Cell הזרקת הסרטן Intracarotid לייצר מודלי עכבר של המוח גרור

סיכום

גרורה במוח הפך צורך רפואי דחוף כמו השכיחות שלה גדלה תוך אופציות טיפוליות נותרו פליאטיבי. יצירת מודלים של בעלי חיים הניסיונות של גרורות במוח באמצעות זריקת intracarotid העורקת של תאי סרטן מקל מחקרים מכניסטית של ביולוגית המחלה והערכת משטרי התערבות רומן.

תקציר

גרורות, התפשטות וצמיחה של תאים ממאירים באתרים משניים בתוך הגוף של המטופל, מהווה> 90% לתמותה מסרטן. לאחרונה, התקדמות מרשימה טיפולים חדשניים כבר האריכה דראמטי הישרדות ואיכות חיים משופרת עבור חולי סרטן רבים. למרבה הצער, שכיחות ישנת גרורתית המוח היא מהירה עולה, וכל הטיפולים הקיימים כיום הם פליאטיבי בלבד. לפיכך, במודלים של בעלי חיים ניסיוניים טובים יש צורך דחוף כדי להקל מעמיק מחקרים של ביולוגית המחלה ועל מנת להעריך את משטר טיפולי חדשני להערכה פרה-קלינית. עם זאת, סטנדרט assay גרור vivo באמצעות הזרקת זנב וריד של תאים סרטניים מייצר בעיקר גרור ריאות; חיות בדרך כלל נכנעים ניטלים גידול ריאות לפני כל תולדה משמעותית של גרורות במוח. הזרקת intracardiac של תאים סרטניים מייצרת גרורות לאתרי איברים מרובים כולל המוח; עם זאת, variability של הגידול מיוצר עם המודל הזה הוא גדול, ריסון השירות שלה בהערכת יעילות טיפולית. כדי ליצור מודלים של בעלי חיים אמינים ועקביים ללימוד גרור במוח, כאן אנו מתארים תהליך הייצור גרור במוח ניסיוני עכבר הבית (musculus Mus) באמצעות זריקת intracarotid של תאים סרטניים. גישה זו מאפשרת אחד כדי לייצר מספר רב של עכברי מוח גרורי נושאות עם מאפייני צמיחה ותמותה דומים, ובכך להקל על מאמצי מחקר לחקור מנגנונים ביולוגיים בסיסיים ועל מנת להעריך את הסוכנים טיפוליים חדשניים.

מבוא

גרורות של סרטן במערכת העצבים המרכזית (CNS) היא מחלה הרסנית, והוא יכול לכלול גם את המוח parenchyma או leptomeninges ( "גרורות במוח" מתייחס הן במאמר זה). זהו גידול ממאיר תוך גולגולתי השולט, עולים במספרם גליומות הראשוני על ידי> 10: 1 ^{1, 2.} סרטן הריאות, סרטן השד ומלנומה שלוש מחל נאופלסטיות הגדולות העליונות מייצר מקרים גבוהים של המוח גרור ^{3, 4.} בשנים האחרונות, התקדמות מרשימה טיפולים בסרטן רומן כבר האריכה דראמטי הישרדות ואיכות חיים משופרת עבור חולי סרטן רבים. עם זאת, על הישנות, השכיחות של גרורות במוח עולה בקצב מהיר. לדוגמא, trastuzumab הנוגדן אנטי HER2 (הרצפטין) הוכיח יעילות קלינית משמעותית בחולים עם HER2 + סרטן השד; עדיין מגמה מטרידה התפתחהבחולים אלה: עד 1/3 אלה שמחלתם המערכתית extracranial נהנה בתחילה מטיפול trastuzumab מאוחר יותר לפתח מוח גרור ^{5, 6, 7.} למרבה הצער, חולים עם גרורות במוח הם מגיבים כמעט כל טיפולים הקיימים כיום, בדרך כלל חווים הידרדרות טראומטית של איכות החיים, ואת ההישרדות לשנה אחת שלהם לאחר האבחון היא רק ~ 20% ^8. הטיפולים הקיימים נגד גרורות במוח (כולל סטרואידים, רדיותרפיה גולגולתי, כריתה כירורגית בחולים נבחרים) הם רק פליאטיבי, אין בהן כדי לרפאה ^9. לכן, גרורות במוח מתגלה האתגר הבא המרשים בעידן זה של טיפולים בסרטן הרומן. כדי להתמודד עם האתגר לא מסופק חולות פניו מדי יום במרפאת, אנו זקוקים בדחיפות כדי להבין טוב יותר את המנגנון הבסיסי של גרורות במוח ולהשתמש בידע הזה כדי לפתח טיפולים חדשניים.

