מאמר שיטה

טיפוח Elegans Caenorhabditis ב בשלושה ממדים במעבדה

DOI:

10.3791/55048

⸱

12 בדצמבר 2016

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטה פשוטה לבנות מערכות טיפוח נמטודות 3D נקרא NGT-3D ו NGB-3D. אלה יכולים לשמש כדי לחקור כושר נמטודות והתנהגויות בבתי גידול, כי הם יותר דומים לאזורים מחית elegans Caenorhabditis הטבעית מאשר צלחות תרבות elegans המעבדה ג 2D הסטנדרטיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש באורגניזמים במודל גנטי כמו Caenorhabditis elegans הוביל לתגליות מכוננות בביולוגיה בחמשת העשורים האחרונים. רוב מה שאנו יודעים על C. elegans מוגבל לגידול מעבדה של נמטודות שאולי לא בהכרח משקפות את הסביבות שהן מאכלסות בדרך כלל בטבע. גידול C. elegans בבית גידול תלת מימדי הדומה יותר למטריצה התלת-ממדית שתולעים נתקלות בה בפירות רקובים ובקומפוסט צמחי בטבע יכול לחשוף פנוטיפים והתנהגויות חדשים שלא נצפו בדו-ממד. נוסף על כך, ניסויים בתלת-ממד יכולים להתייחס לאופן שבו פנוטיפים שאנו רואים בדו-ממד רלוונטיים לתולעת בטבע. כאן מוצגת שיטה חדשה שבה C. elegans גדל ומתרבה באופן נורמלי בתלת מימד. גידול של C. elegans ב-Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) יכול לאפשר לנו למדוד את כושר הרבייה של זני C. elegans או תנאים שונים בסביבה תלת מימדית. אנו מציגים גם שיטה חדשנית, הנקראת בקבוק גידול נמטודות תלת מימד (NGB-3D), לטיפוח C. elegans בתלת מימד לניתוח מיקרוסקופי. שיטות אלה מאפשרות למדענים לחקור את הביולוגיה של C. elegans בתנאים המשקפים יותר את הסביבות שהם נתקלים בהן בטבע. אלה יכולים לעזור לנו להבין את הרלוונטיות האבולוציונית הכוללת של הפיזיולוגיה וההתנהגות של C. elegans שאנו רואים במעבדה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקר הנמטודה Caenorhabditis elegans במעבדה הוביל לתגליות מכוננות בתחום הביולוגיה במהלך חמשת העשורים האחרונים1. C. elegans היה האורגניזם הרב-תאי הראשון שריצף את הגנום שלו ב-19982, והוא לא יסולא בפז בהבנת התרומות של גנים בודדים להתפתחות, לפיזיולוגיה ולהתנהגות של אורגניזם שלם. מדענים מחפשים כעת להבין עוד יותר כיצד גנים אלה עשויים לתרום להישרדות ולכושר הרבייה של אורגניזמים בסביבתם הטבעית, ושואלים שאלות על אקולוגיה ואבולוציה ברמה הגנטית3-5.

C. elegans שוב יכול לספק מערכת מצוינת לענות על שאלות אלה. עם זאת, מעט ידוע על הביולוגיה של C. elegans בבתי גידול טבעיים של נמטודות, ואין כיום שיטות לדמות תנאים טבעיים מבוקרים של C. elegans במעבדה. במעבדה, C. elegans מעובד על פני צלחות אגר שנזרעו עם חיידקי E. coli 6. בטבע, לעומת זאת, ניתן למצוא C. elegans ונמטודות קשורות המאכלסות בדלילות קרקעות ברחבי העולם, אך הן נמצאות במיוחד משגשגות בפירות נרקבים ובחומר צמחי7,8. הסביבות התלת-ממדיות המורכבות האלה שונות למדי מהסביבות הדו-ממדיות הפשוטות שאליהן תולעים נחשפות במעבדה.

