השתלת ADSC גליון למניעת היצרות לאחר מורחבת הושט Submucosal אנדוסקופי Dissection

סיכום

מחקר זה מדווח על שיטה מוצלחת של תא סטרומה נגזרת רקמת שומן endoscopical (ADSC) -תווים השתלה למניעת היצרות ושט לאחר דיסקציה submucosal אנדוסקופית מורחבת (ESD) במודל של חזירים.

תקציר

בשנים האחרונות, מבנה התא גליון דרבן עניין רחב ברפואה רגנרטיבית, במיוחד עבור ניתוחים שיקומיים. פיתוח הטכנולוגיות מגוונות שילוב תאי סטרומה רקמת נגזרות שומן (ADSCs) עם חומרים ביולוגיים שונים הוביל לבניית סוגים רבים של תחליפי רקמות מהונדסות, כגון עצם, סחוס, ורקמות שומן מן המכרסם, חזירי, או ADSCs אדם. דיסקציה submucosal אנדוסקופית של הוושט המורחבת (ESD) אחראי להיווצרות היצרות הוושט. מניעת היצרות נותרת מאתגרת, ללא טיפולים יעילים זמינים. מחקרים קודמים דיווחו על האפקטיביות של השתלת תאי גיליון רירית במודל כלבים ובני אדם. ADSCs מיוחסת תכונות אנטי דלקתיות, אפקטי אפנון חיסון מקומיים, נאווסקולריזציה אינדוקציה, ויכול בידול לתוך mesenchymal שושלות הלא mesenchymal. במחקר המקורי זה מתאר את tra אנדוסקופיתnsplantation של מבנה רקמות מהונדסות ADSC למנוע היצרות הוושט במודל החזירים. בונת ADSC הורכבה משתי יריעות ADSC אלוגנאית שכבתיות על אחד את השני על קרום תומך נייר. ADSCs תויג עם fluorophore PKH67 לאפשר endomicroscopy ליזר confocal מבוסס בדיקת ניטור (pCLE). ביום ההשתלה, ESD 5 סנטימטר היקפי-חמה ידועה לגרום היצרות ושט בוצע. בעלי חיים מיד הושתלו אנדוסקופית עם 4 מבנים ADSC. ההידבקות המוחלטת של מבני ADSC הושגה לאחר 10 דקות של יישום עדין. בעלי חיים הוקרבו ביום 28. כל בעלי החיים הושתלו בהצלחה. השתלה אושרה ביום 3 עם הערכת pCLE חיובית. בהשוואה לבעלי חיים מושתלים, חיות ביקורת פתחו חומרות חמורות, עם התפתחות רקמה גדולה fibrotic, צרות עיכול תכופות יותר, ועלייה במשקל מופחת. במודל שלנו, יושתל allogeniג ADSCs, מאורגן בסדיני תא כפולים, לאחר ESD המורחבת היה מוצלח קשר חזק עם שיעור היצרות ושט תחתון.

מבוא

הנהלת גידולים בושט שטחי השתנתה עם התפתחות טכניקות אנדוסקופית חדשה. כיום, כריתה אנדוסקופית הוא טיפול הקו הראשון. ואכן, היא מזוהה עם שיעורי תחלואה ותמותה נמוכים יותר מאשר ניתוח עם תוצאות אונקולוגי שווות ^{1, 2, 3.} כריתה הרירית אנדוסקופי (EMR) ו כריתה submucosal אנדוסקופית (ESD) הן טכניקות ביותר בשימוש נרחב. במקרה של גידול שטחי מורחב, ESD היא מועדפת. לעומת EMR, ESD מאפשר כמקשה resectioning, ללא קשר לגודל הנגע ולעצב ^{4, 5, 6.} הסיבוך העיקרי של עיכוב ESD הוא היווצרות היצרות הוושט, אשר מתרחשת בדרך כלל בין שבוע לשבועיים לאחר כריתה. מחקרים שפורסמו לאחרונה הראו היווצרות צרות מתואמת אלגודל של הכריתה. אגודת אנדוסקופי היפנית ממליצה הימנעות ESD מגודלו ¾ של היקף הוושט כי הם קשורים עם התפתחות היצרות בלמעלה מ -90% ממקרים ואחראים הצרות אכילה חמורות והידרדרות מרכזית באיכות החיים.