קולוניזציה מוצלחת של המוח על ידי תאים סרטניים גרורתי דורשת ביצוע סדרה של פונקציות המתווכות על ידי האינטראקציה המורכבת של שחקנים ביולוגיים רבים, כגון המעקף של מחסום דם המוח (BBB) ​​ולברוח מהמוח של פנימי מנגנוני הגנה חיסוניים ^10, שאף אחד מהם הוא לחזור בדיוק לשעבר vivo או במערכת במבחנה. לפיכך, ראוי ונאמן במודלים vivo הם קריטיים עבור מחקרים של גרורות במוח. קונבנציונלי ב assay גרורה vivo מציג תאים סרטניים באמצעות הזרקה לוריד זנב, מוביל את רוב התאים שהשתכנו הריאה. נגעי המוח גרורתי לעתים רחוקות מיוצרים דגמים אלה לפני מותו חיה הנגרמת על ידי ניטל גידול בתוך הריאות ^11. הזרקה תוך-מוחית ישירה של תאים סרטניים מייצרת תולדת גידול עקבית של מערכת העצבים המרכזי, והוא בשימוש נרחב במחקרים של גליומות עיקרי. עם זאת, sהזרקת uch פוגעת BBB וגורמת פציעה טראומטית באתר הזרקה, הוא נקודות עיקריות של דאגה באשר הרלוונטי הפיזיולוגית של מודל זה. תוואי אחר הקדמה סרטן תאים בשימוש תכוף, הזרקת intracardiac, הוא קל לניהול אין לייצר גרורות ניסיוני אל מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, גרורה במקביל לאתרי איבר אחרים מאשר CNS מיוצרים תמיד ועלול לגרום לתמותה חיה ^11; לפיכך, הרמה הגבוהה של השתנות של מודל זה עושה את זה מתאים הערכה כמותית של מנגנונים ביולוגיים או סוכנים טיפוליים עם מספר מצומצם של בעלי חיים.

כאן אנו מתארים את ההליכים לייצר גרורות במוח ניסיון באמצעות ההזרקה של תאים סרטניים לתוך עורק התרדמה המשותף. השתמשנו בגישה זו כדי לנתח תרומות 'גנים בודדים אל מפל גרורתי של גרורות במוח להעריך יעילות של התערבות טיפוליתים ^{12, 13.} יתרונותיו העיקריים של גישה זו הם הרמה הגבוהה של שחזור מידה נמוכה של השתנות; החיסרון העיקרי הוא התחכום והמיומנות הדרושים לביצוע המיקרו-כירורגיה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה: כל במחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש (IACUC) של האוניברסיטה של ​​מרכז טקסס MD Anderson Cancer.

