Method Article

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

DOI:

10.3791/55077

⸱

January 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 2Department of Biotechnology and Genetic Engineering, Jahangirnagar University, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences, 5Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקמנו שיטה לטיהור של חלבונים אינטראקציה coregulatory באמצעות מערכת LC-MS / MS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רגולטורים שעתוק חיוניים לוויסות שעתוק יעיל של מבנה הכרומטין הגרעיני. רגולטורים ממלאים מגוון תפקידים בוויסות שעתוק. אלה כוללים אינטראקציה ישירה עם גורמי שעתוק, שינוי קוולנטי של היסטונים וחלבונים אחרים, ושינוי קונפורמציה של כרומטין מדי פעם. בהתאם לכך, ביסוס שיטות מהירות יחסית לזיהוי חלבונים המקיימים אינטראקציה בתוך רשת זו הוא חיוני לשיפור ההבנה שלנו לגבי מנגנוני הבקרה הבסיסיים. זיהוי שותף קושר חלבון בתיווך LC-MS/MS הוא טכניקה מאומתת המשמשת לניתוח אינטראקציות חלבון-חלבון. על ידי חיסון של חבר שזוהה בעבר בקומפלקס חלבונים עם נוגדן (לעיתים עם נוגדן לחלבון מתויג), ניתן לזהות את האינטראקציות החלבון הלא ידועות שלו באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה. כאן, אנו מציגים שיטה להכנת חלבון לזיהוי תפוקה גבוהה בתיווך LC-MS/MS של אינטראקציות חלבון הכוללות קופקטורים גרעיניים ושותפיהם המקושרים. שיטה זו מאפשרת הבנה טובה יותר של מנגנוני ויסות השעתוק של הגורמים הגרעיניים הממוקדים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות בין חלבונים ממלאים תפקיד חשוב תפקודים ביולוגיים רבים. ככזה, אינטראקציות אלה היו מעורבים הולכים אותות; תחבורה חלבון על פני קרום התא; חילוף חומרים בתא; וכמה תהליכים גרעיניים, כולל שכפול הדנ"א, לתקן נזקים ב- DNA, רקומבינציה, והתעתיק 1, 2, 3, 4. זיהוי חלבונים מעורבים באינטראקציות אלה היא אפוא קריטי לקידום הבנתנו תהליכים תאיים אלה.

Immunoprecipitation (IP) היא טכניקה תוקף להשתמש כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים. על מנת להקל על זיהוי של חלבונים-immunoprecipitated שיתוף, ספקטרומטריית מסה הוא מנוצל לעיתים קרובות 5, 6, 7, 8,9. על ידי מיקוד חבר ידוע של קומפלקס חלבון עם נוגדן, אפשר לבודד את החלבון מורכב ובהמשך לזהות מרכיביה הידועים באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה. ARIP4 (אינטראקצית קולטן האנדרוגן חלבון 4), coregulator תעתיק, אינטראקציה עם חלבונים רצפטור גרעיניים כדי להפעיל או לדכא יזמי היעד שלה באופן תלוי קשר 9, 10. כדי להבין טוב יותר את מנגנוני ויסות תעתיק מסדירי גורמים גרעיניים אלה, אנו מתארים שיטה מקיפה לטהר לזהות חלבוני אינטראקצית ARIP4 באמצעות מערכת LC-MS / MS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfection

  1. זרעים HEK293 תאים צלחות תרבות 100 מ"מ (2 x 10 6 תאים / תבשיל). תרבות התאים במדיום של הנשר השונה של Dulbecco בתוספת 10% בסרום עוברי עגל, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו -100 יחידות / מיליליטר פניצילין. דגירה התאים בתוך חממה humidified ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס.
  2. למחרת, transfect את התאים עם 10 מיקרוגרם של פלסמיד ARIP4 מתויג FLAG באמצעות 40 μl של מגיב transfection פי הנחיות היצרן 11.

2. הפקת חלבון

  1. כ 36 שעות שלאחר transfection, לשטוף את התאים עם PBS קר כקרח ו לקצור את התאים באמצעות מגרד. העברת התאים לתוך 1.5 mltube צנטריפוגות זה ב 8000 XG במשך 2 דקות ב 4 °. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 5x נפח גלולה של חיץ 0.4 M KCl (חיץ מלח גבוהה: 20 מ"מ טריס- HCl (pH 8.0), 0.4 KCl M, 5 מ"מ MgCl 2, 10% גליצרול, 0.1% NP-40, 10 מ"מ ב-mercaptethanol, קוקטייל מעכב פרוטאז 1x). סובב את התערובת במשך 20 דקות ב 4 °.
  2. צנטריפוגה הצינור ב 17,700 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
  3. מעבירים את supernatant (תמצית כל תא) לצינור 2 מ"ל חדשה ולהוסיף 3x נפח הראשונית של 0 חיץ M KCl (דילול חיץ: 20 מ"מ טריס- HCl (pH 8.0), 5 2 מ"מ MgCl, 10% גליצרול, 0.1% NP-40, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x).
  4. בצע צנטריפוגה אחרת (17,700 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C) ולהעביר את supernatant (תמצית התא כולו) לצינור 2 מ"ל חדש.