כדי להתחיל לענות על שאלות על הביולוגיה של נמטודות בסביבה תלת-ממדית טבעית יותר, עיצבנו בית גידול תלת-ממדי לגידול מעבדה של נמטודות שקראנו לו Nematode Growth Tube 3Dאו בקיצור NGT-3D. המטרה הייתה לתכנן מערכת גידול תלת מימדית המאפשרת צמיחה, התפתחות ופוריות דומות ללוחות הסטנדרטיים של 2D Nematode Growth Media (NGM)10. מערכת זו תומכת בגידול חיידקים ונמטודות לאורך כל מחזורי חייהם בתלת מימד, מאפשרת לתולעים לנוע ולהתנהג בחופשיות בתלת מימד, והיא קלה וזולה לייצור ולשימוש.

במחקר הנוכחי, אנו מספקים שיטה שלב אחר שלב לייצור NGT-3D ולהערכת התפתחות תולעים ופוריותן. בנוסף להערכת כושר התולעים בתלת-ממד, ביקשנו לצלם, לווידאו ולהעריך את התנהגות התולעים והפיזיולוגיה שלהן בגידול תלת-ממדי. לפיכך, בנוסף ל-NGT-3D, אנו מציגים כאן שיטה חלופית הנקראת Nematode Growth Bottle 3D או NGB-3D, להדמיה מיקרוסקופית של C. elegans במהלך גידול תלת מימדי. זה יהיה חשוב במיוחד לחקר התנהגויות ידועות שזוהו בדו-ממד, ולזיהוי התנהגויות חדשות ייחודיות לטיפוח תלת-ממדי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכינו פתרונות עבור NGT-3D ו NGB-3D

  1. הכן את הפתרונות סטרילי הבאים: 1 ליטר של 0.1454 פתרון M NaCl, 1 ליטר של 1 M CaCl 2, 1 ליטר של 1 M MgSO 4, מרק Lysogeny (LB), 1 ליטר של 1 M KPO 4 חיץ (108.3 גרם של KH 2 4 PO ו 35.6 גרם של K 2 HPO 4, ולמלא H 2 O ל L 1). הפקה של NGM באמצעות פתרונות אלה ניתן למצוא בפרוטוקול קודם 10.
  2. פתרונות חיטוי ב 121 ° C, 15 דקות.
  3. הכן 50 מ"ל של פתרון 5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול סטרילי. בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל, לערבב 0.25 גרם של כולסטרול ו -50 מ"ל של אתנול 99.99% ומערבבים היטב. אל חיטוי. לעקר את הפתרון כולסטרול באמצעות מזרק 50 מ"ל עם מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. זה יהיה גם להסיר כל כולסטרול שלא נמס.
  4. (אופציונלי) הכן 10 מ"ל של 150 מ"מ של 2'-deoxy-5-fluorouridine המניות (FUDR). בתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, לערבב 0.3693 גרםשל FUDR ו -10 מ"ל מים מזוקקים. נער היטב.

2. כן תרבות חיידקים עבור NGT-3D ו NGB-3D

  1. לחסן 10 מ"ל מרק LB עם חיידקים. החיידקים הסטנדרטיים המשמשים עבור אלגנס האכלה הוא OP50 זן החיידק.
  2. תרבות חיסון החיידקים על 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת הלילה.
  3. לקראת דילול סדרתי, aliquot 9 מ"ל של פתרון NaCl לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל סטרילי. לדוגמה, aliquot 9 מ"ל לתוך סך של 7 צינורות לבצע דילול 10 -7 של E. coli זן OP50.
  4. בעזרת פיפטה 1,000 μl סטרילי, pipet 1 מ"ל של תרבית החיידקים או התרבות חיידקים בדילול לתוך הצינור החדש סטרילי עם 9 מ"ל של תמיסת NaCl ו מערבולת את התערובת 10 מ"ל היטב. חזור על הפעולה עד דילול חיידקי הרצוי הוא הגיע.
    ההערה: דילול החיידקים הרצוי תלוי בסוג והמצב של חיידקים, כמו גם את תנאי ניסוי המדויקים.לדוגמה, 10 -6 - 10 -8 דילול של זן OP50 E. coli היה מספיק כדי להפיק מן 1 - 200 מושבות חיידקים לכל 6.5 מ"ל צינור NGT-3D. תולעים שפותחו באופן מהימן ומתרבים בדרך כלל כאשר מספר מושבות היה מעל גיל 60, שאירע בשעת דילול של 10 -6 - 10 -7. לקבלת NGB-3D, השתמש דילול של 10 -8.