מניעת היצרות ושט נותרת מאתגרת. מנגנוני המעורבים היווצרות צרות הם רק מוכרים חלקית. צרות תצורות נראית לנבוע התאחדות שני מנגנונים שונים: (1) גיוס הסלולר פרו-דלקתי (2) פיתוח סיסטיק מוגזם ^7. טיפולים מונעים מספר הוצעו. עם זאת, התוצאות היו לא מספקות, עם יתרון קטן ותופעות לוואי חמורות ^{8, 9.} לאחרונה, צוות יפני, Ohki et al. , הציע להשתיל גיליון תא בודד-שכבה של תאים ברירית הפה עצמיים לתוך esophצלקת ageal. השתלה בוצעה מייד לאחר ESD ^{10, 11.} הם הדגימו את היעילות של גישה חדשנית זו, תחילה מודל כלבי ואחר כך בחולים.

רקמת הנגזרות השומן בתאי סטרומה (ADSCs) מבטיחים ברפואה רגנרטיבית. בקשתי בכמה תחומים הוכיח תוצאות מעניינות, במיוחד בתהליך ריפוי הפצע. טיפול ADSC מציע מספר יתרונות, כי התאים הם מבודדים בקלות ומזוהות עם תכונות אנטי-דלקתיות, תופעות מערכת חיסוניות מקומיות, נאווסקולריזציה אינדוקציה, ויכול בידול לתוך mesenchymal שושלות הלא mesenchymal ^{12, 13, 14.}

במחקר קודם, צוות שלנו הוכיח את היעילות של השתלת אנדוסקופית כפולה ADSC גיליונות קודם היצרות ושטention לאחר ESD ממושכת מודל החזירים ^15. במאמר זה, דיווחים על בניית ADSC גיליון וטכניקת השתלת endoscopical מוצגים.

פרוטוקול

כל החיות טופלו לפי ועדת האתיקה מחקר בעלי חיים (הנחיות משרד החקלאות הצרפתי). הפרוטוקול קיבל את אישור ועדת האתיקה המקומית הסמיכו ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת דקארט בפריז (מספר רשום 2035.02 MESR; הפקולטה לרפואה פריז דקארט, פריז, צרפת).

תרבות תיוג 1. ADSC

1. השג אשר ADSCs ממוסד פרטית. ADSCs אלוגנאית תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עם מדיום חיוני מינימום אלפא כוללים בסרום עגל 10% עובריים 1% אנטיביוטיקה (פניצילין סטרפטומיצין).
2. השג סביב 24 x 10 ⁶ ADSCs לכל חיה באמצעות נהלי הרחבת תא סטנדרטיים (37 ° C ו 5% CO _2). קציר ADSCs באמצעות פתרון טריפסין סטנדרטי (10 מ"ל למנה T150). בצעו ספירת תאים עם hemocytometer.
3. בצע תא תיוג היום לפני ההשתלה באמצעות יחסי ציבור מכתים PKH67ocedure כמתואר להלן.
   הערה: מטרת ההליך המכתים היא לאפשר תא מעקב לאחר השתלה.
   1. כדי תווית 2 x 10 ⁶ ADSCs, להכין פתרון (2 x 10 ⁶ תאים עם 100 μL של הממס C) פתרון B (4 μL של PKH67 עם 1 מ"ל של הממס C).
   2. דגירת פתרונות A ו- B למשך 2 דקות. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של נסיוב עגל העוברי דקות 1.
   3. יש לשטוף את הפתרון עם 300 μL של citrated RPMI (298.5 μL של RPMI ו -1.5 μL של ציטראט) ו צנטריפוגות ב 1500 XG במשך 5 דקות. חזור על פעולה זו 2 פעמים. שמור את התאים שכותרתו ולהגן עליהם מפני האור עד הבנייה וכו '.

2. Construct הזוגי ADSC הגיליון

1. יום לפני ההשתלה, להכין צלחת תרבית תאים טמפרטורה-תגובה 12 גם עם 4 מ"ל לכל טוב של המדיום תרבית תאים, כמתואר לעיל, לפני PKH תיוג. זרעי הצלחת עם 1.5 x 10 ⁶ PKH-labeleתאי ד לכל היטב דגירה במשך 12 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2).
2. ביום ההשתלה, לנתק את גיליון התא ומחובר על ידי דוגרי הצלחת בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
3. לשאוב בעדינות גיליון ADSC אחד עם טפטפת שכבת אותו על נייר הידרופובי (קוטר 1.5 ס"מ). השתמש בנייר זה כמו קרום תמיכה.
4. אחוז אחר גיליון ADSC בעדינות להפקיד אותו על גבי אחד את השני כדי להשיג מבנה שכבה כפולה.
5. חזור על הליכים אלה להשיג כמה שיותר בונה ADSC גליון לפי הצורך (4 לכל חיה).

