואת היפוך Crosslink (המשך)

  1. לאחר דגירה לילה בשעה 65 C, בקצרה ספין דגימות כדי לאסוף העיבוי. מקום דגימות על מתלה מגנטי 1 דקות.
  2. העברת 200 μl supernatant אל צינור חדש 1.5 מ"ל המכיל 200 μl TE הצפת (pH 7.5).

הפקת 18. אלכוהול Isoamyl כלורופורם פנול (PCIAA)

  1. להוסיף 400 כלורופורם פנול μl isoamyl אלכוהול מדגם זה. וורטקס לערבב במשך 20 שניות.
  2. צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 20,000 XG בטמפרטורת החדר (RT). בזהירות להעביר 325 μl של השכבה המימית העליונה לצינור טרי.
    הערה: יש להיזהר שלא להעביר כל אחד (השכבה התחתונה) האורגנית לתוך הצינור החדש.
  3. להוסיף 1/10 נפח של 3 M NaOAc (pH 5.5) ו 1 μl 20 מ"ג / מ"ל ​​גליקוגן מדגם זה. לקבלת דוגמיות מרובות, להכין תערובת אב.
  4. הוסף 3 כרכים של אתנול 100% קר קרח מדגם זה. מְעַרבּוֹלֶתלערבב. דגירה במשך 15 דקות ב -80 C.
  5. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 20,000 XG ב 4 ג. בזהירות למזוג supernatant, מוודא שלא להפריע את הכדור.
  6. בעדינות להוסיף 500 μl טריים אתנול קר כקרח 70%, מוודא שלא להפריע את הכדור. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 20,000 XG ב 4 ג. בזהירות למזוג supernatant.
  7. גלולה יבשה למשך כ 20 דקות (או עד יבש) בחלל ריק מהירות 45 ג.
    הערה: זוהי נקודת הפסקה בפרוטוקול. ניתן לאחסן כדורי ה- DNA היבשים ב -20 C.
  8. כדורי Resuspend ב 10 μl DDH 2 O. Pipet שוב ושוב מעל האזור שבו pelleted DNA, למרות הגלולה היבשה לא ניתן לראות.
  9. העבר 10 μl של כל דגימה על 0.3 מ"ל PCR צינור או 8-מתלה טריים, תלוי במספר דגימות.

19. תגובת ההארכה תחל P7

  1. מלאו את חישובי תערובת אמן P7 פריימר רחבים (לוח 18). הפוך רחבים לערבב ב 1.5 מיליליטר צינור על קרח. Pipet לערבב.
  2. הוסף 10 μl של תערובת הרחבה (פולימראז Φ-29 מינוס) לדגום כל 10 μl. Pipet לערבב.
  3. דגימות לרוץ thermocycler באמצעות תוכנית (לוח 19) כדי פריימר לחשל את התבנית עד 30 ג "להחזיק" צעד.
  4. הוסף 1 μl Φ-29 פולימראז במהלך 30 C "להחזיק" צעד בתוכנית. Pipet לערבב. קורות חיים עד סוף התוכנית (לוח 19).

20. A-עוקב תגובה

  1. מלא את חישובי תערובת אמן עוקב-A (לוח 20). הפוך-עוקב לערבב בתוך צינור 1.5 מ"ל על הקרח. Pipet לערבב.
  2. הוסף 10 μl של A-עוקב תמהיל מדגם זה. Pipet לערבב.
  3. ב thermocycler, דגירה דגימות עבור 30 דקות ב 37 ג, ולאחר מכן לחמם להשבית למשך 20 דקות ב 75 ג.

21. תגובת קשירת מתאם P5

  1. fill החוצה תמהיל חישובים מאסטר P5 מתאם קשירה (לוח 21). הפוך קשירת לערבב צינור 1.5 מ"ל על הקרח. Pipet לערבב.
  2. הוסף 20 μl של קשירת P5 לערבב מדגם זה. Pipet לערבב.
  3. ב thermocycler, דגירה דגימות עבור שעה 2 ב 25 ג.

22. חרוז נקי-אפ

הערה: אנא ראה סעיף חומרים לפרטי יצרן על חרוז לנקות.

  1. העברת כל מדגם 50 μl כדי צינור 1.5 מ"ל חדש.
  2. Resuspend לנקות חרוזים על כתף מיני-צינור ב הגדרת מהירות של 15 במשך 15 דקות ב RT. אל תתנו החרוזים להתיישב לפני pipetting.
  3. הוסף 60 μl לנקות חרוזים לדגום (1.2: 1 לנקות חרוזים לדגום היחס הוא קריטי כדי להסיר DNA המכיל פחות מ 200 זוגות בסיסים). Pipet לערבב במשך 20 שניות.
  4. Resuspend לנקות חרוזים על כתף מיני-צינור ב הגדרת מהירות של 15 דקות 3 ב RT. בקצרה ספין צינורות.
  5. מניח צינורות על המדף המגנטי 1 דקות.Pipet וישאירו supernatant.
    הערה: אין להשתמש שאיפה ואקום בסעיף זה כי זה יהיה להתחנף החרוזים לנקות.
  6. להוסיף 400 μl של טריות RT 70% אתנול מדגם זה בזמן שהם על מתלה מגנטית. אל תערבב. לשאוב supernatant. חזור 2x.
  7. לייבש את החרוזים לנקות במשך 10 דקות ב RT. הצבע של החרוזים יהפוך כהה הסדקים חומים בהירים מאוד קטנים יהיה גלוי הגלול השרף כאשר חרוזים יבשים.
  8. כדי elute DNA, להוסיף 40 μl 10mm טריס (pH 7.5). ביסודיות pipet לערבב במשך 20 שניות.
  9. מניח את הדגימות על המדף המגנטי 1 דקות. לאט pipet ולהעביר 36 μl eluate ישירות 0.3 מ"ל צינורות PCR.
  10. להמשיך ישירות eluates תגובה או חנות PCR ב -20 C.