1. כן תאים סרטניים עבור הזרקה

1. זרעי התאים הסרטניים אחד או ימים לפני הזריקה. השתמש בחומרי הדפסה DMEM / F12 בתוספת 10% FBS, אלא מדיום המומחיות מותווה בספרות עבור קו תא מסוים.
2. ביום פעולה כירורגית, תאי קציר כאשר הם מגיעים 70 - 80% מפגש ידי השטיפה ראשונה עם סרום ללא מדיה פעם לפני trypsinization (0.25%) עבור 1 - 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להוסיף לתאים 10% FBS המכילים תקשורת DMEM / F12 כדי להרוות את טריפסין 0.25%.
3. צנטריפוגה התאים ב g 80 × 3 דקות. שטפו תאים ב סרום ללא מדיה פעמיים כדי להסיר בסרום שיורית, לספור את התאים עם hemocytometer מחדש להשעות ב תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) ל 1 - 5 × 10 ⁶ תאים / מ"ל, בהתאם לקו הסלולרי. שמור על הקרחעד בזמן ההזרקה.
   הערה: מד"א- MB-231 תאים סרטן השד תאי מלנומה K1735 שימשו במחקר זה, ושניהם שורות תאים שימשו ב 2 × 10 ⁶ תאים / ריכוז מ"ל. שמור את משך trypsinization קצר ככל האפשר טיפול יתר עלול להשפיע על התוצאות של מבחני גרורות.

2. כן עכברים עבור הזרקת תאים סרטנית

1. להרדים עכברים על ידי הזרקה (IP) הזרקה של קטמין / קוקטייל xylazine (קטמין 100 מ"ג / ק"ג, xylazine 10 מ"ג / ק"ג).
2. אשר הרדמה מלאה על ידי צובט את הרגליים חי ולבחון חוסר התגובה.
3. מניחים את העכבר על צלחת זכוכית (ששימשו ליציקת ג'לים חלבון), ובטוחה עם גומיות.
4. במידת הצורך, להסיר את השיער של הצוואר על ידי גילוח או מריחת כמות קטנה של המוצר הסרת שיער ומוחה את השיער מעל עם מגבת נייר. הערה: אם באמצעות עכברים בעירום, לדלג על שלב זה כמו אין להם שיער גוף.
5. נקו את עור הצוואר על ידי יישוםpovidone יוד ואלכוהול 70%.
6. העבר את העכבר על הבמה של מיקרוסקופ לנתח
7. עושים חתך בעור ~ 1 ס"מ בעזרת איזמל ניתוחים.
8. בבוטות לנתח את השריר עם מלקחי שיניים לחשוף את העורק הראשי מתחת.
9. הפרד את עורק התרדמה מן העצב התועה סמוך עם מלקחיים כירורגיים.
10. בעזרת מלקחיים כירורגיים, להפריד קצת צמר גפן מן כדור צמר גפן, ללחלח, ואופנה לתוך כדור צמר גפן קטן. מניחים כדור צמר גפן לחות-חיץ זה מתחת העורק הראשי של האתר המיועד של ההזרקה.
11. מניחים דיסטלי תפר הפרוקסימלי כדור צמר גפן ולעשות קשרים רופפים. להדק את הקשר הפרוקסימלי לחסום את זרימת הדם לתוך הזריקה.
12. המשך הזרקת תאים סרטניים אם עורק התרדמה על כדור צמר גפן מופיע בלחץ מלא בדם אדום טרי.

3. הזרקת תאים סרטניים לתוך העורק הראשי

1. וורטקס ולצייר 100 μl of תאים סרטניים לתוך המזרק.
2. תחת המיקרוסקופ לנתח, והכנס באיטיות 31 המחט G (עם שיפוע כלפי מעלה) לתוך לומן של עורק התרדמה יושב על גבי כדור צמר גפן.
3. לאט לאט להזריק את התאים מן המזרק לתוך העורק הראשי. זריקה מוצלחת ניתן לצפות במיקרוסקופ על ידי שינוי הצבע של כלי דם סמוכים שרירים כאשר תאים סרטניים שנאגרו נדחפים לתוך המחזור.
4. כאשר הזריקה של כל נפח תושלם, להרים את העורק הראשי דיסטלי בעדינות כדי למנוע regurgitation.
5. במהירות להדק את הקשר דיסטלי כדי להשלים את תהליך ההזרקה.
6. לאחר השלמת הזריקה, להדק את ליגטורה וקוצצים את תפר משי עודף עם מספריים מיקרו תחת מיקרוסקופ לנתח. מעבר אחורה השריר המופרד כדי לכסות את אתר הפצע. סגור את העור עם שתי סיכות.