3. הושט Submucosal אנדוסקופי Dissection (ESD)

1. ביום ההשתלה, מראש בתרופות החיות עם 10 מ"ג / ק"ג של קטמין שרירית ולגרום להם עם 8 מ"ג / ק"ג של propofol תוך ורידי. לאחר מכן, לבצע אינטובציה endotracheal ולשמור על הרדמה עם שאיפה 2.5% isoflurane.
2. לאחר שהחיה היא בהרדמה כללית, לבצע ESD עם gastroscאופ, videoscope, ויחידת electrosurgery.
   1. משתמשים בסכין אנדוסקופית וקרישה רכה להשיג סימני הגבי-היקפי חמים הנעים בין 40 סנטימטר ל -45 סנטימטרים מן קשת השיניים.
   2. להזריק פתרון גליצרול המכיל צבע אינדיגו ארגמן לתוך שכבת Submucosal להפרדת השכבה הרירית משכבת ​​שרירים.
   3. משתמשים בסכין אנדוסקופית עם סגנון שאני endocut להשיג חתכים היקפיים.
   4. משתמשים בסכין אנדוסקופית עם מצב קרישה נאלץ לבצע דיסקציה submucosal, נע מן החתך הפרוקסימלי החתך דיסטלי.
3. בסוף הליך ESD, לקיים את החם היקפי, 5 סנטימטר באורך צלקת ושט חושפת את מצע השרירים.

4. השתלת אנדוסקופי

1. מיד לאחר ESD, אנדוסקופית להשתיל חיות עם 4 מבנים ADSC גליון כפול.
   1. אחוז הוא מבנה ADSC גיליון עם מלקחיים אנדוסקופיותלהגן עליו במהלך ההובלה לאתר הפצע באמצעות כובע אנדוסקופית גדול ושקוף.
   2. החלת את כל פני השטח של מבנה ADSC הגיליון למיטת הכיב.
   3. בעדינות להחיל את מבנה ADSC גליון במשך 10 דקות כדי לקבל engraftment שלם ויציב. עבור יישום, להשתמש במלקחיים אנדוסקופית או כובע אנדוסקופית ולהחיל את כל פני השטח של ADSC לבנות על שכבת Submucosal הוושט.
2. חזור על הליך זה ארבע פעמים עבור כל חיה על מנת לקבל ארבעה מבני תא גיליון כפולים מושתלים לבין חסיד.
   הערה: המטרה היא לכסות approximatively מחצית משטחתה הפצועה.

5. הערכה לאחר ניתוח ומעקב

1. עבור כל חיה, להבטיח שיכוך כאבים שלאחר ESD עם הזריקה תוך שרירית של 0.2 מ"ג / קילו של מורפיום שלוש פעמים ביום במשך היום הראשון, ועם טיפול סותר חומצה 28-יום של esomeprazole (40 מ"ג / יום). בצעו טיפול מונע אנטיביוטי עם amoxicillב (1 גר '/ יום) למשך 7 ימים. תן הרשאה נוזלת ביום 1 ומוצקים למחרת.
2. מעקב עם חיות במשך 28 ימים. השג הערכות קליניות יומיות באמצעות עשרות בליעת Mellow פנקס ¹⁶ ומדידות וריאצית משקל.
3. הערכת stricture מולטימודליות: בהרדמה כללית, בימים מתוכננים 3, 14, ו -28, לבצע הערכה משולבת של התרחשות היצרות.
   1. בצע הערכה אנדוסקופית באמצעות תיאור צלקת, מדידת צרות, וזיהוי קרום תומך נייר. מדוד את הצרות באמצעות גסטרוסקופ לחצות דרך הצרות (בקוטר של גסטרוסקופ הוא 8 מ"מ). שים את הצלקת, לשים לב להיבט הדלקתי (אריתמה ברירית, הבצקת רירית, ואת רירית דימום ספונטני) והעדר או נוכחות של קרום תומך נייר בתוך הצלקת.
   2. החל חללית ירוקה pCLE דרך תעלת מפעיל גסטרוסקופ ישירות לתוך מיטת הצלקת. חיפוש איש ספונטניומאורגן אות ירוקה תואמת engraftment לבנות ADSC גליון שכותרתו PKH67.
   3. בצע 2 מקרים מאונכים של בריט esophagography עם חישוק רדיולוגי (מלפנים מקרים של צד שמאל). שמור את השכיחות ההדוקה להערכת stricture (מידת היצרות (%) = [1- (האורך של הציר הקצר תחת היצרות / האורך של הציר הנורמלי תחת היצרות) x 100)]) ^{17, 18.}
4. קרבנות.
   1. ביום 28, בסוף תקופת המעקב, לבצע את הקרבנות. בעוד החיה עדיין תחת הרדמה כללית, להזריק 100 מ"ג / ק"ג של phenobarbital תוך ורידי. ודא מוות חי באמצעות בדיקה קלינית על ההיעדר דופק ושל נשימה ותנועה.
   2. לאחר חשיפת sternotomy ועוגבת, להסיר את הוושט מכל הקריב מן החי (עם קיבעון פורמלין 10% שנאגר, הטבעת פרפין, ו 4 חלקים מיקרומטר בעובי). כתם השקופיותעם Hematoxylin וזעפרן ^15. Digitalize את השקופיות עבור ניתוח ממוחשב ולהשוות את קבוצות בעלי החיים ^15.