יום 4: ניתוח PCR ו ג'ל

23. PCR

  1. מלא את חישובי תערובת אמן PCR (לוח 22). הפוך לערבב PCR. Pipet בעדינות מאוד לערבב כדי למנועבועות.
  2. להוסיף 14 μl של ה- PCR לערבב כל דגימת DNA 36 μl. Pipet לערבב. שמור על דגימות קרח עד מוכן לשים thermocycler.
  3. על בקרת PCR החיובית, כולל ספרייה שהוכנה קודם לכן. על הבקרה PCR שלילי, כולל מים. דגימות לרוץ thermocycler באמצעות תוכנית ה- PCR (לוח 23).

הכנת ג'ל 24., כריתת DNA, ויזואליזציה

  1. לנקות ביסודיות ולשטוף תיבת ג'ל בגודל מתאימה עם מים ללא יונים. הכן ג'ל agarose 1.5% (המכיל 0.5 מ"ג / מ"ל ​​ethidium ברומיד) עם עבה, מסרק רחב היטב שיכול להכיל 60 μl.
    הערה: ברומיד Ethidium (EtBr) הוא קרצינוגן ויש לטפל בו בזהירות.
  2. ספין למטה דוגמיות PCR בקצרה לאסוף עיבוי.
  3. להוסיף 1/5 היקף לצבוע DNA קסילן 6x כדי מדגם משולב. אין להשתמש כחול bromophenol ב לצבוע DNA שכן הוא נודד באותו מקום כמו ה- DNA במדגם.
  4. טען int המדגםo כל טוב, רצוי עם בארות ריקות בין דגימות.
    הערה: ספריות עם אינדקסים אותו ואסור לרוץ באותה ג'ל.
  5. טען 7 μl 100 סולם נ"ב משני צדי דגימות. הפעל ג'ל ב -140 V עבור כ 30-45 דקות עד צבע bromophenol ב הסולם הוא ¾ הדרך למטה הג'ל.
  6. תמונה ולדמיין הג'ל על transilluminator בכל הגדרה UV נמוכה. ובלו קטעי agarose המכיל קטעי דנ"א 200 - 500 נ"ב. להיות מאוד זהיר, כדי למנוע חיתוך להקת דימר המתאם שיוצאת ב -125 נ"ב.
  7. מניחים כל פרוסה ג'ל נכרת לתוך צינור 15 מ"ל. משקל נטו שיא של כל פרוסת ג'ל. כתוב המשקל הזה ישירות על צינור.
  8. תמונה, שמורה, ותסמן ג'ל נכרת לאשר שנבחר טווח גודל נכון.

25. ג'ל טיהור

  1. לטהר DNA מן פרוסת ג'ל נכרתה על פי הוראות היצרן, בשינויים הבאים.
  2. ממיסים את הפרוסה ג'ל ידי נדנדהב RT על נדנדת פלטפורמה. זה ייקח כ 20 דקות כדי לפזר.
  3. כדי להשיג DNA נקי במיוחד, לשטוף עמודות עם 0.5 מיליליטר הצפת QG לאחר מומס ג'ל עבר דרך עמודה.
  4. לאחר לשטוף PE ההצפה, בואו עמודות לשבת ב RT במשך 2 - 5 דקות. ספין דקות 1 ב 13,000 XG ב RT.
  5. כדי לאפשר מקום תערובת אמן תגובת PCR, דגימות elute עם 40 μl EB הציפה לתוך צינור 1.5 מיליליטר טרי.