3. ביצוע NGT-3D ו NGB-3D (200 מ"ל)

  1. לאחר הכנת תרבית החיידקים, לערבב 0.6 גרם NaCl, 1 גרם אגר מגורען, ו -0.5 גרם peptone בבקבוק 500 מ"ל. הכנס בר ומערבבים מגנטיים לתוך הבקבוק.
  2. להוסיף 195 מ"ל מים מזוקקים לכסות את הפה של הבקבוק עם רדיד אלומיניום.
  3. C חיטוי 121 מעלות במשך 15 דקות.
  4. מניחים את הבקבוק autoclaved חם על צלחת ומערבבים, ומערבבים במהירות בינונית במשך שעה לפחות 2. מצננים את הבקבוק עד 40 ° C. הקפד לקרר מספיק כממשיך מכאן בטמפרטורות גבוהות עלול להוביל ערפול של אגר המוגמר.עם זאת, בטמפרטורות נמוכות עלולות לגרום התקשות המוקדמת של אגר.
    1. (אופציונלי) כדי להאיץ את תהליך הקירור, הנח את הבקבוק בתוך 15 דקות באמבט מים 40 ° C לפני הצבת בצלחת ומערבבים.
  5. כאשר הטמפרטורה של התקשורת אגר מגיע 40 ° C, להוסיף 200 μl 1 M CaCl 2, 200 μl של 5 מ"ג / פתרון כולסטרול מ"ל, 200 μl 1 M MgSO 4 ו -5 מ"ל 1 M KPO 4 חיץ כפתרון ממשיכה לעורר לריכוזים סופי של 1 2 מ"מ CaCl, 5 כולסטרול מיקרוגרם / מ"ל, 1 מ"מ 4 MgSO, 1 מ"מ KPO 4.
    1. (אופציונלי) עבור assay תוחלת החיים NGT-3D להוסיף 80 μl של 150 מ"מ FUDR לריכוז סופי של 120 מיקרומטר 12.
  6. הוסף 6 מ"ל של 10 מ"ל מדולל תרבית החיידקים משלב 2.4 לתוך הבקבוק ישירות.
    1. (אופציונלי) עבור NGT-3D, להסיר 6 מ"ל של התקשורת אגר לפני שלב 3.6 ו לשמור אותו חם בנפרד. מדיה זה ישמש את החיידקים ללאשכבה עליונה.
  7. בעזרת הליכים סטרילי, לוותר התקשורת לתוך תא תרבות סטרילי. ודא שהמכסה של החדר נסגרת בחוזקה.
    1. (אופציונאלי) כדי למנוע מושבות חיידקים מ טביעה על פני השטח העליונים של אגר, ליצור שכבה של תקשורת אגרה חיידקים ללא משלב 3.6.1 בחלק העליון בפני התקשורת משלב 3.7 מתקשה לחלוטין. פעולה זו תיצור אזור חיידקים ללא בחלק העליון של NGT-3D.
    2. לקבלת NGT-3D, יוצקים 6.5 מ"ל התקשורת לתוך מבחנות פלסטיק 8 מ"ל ברור ליצור שכבה אגר חיידקים, ובזהירות לוותר 200 μl של התקשורת חיידקים חינם על גבי מדיה 3D קשוח למחצה לעשות bacteria- דק שכבה חינם על העליונה.
    3. לקבלת NGB-3D, יוצקים 65 מ"ל של המדיה לתוך בקבוק תרבית תאים 25 ס"מ 2 פלסטיק שקוף. סכום זה צריך למלא את הגוף של בקבוק תרבות 25 ס"מ 2 תאים.
  8. השאר תאים אנכיים בטמפרטורת חדר למשך שבוע כדי לאפשר מושבות חיידקים לגדוללגודל ניכר מ"מ קוטר 1 לפחות.
    1. (אופציונלי) עבור assay תוחלת החיים ב NGT-3D, תאי מכסים ברדיד אלומיניום כדי למנוע השפלה לאור FUDR.