4. שחזור כירורגי

1. הזז את החיה המופעל על כרית חימוםעבור התאוששות. זה עלול לקחת 30 - 60 דקות על חיות המחמד כדי להכרתו. בינתיים, לנהל עצירות (0.05 מ"ג / ק"ג) באמצעות זריקה תת עורית כמו שיכוך כאבים לאחר ניתוח. הערה: שיכוך כאבים צריך להינתן על פי IACUC המקומי פרוטוקול שאושר.
2. לאחר החיות להתעורר ולחדש ההתנהגות הנורמלית שלהם, להחזיר את העכברים למיקום הדיור שלהם. ספק עכברים עם מזון ג'ל שלאחר ניתוח כמה ימים. לשמור על תיק רפואי ולשמור אותו בחדר.

5. לא פולשני in vivo הדמיה

1. עבור תאים שכותרתו עם בונה כתב בלוציפראז, למדוד יעילות הזרקת תאים סרטניים באמצעות במערכת הדמיה vivo ^14.
   הערה: הדמיה לא מבוצעת ביום הזרקה כדי למנוע לחץ מופרז לבעלי חיים במחקר.

תוצאות

ישנן שתי נקודות שבן איכות ההזרקה ניתן להעריך. ההזדמנות הראשונה היא על ידי ההתבוננות של המפעיל של שינוי צבעי כלי דם במהלך הזרקה. דליפת זריקות גרועות ניתן להבחין בקלות תחת מיקרוסקופ לנתח. המיקום יציב ובטוח של הגוף העכבר (איור 1 א) ו העורק הראשי שלה (איור 1B) על כדור צמר גפן התומכים הם גורמים קריטיים להזרקה חלקה ומוצלחת לעורק התרדמה. הנקודה השנייה כדי להעריך את איכות הזריקה היא לאחר ניתוח הדמיה לא פולשנית. לעניין זה, ...

דיון

השלבים הקריטיים ביותר להזרקת עורקי תרדמה מוצלחת של תאים סרטניים הם: 1) הרדמה עמוקה של עכבר כהכנת פעולה כירורגית; 2) מיקום קבוע של עורק תרדמה על גבי תמיכת הכותנה; 3) קשירה הדוקה של עורק תרדמה לאחר זריקה מוצלחת.

הרדמה עמוקה של ~ 30 דקות בדרך כלל יש צורך עבור ביצועים כירורגית יציבים תחת מיקרוסקופ לנתח. אנו משתמשים קוקטייל קטמין / xylazine מוכן לשימוש מסחרי עבור הרדמה העכבר. כדי למנוע מינון יתר פוטנציאל, קוקטייל קטמי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת קטמין הידרוכלוריד/קסילזין הידרוכלוריד	Sigma-Aldrich	K113
סטריאומיקרוסקופ שגרתי Leica M50	Leica	M50	המיקרוסקופ הוא מודולרי וניתן להגדרה גבוהה כדי להתאים לדרישות חלל מסוימות.
סקיפל חד פעמי כירורגי	Integra Miltex	4-410	לביצוע חתכים בעור
מלקחיים לרקמות - 1 x 2 שיניים	Fine Science Tools	11021-12	לניתוח בוטה של ריריות
Dumont #5 - מלקחיים בגימור מראה	Fine Science Tools	11252-23	להפרדה והכנה של עורק הצוואר להזרקה
מספריים קפיציים	Fine Science Tools	15025-10	לחיתוך תפרים
ערכת קליפ EZ	Stoelting	59020	לקלור פצע
מזרק אינסולין BD	בקטון דיקינסון	328438	להזרקת תאים
ספקטרום IVIS In Vivo מערכת הדמיה	PerkinElmer	124262