הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55113

⸱

16 בפברואר 2017

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mississippi State University

במאמר זה

סיכום

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

תקציר

יש צורך במעט מאוד מסלולי העברת אותות מתא לתא במהלך ההתפתחות העוברית כדי ליצור את המגוון הגדול של סוגי תאים ורקמות בצורת הגוף הבוגר. עם זאת, בכל שנה מתגלים מרכיבים נוספים של מסלולי איתות בודדים, ומחקרים מצביעים על כך שבהתאם להקשר יש דיבור צולב משמעותי בין רוב המסלולים הללו. מורכבות זו הופכת את חקר איתות תא לתא בכל מערכת מודל התפתחותי in vivo למשימה קשה. בנוסף, נדרשים ניתוחים פונקציונליים יעילים כדי לאפיין מולקולות הקשורות למסלולי איתות שזוהו ממערכי הנתונים הגדולים שנוצרו על ידי מסכים דיפרנציאליים מהדור הבא. כאן, אנו מדגימים שיטה פשוטה לזיהוי יעיל של מרכיבים של מסלולי העברת אותות השולטים בגורל התא ומפרט הציר בעוברי קיפודי ים. הפשטות הגנומית והמורפולוגית של עוברים הדומים לאלו של קיפודי הים הופכת אותם למודלים התפתחותיים רבי עוצמה להבנת אינטראקציות איתות מורכבות. המתודולוגיה המתוארת כאן יכולה לשמש כתבנית לזיהוי מולקולות העברת אותות חדשות במסלולים בודדים כמו גם האינטראקציות בין המולקולות במסלולים השונים באורגניזמים רבים אחרים.

מבוא

ג'ין רשתות רגולטוריות (GRNs) ואת מסלולי העברת אותות להקים הביטוי במרחב ובזמן של גנים במהלך ההתפתחות העוברית המשמשים לבניית תוכנית גוף החיה הבוגרת. תא אל תא מסלולי העברת אותות הם מרכיבים חיוניים של רשתות רגולטוריות אלו, מתן הכלי שבאמצעותו תאים מתקשרים. אינטראקציות הסלולר אלה להקים ולשפר את הביטוי של גני רגולטוריים והבחינו ובקרב בשטחים השונים במהלך embryogenesis 1, 2. אינטראקציות בין מאפננים תאיים מופרשים (הליגנדים, אנטגוניסטים), קולטנים, ו-קולטנים שיתוף לשלוט על פעילות מסלולי העברת אותות. מבחר של מולקולות תאיות transduces תשומות אלה וכתוצאה מכך ביטוי גנים שהשתנה, חלוקה, ו / או צורה של תא. בעוד רבים של מולקולות המפתח בשימוש ברמות התאיות ו תאי על המסלולים העיקריים הםידוע, הוא ידע שלם נובע במידה רבה למורכבות של מסלולי איתות בודדים. בנוסף, מסלולי איתות שונים לעתים קרובות אינטראקציה זה עם זה חיובי או שלילי על התאים, תאיים, ורמות תעתיק 3, 4, 5, 6. חשוב לציין, מרכיבי הליבה של מסלולי העברת אותות הם שמורים ביותר בכל המינים מטזואניים, ו, להפליא, רוב מסלולי איתות הגדולים לעתים קרובות לבצע פונקציות התפתחותי דומות במינים רבים כאשר משווים אורגניזמים טווח מערכת קשור קשר הדוק בפרט 7, 8, 9, 10, 11.

המחקר של איתות במהלך ההתפתחות הוא משימה מרתיעה בכל אורגניזם, וישכמה אתגרים משמעותיים ללימוד מסלולי איתות במודלים השניוניים הפה ביותר (בעלי חוליות, המיתרנים חסרי חוליות, hemichordates, ו echinoderms): 1) בקרב בעלי חוליות יש מספר גדול של ליגנד האפשרי ואינטראקציות קולטן / אפנן-שיתוף, מולקולות התמרה תאיות, כמו גם אינטראקציות פוטנציאליות בין נתיבים שונים מאותתים בשל המורכבות של הגנום 12, 13, 14; 2) המורפולוגיה המורכבת ותנועות המוךפו"גנטי שהולכות חוליות לעתים קרובות לעשות את זה יותר קשה לפרש אינטראקציות תפקודיות ובקרב מסלולי העברת אותות; 3) ניתוח ברוב מיני מודל שאינו קווצי עור חסר חוליות שניוניות פה מוגבל על ידי חלון קצר gravidity למעט כמה מיני מיתרני זנב 15, 16.