26. DNA כימות

  1. הכינו דגימות על פי הוראות היצרן (לוח 24). דגימות למדוד למכשיר שנבחר עם צינורות אופטיים.
  2. לאחר ספריות-exo שבב הם לכמת, להגיש עבור סידור על מערכת הפעלה שמשתמשת רצף-ידי-סינתזה כימיה 16 התואמת מתאמי ה- DNA בפרוטוקול זה.
    הערה: בדרך כלל, 2 μl של המדגם הוא מספיק כימות, אבל יותר עשוי להיות נחוץ אם ריכוז מדגם נמוך. DNA מניב טיפוסימגוון ly בין 50 ל 200 ng.
  3. לאחר כימות, דגימות חנות ב -20 C.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התמונות הבאות ממחישות תוצאות נציג מן פרוטוקול השבב exo שהוצג כאן. בניגוד מתודולוגיות שבב seq מסורתיים עם כמה צעדים אנזימטית, שבב exo דורש עשר תגובות אנזימטיות תלויות ברצף (איור 1). לפיכך, יש לנקוט זהירות בכל שלב על מנת להבטיח כי כל רכיב תגובה מתווסף תערובת מאסטר התגובה שלו בהתאמה. אנו ממליצים ליצור גיליון אלקטרוני נוסחה המבוססת על שולחנות התגובה לבצע את החישובים תמהיל מאסטר התגובה באופן אוטומטי, הדפסת לוחות וכתוצאה מכך, ולאחר מכן ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מציגים פרוטוקול גנומית תפקודי כדי לקבוע את המיקום המחייב המדויק עבור הכרומטין אינטראקצית חלבוני משוא פנים, רחב-הגנום ברזולוצית זוג הבסיס קרובה. השלב הקריטי ביותר להשיג ברזולוצית מיפוי זוג ליד הבסיס הוא טיפול exonuclease של ה- DNA השבב מועשר בעוד immunoprecipitate נשאר על השרף המגנטי. לכאורה, קומפלקסי חלבונים עלולים לחסום in vivo footprinting של כל תת-יחידה מסוימת (למשל, מתחמי שיפוץ הכרומטין או חלקיק הליבה הנוקלאוזום). עם זאת, כפי שדווח בעבר 10,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים למעבדת ונטרס ולחברי המחלקה לפיזיולוגיה מולקולרית וביופיזיקה על דיונים מועילים. תודה מיוחדת לפרנק פיו על ההדרכה, ההדרכה והדיונים הרבים ומלאי התובנות על הניואנסים של ChIP-exo בזמן שהייתי פוסט-דוקטורנט במעבדה שלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
37% פורמלדהיד, ללא מתנול, 10 x 10 מ"ל אמפולותThermoFisher Scientific28908סעיף 3
קוקטייל מעכב פרוטאז שלם (CPI)Roche Life Science11873580001סעיפים 4, 8
סוניקטור ביורופטורדיאגנודUCD200סעיף 5
שפופרות פוליסטירן 15 מ"לBD Falcon352095 סעיף 5
חרוזי חלבון MagSepharose G XtraHealthcare28-9670-66סעיף 6
DynaMag-1.5 מ"ל מתלה מגנטי צדדיInvitrogen12321Dסעיפים 6-17, 22
מיני צינור מסובבפישר סיינטיפיק05-450-127סעיפים 7, 22
T4 DNA פולימראזניו אינגלנד BioLabsM0203סעיף 9
DNA פולימראז I, KlenowNew England BioLabsM0210סעיף 9
10x NEBuffer 2 (10x מאגר תגובה 2)ניו אינגלנד BioLabsB7002סעיפים 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer CEppendorf5382סעיפים 9-16
ATPRoche Life Science010419979001סעיפים 9, 11, 13
dNTPsNew England BioLabsN0447סעיפים 9, 12, 19, 23
T4 Polynucleotide Kinaseניו אינגלנד BioLabsM0201סעיפים 9, 13
dATPניו אינגלנד BioLabsN0440סעיפים 10, 20
Klenow 3'-5' Exo מינוסNew England BioLabsM0212סעיפים 10, 20
T4 DNA ligase ניו אינגלנד BioLabsM0202סעיפים 11, 21
Φ-29 DNA פולימראזניו אינגלנד BioLabsM0269סעיפים 12, 19
10x Φ-29 מאגרניו אינגלנד BioLabsB0269סעיפים 12, 19
למבדה אקסונוקלאזניו אינגלנד BioLabsM0262סעיף 14
10x מאגר למבדהניו אינגלנד BioLabsB0262סעיף 14
RecJf ExonucleaseNew England BioLabsM0264סעיף 15
Proteinase KRoche Life Science03115828001סעיף 16
גליקוגןרוש מדעי החיים010901393001סעיף 18
10x T4 Ligase BufferNew England BioLabsB0202סעיף 21
AMPure XP (ניקוי) חרוזים בקמן קולטרA63881סעיף 22
Q5 התחלה חמה DNA פולימראז ניו אינגלנד BioLabsM0493סעיף 23
5x Q5 מאגר (5x PCR Buffer)ניו אינגלנד BioLabsB9027סעיף 23
QIAquick ערכת מיצוי ג'לQiagen28704סעיף 25
קיוביט פלואורומטרInvitrogenQ33216סעיף 26
צינורות קיוביט אופטיים שקופים InvitrogenQ32856סעיף 26
ערכת בדיקת רגישות גבוהה של Qubit dsDNAInvitrogenQ32851סעיף 26
GE

מקורות

  1. Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
  2. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
  5. Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
  6. Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
  7. Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
  8. Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035(2015).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
  10. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
  11. Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339(2016).
  12. Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
  13. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).
  14. Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
  15. Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).
  16. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
  17. Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).
  18. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
  19. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147(2013).
  20. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RecJfBioanalyzer

מאמרים קשורים