4. כושר מדוד אוכלוסין תולעת על NGT-3D (Assay גודל יחסית Brood)

  1. פיק תולעת L4 לבמה בעזרת חוט פלטינה לקטוף העברה בצלחת NGM חיידקים חינם. אפשר תולעת לנוע בחופשיות במשך כמה דקות כדי להסיר חיידקים מחוברים לגוף שלה.
  2. חזור על שלב 4.1 וודא כי התולעת היא ללא חיידקים. באופן כללי, ולשני שידורים חוזרים של 4.1 הם מספיק.
  3. בזהירות במקום התולעת הנקיה על פני השטח של תקשורת 3D במכוש חוט פלטינה. התולעת צריכה בסופו של דבר להיכנס אגר לתוך המטריצה ​​אגר 3D.
  4. סגור את המכסה רופף המאפשר אוויר כלשהו להגיע לתוך הצינור, אבל מניעת ההתייבשות של התקשורת אגרה.
  5. דגירה של 96 שעות ב 20 מעלות צלזיוס.
  6. לאחר 4 ימים, לסגור את העפעפיים בחוזקה והמקוםNGT-3D תא תרבות לתוך אמבט מים 88 ° C כדי להמיס את אגר. החום הורג תולעים אך גופם נותרו על כנן.
    הערה: שימוש 8 מ"ל צינורות עבור NGT-3D, 20 - 30 הדגירה דקות בדרך כלל מספיק.
  7. בעזרת פיפטה זכוכית, להעביר את התקשורת מומסת על צלחת פטרי פלסטיק 9 ס"מ. טפטפות פלסטיק לא מומלצות, כמו תולעים לעתים קרובות יכולים להידבק אליהם.
  8. באמצעות מיקרוסקופ לנתח סטריאו שידור, לספור את מספר תולעים בבית L3, L4, ושלבי מבוגר. אל תסמכו תולעים כי הם בשלב L2 וצעיר, במרוצת הדורות F1 ו- F2 יכול להתבלבל כאן. לפיכך, assay זה הוא assay גודל להרהר ביחס ולא assay גודל גוזל הכולל.