העובר ים קיפוד יש כמה מן המגבלות הנ"ל ומציע איכויות ייחודיות רבות לביצוע ניתוח מפורט של מסלולי העברת אותות in vivo. אלה כוללים את הבאים: 1) הפשטות היחסית של הגנום קיפוד הים מפחית באופן משמעותי את המספר ליגנד אפשרי, קולטן / שיתוף הקולטן מולקולת התמרה תאית קשרי גומלין 17; 2) GRNs שליטה במפרט הדפוסים של השכבות הניבטות וגרזנים עובריים עיקריים מבוססות היטב בעוברי קיפוד ים, בסיוע להבנת ההקשר רגולטוריות של התא / טריטורית קבלת האותות 18, 19; 3) מסלולי העברת אותות רבים ניתן ללמוד בין שלבי מחשוף gastrula מוקדם כאשר עוברים מורכבת של האפיתל שכבתית יחידה מורפולוגיה אשר קל יותר לנתח; 4) המולקולות לערבד ב מסלולי איתות של קיפודי הים הם מניפולציה בקלות; 5) קיפודי ים רבים המעוברים במשך 10 עד 11 חודשים בשנה (למשל Strongylocentrotus purpuratus ו Lytechinus variegatus).

כאן, אנו מציגים שיטה בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות המציינים וטריטוריות דפוס בעוברי קיפוד ים כדי להמחיש את היתרונות כי מספר מערכות מודל חסרות חוליות להציע בחקר מנגנונים מולקולריים מורכבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. עיצוב אסטרטגית Morpholino תפוקה גבוהה

  1. לזהות גן (ים) של עניין (גישת הגן המועמד למשל, ניתוח הרגולציה ציס, RNA-seq ו / או מסכי ההפרש proteomic).
  2. השתמש גנומית, transcriptomic, ונתוני ביטוי גנים באתרים מתעדכנים בתדירות גבוהה (למשל SpBase http://www.echinobase.org 20 וס purpuratus הגנום http חיפוש: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) כדי לקבוע שפרופיל הביטוי spatiotemporal חופף עם מנגנון התפתחות מדובר. אם אין נתוני ביטוי זמינים, ולאחר מכן ליצור פריימרים qPCR ו / או antisense ב חללית באתרו להעריך את דפוס ביטוי גנים.
  3. לאחר קביעת דפוס ביטוי במרחב ובזמן, להשיג את רצף הדנ"א מאתרי האינטרנט הגנומי.
    1. להפקה oligonucleotides morpholino חסימה-תרגום, להשיג רצף of 5 'באזור un-מתורגם (5' UTR) ישירות במעלה הזרם מן קודון ייזום מהתג רצף הביע (EST) מאגרי מידע נגיש SpBase או ס purpuratus הגנום אתרי חיפוש. אם מידע זה אינו זמין עבור הגן של עניין, ולאחר מכן לבצע 5 'RACE.
    2. כדי לעצב morpholino חסימת-אחוי, לחפש את הרצף הגנומי כולל אקסונים אינטרונים שימוש באפשרות פיגום blastn בכלי חיפוש SpBase או ס purpuratus הגנום.
  4. השתמש באתר בעיצוב oligonucleotide http://oligodesign.gene-tools.com כדי לעצב את רצף morpholino זוג 25 בסיס הרצוי.
    1. במשך morpholino חסימת-translational, השתמש רצף mRNA מ 5 'ל 3' כמקור רצף היעד translational. כלול את רצף UTR '5 (כ -70 נוקלאוטידים upstream של אתר תחילת השעתוק) בתוספת 25 בסיסים של קידוד באזור (במורד הזרם של האתר התחל) עם תחילת קודון wi ניכרתבסוגריים ה (ATG).
    2. במשך morpholino חסימה-אחוי, בחר אינטרון-אקסון או רצף גבול-אינטרון אקסון וכולל 50 בסיסים (25 בסיסים של רצף אקסון ו -25 בסיסים של רצף אינטרון) סביב אזורי הגבול. סרוק את הגנום עם רצף morpholino כדי לוודא את הרצף ייחודי.