3. Immunoprecipitation

  1. במהלך צנטריפוגה (2.4), לשטוף 50 μl של חרוזים אנטי FLAG עם PBS, 0.1 מ 'גליצין-הידרוכלוריד, ולאחר מכן 1 M טריס-הידרוכלוריד, ואחריו כביסה פעמיים עם 0.1M KCl חיץ (חיץ מלח נמוכה: 20 מ"מ כמה עצוב HCl (pH 8.0), 0.1 מ 'KCl, 5 מ"מ MgCl2, 10% גליצרול, 0.1% NP-40, 10 מ'M ב-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x). צנטריפוגה עבור תהליך כביסה זה מבוצעת XG ב 2000 דקות 1 ב 4 ° C.
  2. מערבבים 50 μl של חרוזים FLAG עם תמציות כל תא בעדינות לסובב את התערובת במשך 4 שעות ב 2-4 מעלות צלזיוס (1% של תמצית כל תא משלב 2.4 צריך גם להישמר ב -80 ° C לשימוש עתידי כקלט).
  3. מעבירים את המדגם לעמודה ספין מיקרו (ירידה של כדור הארץ). שמור את הזרימה דרך צינור 1.5 מ"ל, להקפיא אותו באמצעות חנקן נוזלי, ולאחסן אותו ב -80 ° C (לבדוק את רמות החלבון של שני קלט זרימה דרך באמצעות ניתוח כתם המערבי).
  4. הוסף 1 מ"ל של 0.1 חיץ M KCl (חיץ מלח נמוכה) כדי לשטוף את החרוזים FLAG (ירידה של כדור הארץ).
  5. חזור על שלב 3.4 לפחות יותר ארבע פעמים (עבור סכום כולל של חמישה שוטף).

4. Elution

  1. מניחים את הטור לתוך צינור 1.5 מ"ל ו צנטריפוגות זה XG ב 2000 דקות 1; החרוזים יתייבשו.
  2. כיסוי או בתחתית הטור.
  3. הוסף 50 μl (שווה לנפח של חרוזים FLAG) של 0.1 מ 'גליצין-HCl (pH 2.5).
  4. נער בעדינות את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מניחים את הטור לתוך צינור 1.5 מ"ל חדש צנטריפוגות זה XG ב 2000 דקות 1.
  6. פתרון eluted מנוטרל עם 10 μl של 1 M טריס- HCl (pH 8.0); ומערבבים היטב על ידי pipetting או באמצעות מכונה מערבולת.

5. אלקילציה ו trypsinization

  1. הוסף 50 μl של 100 מ"מ NH 4 HCO 3, 10 μl של CH 3 CN, ו -2 μl של dithiothreitol לתערובת (112 הנפח הכולל μl).
  2. דגירה המדגם במשך 30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס.
  3. מניחים את המדגם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  4. הוסף 10 μl של 333 מ"מ iodoacetamide המדגם ו דגירה אותו בחושך במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. הוסף 10 μl של טריפסין (33 ng / μl) לתערובת ו דגירה אותו לילה בשעה 37 ° C.

ילדה = "jove_title"> 6. LC-MS / MS ניתוח

  1. בעקבות trypsinization לילה, להעביר את המוצר הסופי למתקן LC-MS / MS או למעבדה ספקטרומטריית מסה של צד שלישי עבור ניתוח 12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהינו אות ARIP4 חזקה סביב 160 kDa, כמו גם אלה של פקד מדגם מדומה וכמה חלבונים ידועים אחרים (איור 1). LC-MS ניתוח / MS זיהו שני פפטידים מורכבים ARIP4 ואת קו-פקטורים פפטיד הפוטנציאל בתוך שבריר של חרוזים FLAG (טבלה 1). p62 (Sequestosome1), גורם-שותף ARIP4 ידוע 11 זוהה בניתוח (טבלה 1), אשר מאשרת את היעילות של מערכת זו 11. גם זיהינו הרבה חלבונים בעבר דיווח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

transfection יעיל הוא חיוני כדי להשיג תוצאה מוצלחת עם פרוטוקול זה. בהתאם לכך, אנו ממליצים להשתמש ניתוח כתם המערבי כדי לקבוע את רמות החלבון FLAG-מתויג immunoprecipitated. שלב זה מאפשר למשתמשים לוודא חלבון העניין שלהם מבוטא ביתר כראוי, ויתר מזאת, כי ה- IP בוצע בהצלחה. רמות החלבון מתויג FLAG צריך גם להיבדק לפני הניתוח ספקטרומטריית מסה.

מדגם מדומה אמור לשמש כביקורת שלילית, כדי למנוע קבלת תוצאה חיובית כוזבת להיפלות בר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי קרן אסטלס לחקר הפרעות מטבוליות (HT), קרן המדע של טקדה (HT), ועל ידי האגודה היפנית לקידום מענקי מדע למדענים צעירים (B) ל-HT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11668019
קוקטייל מעכב פרוטאז (ללא EDTA) (100x)נקלאי טסק03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220
עמודות מיקרו ביו-ספיןBIO-RAD732-6204

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430(2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498(2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein PreparationNuclear CofactorLC MS MS AnalysisProtein InteractionTranscriptional RegulationImmunoprecipitationMass SpectrometryFlag Tagged ProteinsHEK 293 CellsSilver Staining

Related Articles