תוצאות

תרבות ADSCs ואת ההליך להשיג את גיליון ADSC מוצגת באיור 1. איור 2 מציג את הבנייה של השתל, מורכבת משני גיליונות ADSC השכבתיים על אחד את השני על קרום התמיכה במאמרם. ADSCs תויגו בעבר עם fluorophore PKH67 לאפשר ניטור שתל vivo עם pCLE. איור 3 מציג את השלבים השונים של דיסקציה submucosal המורחבת ושט אנדוסקופית, וכתוצאה מכך צלקת ושט 5 סנטימטרים חמים היקפית. איור 4 מראה את ...

דיון

במודל חזיר זה, השתלת ADSC הגיליון הייתה מוצלחת מבחינה טכנית, ואת הערכת pCLE ובחי מותרת לניטור engraftment התא. הערכות קליניות, endoscopical, רדיולוגי, היסטולוגית הוכיחו את היעילות של גיליון ADSC אנדוסקופית למניעת היצרות ושט לאחר ESD המורחבת.

השתלת אנדוסקופית של פתרון גליצרול ADSC המכיל גיליון צבע ארגמן אינדיגו היא גישה חדשנית ברפואה רגנרטיבית. Ohki et al. הראשון שתיאר את הליך ההשתלה אנדוסקופית. ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כובע אנדוסקופי שקוף Q180 תואם	אולימפוס אופטי Co
GIF-Q180 גסטרוסקופ			אולימפוס
Exera II	אופטית של אולימפוס 18
	אופטית של אולימפוס ERBE
ICC 350	טכנולוגיית
אינדיגו קרמין 1%	חיים
סכין היברידית אנדוסקופית	Life
Minisonde Z pCLE בדיקה ירוקה	Mauna Kea טכנולוגיה		עליך ללמוד כיצד להשתמש בבדיקה. המניפולציה עלולה להיות קשה.
סרום בקר עוברי	סיגמא אולדריץ'	12105C
טריפסין	סיגמא אולדריץ'	T146
אלפא מינימום חיוני בינוני	תרמו פישר	22561-021
מלחים חוצצים פוספט	תרמו פישר	10010-023
ערכת צבע PKH67	סיגמא אולדריץ'	Mini67-KT
תא מגיב לטמפרטורה 12 בארות צלחת תרבית	Upcell Thermo Scientific	174900	הרגישו את הנוזל עם תרבית בינונית סטנדרטית של 4 מ"ל 30 דקות לפני זריעת תאים
אסומפרזול 40 מ"ג	ביוגרן
מופרין סולפט 50 מ"ג/מ"ל	לבואזיה
אמוקסיצילין 1 גרם	ביוגרן
קטמין 250 מ"ג/5 מ"ל	פנפארמה
פרופופול 10 מ"ג/מ"ל	נייר הידרופובי פרזניוס
	קרפור

מערכת וידאו-סקופ אופטית של מחט הזרקה גרם יחידת אלקטרו-כירורגיה ERBE