2. Microinjection של Oligonucleotides Morpholino

  1. הכן 3 פתרונות מניות מ"מ של oligonucleotides morpholino על ידי הוספת 100 μL מים nuclease חינם לתוך בקבוקון morpholino 300 nmol.
    הערה: אל תשתמש במים DEPC שטופלו מחדש ההשעיה בגלל diethyl pyrocarbonate יכול להזיק morpholino.
  2. עבור ספין הכינון מחדש הראשון במורד בקבוקון המכיל את פתרון oligonucleotide המניות למשך 30 שניות במלוא המהירות (14,000 - 16,000 XG), בקצרה מערבולת, חום 65 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 10 דקות, מערבולת בקצרה, ולשמור את המניה morpholino ב חדר טמפרטורה לפחות h 1. פתרון המניות Morpholino s מאוחסן מ -20 ° C עד 4+ מעלות צלזיוס.
  3. כן פתרון הזרקה המכיל oligonucleotides morpholino בריכוז הרצוי. פתרון זה מכיל בדרך כלל 20% גליצרול או 125 מ"מ KCl כנשא ו -15% FITC-dextran (והעמסת isothiocyanate dextran 10,000 MW 2.5 מ"ג / μL פתרון המניות). FITC-dextran ו conjugates dextran ניאון אחרים משמשים באופן שגרתי כדי לזהות עוברים מוזרק על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. פתרונות הזרקת חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
  4. מחמם את פתרון morpholino ב 65 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום או אמבט מים במשך לפחות 2 - 5 דקות.
  5. בקצרה ספין פתרון morpholino למשך 30 שניות במלוא המהירות (14,000 - 16,000 XG), מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במלוא המהירות (14,000 - 16,000 XG) במשך 10 דקות לפחות.
  6. טען את מחטי הזרקה עם פתרון morpholino. לקבלת פרוטוקול microinjection מפורט ראה Stepicheva ושיר 2014 21 ו תרועות Ettensohn 2004"> 22.

קיבוע 3. בפרוטוקול באתרו ב 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) ב ס purpuratus עוברים

הערה: פרוטוקול זה שונה מן ארנס-Mena et al. 2000 23 ו Sethi et al. 2014 24.