תמונה 5. והתנהגות תולעת שיא על NGB-3D

  1. פיק תולעת L4 לבמה בעזרת חוט פלטינה לאסוף ולהסיר כל חיידקים תקועים אל פני השטח על ידי העברה לצלחת חיידקים ללא NGM ומאפשר לו לנוע בחופשיות במשך כמה דקות.
  2. חזור על שלב 5.1 לוודא ווrm הוא ללא חיידקים.
  3. בזהירות במקום התולעת הנקיה על גבי במרכז השטח אגר של NGB-3D ליד הצוואר של הבקבוק במכוש חוט פלטינה. התולעת צריכה בסופו של דבר להיכנס אגר לתוך המטריצה ​​אגר 3D.
  4. סגור את המכסה רופף המאפשר אוויר כלשהו להגיע לתוך הצינור, תוך מניעת ההתייבשות של התקשורת אגרה.
  5. תמונה או להקליט את התולעת תחת מיקרוסקופ לנתח סטריאו שידור. התאם את המיקוד כתולעת עוברת דרך מטריקס 3D.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניית NGT-3D היא פרוטוקול פשוט וברור שתוצאתה הוא מבחנה המלאה אגרה עם מושבות חיידקים קטנות במרווחים לאורך (איור 1 א) אגר. תולעים יכולים לנוע בחופשיות דרך מטריקס אגר, מציאה וממצים את מושבות חיידקים. כדי לברר האם אלגנס יכולים להתרבות ולגדול בדרך כלל NGT-3D, השווינו פוריות התפתחות הזחל ב -3 D עם צלחות 2D NGM סטנדרטיים. ב assay הגודל גוזל יחסית, מבוגר C. elegans הרמפרודיטים ב NGT-3D לשחזר בדיוק כמו הרמפרודיטים צלחות NG...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפוח המעבדה של C. elegans באמצעות צלחות תקשורת צמיחת נמטודות הקלסיות היה חיוני למאות תגליות חשובות כי המחקר ב C. elegans ספקה. כאן, אנו מציגים שיטות חדשות לטפח סי אלגנס בסביבה בצורה מדויקת יותר משקפת גידול תלת מימדי הטבעי שלהם. למרות שיטות אחרות שימשו להתבונן אלגנס ב 3D 13, זהו הפרוטוקול הראשון המאפשר טיפוח תולעים במטריצה 3D מוצק. שתי השיטות שמוצגות כאן, NGT-3D ו NGB-3D, לאפשר למדענים לשאול שאלות של כושר, התפתחות וצמיחה בטיפוח 3D, וג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי ניו החוקר גרנט [2014R1A1A1005553] מן קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) כדי ג'יל; ומענק אתגר העתיד אוניברסיטת Yonsei המנהיג [2015-22-0133] כדי ג'יל

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מרק LB, מילר (לוריא-ברטני)Difco224620
נתרן כלוריDAEJUNG7548-440058.44 MW
אגר, דיפקו מגורען214530
פפטוןבקטו211677
סידן כלורי, דיהידראטביו בייסיקCD00502*H<תת>2O; 147.02 מגה-וואט
כולסטרולביו בייסיקCD0122386.67 MW
אלכוהול אתיליB& JRP090-199.99%; 46.07 מגה-וואט
מגנזיום גופרתי,נטול מים ביו בייסיקMN1988120.37 מגה-וואט
אשלגן פוספט, מונובסיסי, נטול מיםביו בייסיקPB0445136.09 מגה-וואט
2'-דאוקסי-5-פלואורורידיןטוקיו תעשייה כימיתD2235246.19 מגה-וואט
אשלגן פוספט, דו-בסיסי, נטול מיםביו בייסיקPB0447174.18 מגה-וואט
מבחנות רב תכליתיותStockwell ScientificST.85708 מ"ל
סגירות מבחנהStockwell ScientificST.8575
בקבוק תרבית תאיםSPL Lifescience7012525 ס"מ2
Research מיקרוסקופ סטריאוNikonSMZ18
ראש מצלמה צבעוני בחדות גבוההNikonDS-Fi2
יחידת בקרה מבוססת PC,NikonDS-U3
NIS-Elements, מחקר בסיסי, תוכנת הדמיית מיקרוסקופNikonMQS32000
, ,

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  2. Consortium, C. E. S. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  3. Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans. ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).
  4. Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).
  5. Cutter, A. D. Caenorhabditis evolution in the wild. Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Felix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).
  8. Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
  9. Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D. Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).
  10. Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).
  11. Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment. Biomed Res Int. , 465056(2015).
  12. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (48), (2011).
  13. Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. 3-D worm tracker for freely moving C. elegans. PLoS One. 8 (2), e57484(2013).
  14. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
  15. Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments. Sci Rep. 5, 9564(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C elegansNGT 3DNGB 3D

מאמרים קשורים