  1. קיבוע
    1. להוסיף מספר טיפות של מקבע (ראה להלן) כדי בארות המכילות עובר, לערבב בעדינות על ידי pipetting, ולאפשר להם להתיישב. הסר את הפתרון מקבע, ולאחר מכן לערבב עובר עם שתי שטיפות נוספות 180 μL של מקבע.
      הערה: חשוב לערבב את העוברים ביסודיות במהלך הכביסות של עד pipetting עדין ומטה מספר פעמים. אי ביצוע הוראה זו יכולה להוריד את יחס האות לרעש.
    2. השאר את העוברים לתקן בכביסה מקבעת השנייה למשך 50 דקות עד 1 שעות בטמפרטורת חדר (RT) ב paraformaldehyde הכיתה במיקרוסקופ אלקטרוני 4% בהיקף של 10 מ"מ מגבים 7.0 pH, 0.1% Tween-20, ומלאכותי seawater (ASW). הפוך את הפתרון הזה טרי בכל פעם עבור התוצאות הטובות ביותר. בנוסף, עבור עוברי הקלות והמעשיות המתוקנות ב- 96-גם הצלחות.
      1. במשך 20 שימוש מקבע 5 מ"ל paraformaldehyde מ"ל 16%, 15 מ"ל ASW, 200 μL 1 M מגבים pH 7.0, ו -20 μL Tween-20.
    3. לשטוף 5 פעמים ב RT עם 180 μL של מגבים לשטוף חיץ המורכב pH 0.1 M מגבים 7.0, 0.5 M NaCl ו 0.1% Tween-20 במשך 5 דקות או עד העוברים לפחות טיפה לתחתית הבאר. שוב, חשוב לערבב את העוברים ביסודיות לתוך המאגר לשטוף ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה מספר פעמים. חיץ מגבים לשטוף יכול לשמש 2 ימים אם לאחסן 4 מעלות צלזיוס.
      1. במשך 40 מ"ל מגבים לשטוף חיץ שימוש 4 מ"ל 1 M מגבים pH 7.0, 4 מ"ל 5 M NaCl, 32 מ"ל DH 2 O, ו -40 μL Tween-20.
      2. עוברים קבועים יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלסיוס למשך 2 ימים.
        הערה: אם אחסון עוברים קבוע יותר, ולאחר מכן להוסיף 0.2% אזיד הנתרן מגבים חיץ לשטוף כדי למנוע התפתחות חיידקים.
  2. טרום הכלאה
    1. לשאוב מגבים חיץ לשטוף ולהוסיף 180 μL של 2: יחס 1 של מגבים חיץ לשטוף למאגר הכלאה, לערבב עוברים לתוך התמיסה על ידי מספר פעמים pipetting עדין, דגירה במשך 20 דקות לפחות ב RT. הכלאה חיץ מורכב 70% לפוראמיד, 0.1 M מגבים pH 7.0, 0.5 M NaCl, 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA ו -0.1% Tween-20.
      1. במשך 40 מ"ל חיץ הכלאה שימוש 4 מ"ל 1 M מגבים pH 7.0, 4 מ"ל 5 M NaCl, 4 מ"ל DH 2 O, 0.04 גרם BSA, ו -40 μL Tween-20. מערבבים היטב על ידי vortexing, להוסיף 28 לפוראמיד מ"ל, מערבולת שוב.
    2. הסר את 2: יחס 1 של המגבים לשטוף מאגרי הכלאה ולהוסיף 180 μL של יחס של 1: 2 של מגבי חיץ לשטוף למאגר הכלאה, לערבב עובר לתוך התמיסה, דגירה במשך 20 דקות לפחות ב RT.
    3. לפני הכלאת הבדיקה לערבב עוברת בעדינות לתוך 100 - 150 μL של חיץ הכלאה. דגירה עוברים על 50 מעלות צלזיוס לפחות 1ח.
      הערה: הקבוצה מתחילה עובר לילה מקובל. לפני דוגרים, לאטום את הבארות עם גיליון דבק כדי למנוע אידוי.
  3. הַכלָאָה
    1. בתוך צינור נפרד להוסיף 0.1 - 0.3 ng / μL של חללית ו -500 מיקרוגרם / מיליליטר השמרים tRNA למאגר הכלאה, ואז מערבולת בעדינות כדי ליצור פתרון חללי. tRNA שמרים מתווסף פתרון הבדיקה כדי להקטין הלא ספציפי מחייב של החללית אנטי תחושה. מחממים את הפתרון הזה ל -50 מעלות צלזיוס, חיץ הכלאה לשאוב.
    2. מערבב בעוברים בשלב טרום הכלאה לתוך 100 μL של פתרון הבדיקה, חותם עם גיליון דבק, להכליא על 50 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 7 ימים, תלוי הבדיקה (חללית foxq2 ניתן וטופחה במשך 2 ימים).
      הערה: פעמים דגירה תשתנה בהתאם את החללית. גנים מסוימים לידי ביטוי ברמות נמוכות דורשים עד דגירת 7 ימים. ניתן להציב 96-גם הצלחות בקופסת לחות כביטוח נגד אידוי אם adhesגיליון ive נכשל לאטום כמו שצריך.
    3. לשטוף 5 פעמים ב 50 מעלות צלזיוס עם 180 μL של מגבים טריים לשטוף חיץ עבור סכום כולל של 3 שעות. לאחר מכן, לשטוף 3 פעמים (15 דקות) עם 180 μL של מגבים לשטוף חיץ ב RT. זכור לערבב עוברים לתוך לשטוף חיץ בכל פעם על ידי pipetting מספר פעמים בעדינות.
  4. דגירת נוגדן
    1. לשאוב מגבי חיץ לשטוף ומערבבים עוברים 180 μL של חיץ חסימת מורכב סרום כבשים 10% רגילים ו -5 מ"ג / המ"ל BSA ב מגבי חיץ לשטוף דגירה במשך 45 דקות לפחות ב RT או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. הסר חסימת חיץ ואז לערבב העוברים לתוך חסימת מאגר המכיל דילול 1: 1,500 של נוגדן אנטי digoxigenin phosphatase מצומדות אלקליין מדולל חסימת חיץ. דגירת הלילה ב RT צלחת אטומה כדי למנוע אידוי. הערה: אל תשאיר נוגדן על יותר הלילה.
    3. לשטוף עוברים 6 פעמים (5 דקות או עד העוברים טיפה) ב מגבים לשטוף חיץ ב RT. יכול עוברלאחסן לילה בשעה 4 ° C..
  5. בפיתוח באתרו
    1. שטפו עוברי 3 פעמים (10 דקות) ב RT עם חיץ pH 9.5 טריים המורכב 0.1 M טריס pH 9.5, 100 מ"מ NaCl, 50 2 מ"מ MgCl, 1 מ"מ Levamisole, ו -0.1% Tween-20.
      1. במשך 20 מ"ל pH 9.5 חיץ שימוש 2 מ"ל 1 M טריס pH 9.5, 400 μL 5M NaCl, 1 מ"ל 1 M MgCl 2, 20 μL Tween-20, 16.6 מ"ל DH 2 O, ו 0.0048 Levamisole גרם.
    2. דגירה עוברים על 37 מעלות צלזיוס במאגר מכתים מוגן מפני אור. חיץ מכתים מורכב מ 10% דימתיל Formamide, 4.5 μL / מ"ל ​​4-Nitro כלוריד כחול tetrazolium (NBT), ו -3.5 μL / מ"ל ​​5-Bromo-4-כלורו-3-indolyl-פוספט (BCIP) במאגר pH 9.5 טריות .
      1. עבור 1 מ"ל של חיץ מכתים להשתמש 100 μL דימתיל Formamide, 4.5 μL NBT, ו -3.5 μL BCIP.
    3. עצור את תגובת phosphatase אלקליין על ידי שטיפת 3 עד 5 פעמים ב מגבה לשטוף חיץ. ה- Wi התגובהה החללית foxq2 בדרך כלל לוקח 30 דקות עד 1 שעה. בדיקות מסוימות עשויות צריכות דגירת הלילה משני RT או 4 מעלות צלזיוס.
    4. מערבבים עוברים לתוך תמיסה של לשטוף 70% מגבים ו -30% גליצרול. גליצרול מספק מקדם השבירה צורך במיקרוסקופ. עוברים ניתן לאחסן את הפתרון הזה במשך כמה שבועות. חותם את הצלחות עם פרפין פלסטיק כדי למנוע אידוי.
  6. הכנת שקופיות ולכידת תמונה
    1. כן שקופית ידי סידור שלוש רצועות קטנות של דבק דו צדדי למשולש עם פערים קטנים בין רצועות לשקופית.
    2. מעבירים את העוברים בכביסה 70% מגבים פתרון גליצרול 30% למרכז המשולש ומכסים coverslip.
    3. חותם את coverslip ידי החלת שכבת לק מסביב לקצוות של coverslip.
    4. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור מתחם עם מטרת 20X ומצלמה מצורפת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעובר הים קיפוד הראינו כי 3 איתות סניפים Wnt שונים (Wnt / β-קטנין, Wnt / JNK, ו Wnt / PKC) 4, 25 פועלים יחד כדי ליצור רשת איתות Wnt השולט הקדמי-אחורי דפוסים (AP). אחת התוצאות החשובות ביותר של אירועי איתות אלה היא כי קדמי neuroectoderm רחב הביע הראשונית (Ane) GRN הופכת מוגבלת לטריטוריה קטנה סביב הקוטב הקדמי עד תחילת gastrulation (24 hpf ב ס purpuratus). תוצאות אלו מצביעות כי Wnt / β...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המתודולוגיה המוצגת כאן היא דוגמא שממחישה את הכח של שימוש בעוברים עם מורכבות גנומית וצורניות פחות חוליות להבין את מסלולי העברת איתות GRNs המסדירים מנגנוני התפתחותיים יסוד .. מעבדות רבות משתמשות מבחנים דומים במהלך התפתחות קיפוד הים מוקדם לנתח את מסלולי איתות מעורבים באירועי מפרט גורל תאים אחרים (למשל Notch, קיפוד, β TGF-, ואיתות FGF) 27, 28, 29, 30...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לד"ר רוברט אנגרר על הקריאה והעריכה הקפדנית של כתב היד. NIH R15HD088272-01, כמו גם המשרד למחקר ופיתוח, והמחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת מיסיסיפי סטייט סיפקו תמיכה לפרויקט זה ל-RCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מורפולינו חוסם תרגומי ו/או מורפולינו חוסם חיבורGene Tools LLCמותאם אישיתמידע נוסף בכתובת www.gene-tools.com
GlycerolInvitrogen15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)Invitrogen, Life TechnologiesD1821Make 25 mg/mL תמיסת
מלאי Paraformaldehyde 16% תמיסה EM GradeElectron מדעי המיקרוסקופיה15710
MOPSSigma AldrichM1254-250G
Tween-20Sigma Aldrich23336-0010
FormamideSigma Aldrich47671-1L-F
שמרים tRNAInvitrogen15401-029
סרום עיזים רגילSigma AldrichG9023-10mL
נוגדן אנטי-דיגוקסיגנין מצומד פוספטאז אלקלייןRoche11 093 274 910
טטרמיזול הידרוכלוריד (לבמיסול)סיגמא אולדריץ'L9756-5G
Tris Base UltraPureResearch Products Internationall Corp56-40-6
נתרן כלוריפישר סיינטיפיקBP358-10
מגנזיום כלורידסיגמא אולדריץ'7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphateRoche11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)Roche11 383 213 001
דימתיל פורממידסיגמא אולדריץ'D4551-500 מ"ל
אשלגן כלוריסיגמא אולדריץ'P9541-5KG
נתרן ביקרבונטסיגמא אולדריץ'S5761-500G
מגנזיום גופרתיסיגמא אולדריץ'M7506-2KG
סידן כלורידסיגמא אולדריץ'C1016-500G

מקורות

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467(2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434(2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259(2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841(2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343(1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001(2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.