אנו מציגים שיטה בידוד והתרבות של צינור העכבר Wolffian (WD). אנחנו גם מדגימים נוהל מפורט immunostaining הר שלם של WDS תרבותי / טרי מבודד עם נוגדנים מתויג fluorescently. יחד, טכניקות אלו מאפשרים את חקר התפתחות WD, התפתלות, והבחנה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות
במאמר זה
סיכום
תקציר
morphogenesis תובל היא דרישה בסיסית לפיתוח רוב האיברים יונקים, כולל מערכת הרבייה הגברית. יותרת האשך, חלק בלתי נפרד של מערכת הרבייה של הגבר, הוא אחראי על אחסון הזרע, התבגרות, ותחבורה. יותרת האשך המבוגרת הוא צינור מפותל מאוד שמתפתח מבשר עוברי פשוט ישר המכונה צינור Wolffian (WD). התפתלות תקין של יותרת האשך חיונית פוריות הגבר, כמו זרע ב testis אינם מסוגלים להפרות ביצית. עם זאת, המנגנון האחראי לפיתוח epididymal ואת התפתלות עדיין לא ברור, בין השאר בגלל חוסר שיטות תרבות הדמיה כולו איברים. במחקר זה, אנו מתארים מערכת תרבות במבחנה פרוטוקול immunofluorescence הר שלם כדי להמחיש את התהליך טוב יותר של התפתלות WD ופיתוח, אשר עשוי להיות מיושם גם ללמוד איברים צינורי אחרים.
מבוא
מערכת הרבייה של הגבר בעיקר מורכבת testis, האתר לפיתוח ניבט תא והבחנה, ומערכת ductal מורכבת דרושה ההתבגרות, תחבורה, והאחסון של זרע. יותרת האשך הוא איבר צינורי שמחבר testis עם vas הזרע ומעורב בעיקר בפיתוח שלאחר האשכים והתבגרות של תאי נבט 1. העכבר מבוגר מפותל מאוד יותרת האשך מפתחת משפופרת מבשר פשוט ישר, צינור Wolffian (WD) 1. המבנה מורכב מפותל של יותרת האשך חיונית זרע לרכוש את היכולת להפרות בתאי הנבט נקבה 2. איך איבר כזה חיוני פוריות הגבר מתפתח ומקבל לכושר אינה מובנת היטב. מסלולי איתות שונים הוכחו להיות מעורב בפיתוח של WD כגון מסלול איתות Wnt 3,4 ואת אנדרוגן במסלול איתות 5. העבודה האחרונה שלנו הקימה את הדרישה של Balanced Wnt איתות עבור התפתלות WD במהלך ההתפתחות טרום לידתי 4. עם זאת, מחקרים נוספים נדרשים כדי להבין את המנגנונים המעורבים התפתלות epididymal לאחר הלידה, התמיינות תאים, ואת התא אל התא תקשורת בתוך האפיתל epididymal ועם תאים ביניים.
גנטי במודלים של עכברים מהונדסים הוכחו להיות כלי רב עצמה לזיהוי / אימות של מנגנונים מולקולריים שבבסיס התפתחות ומחלות של מערכות איברים שונות 6. למרות השימוש הנרחב שלה, קיימות מגבלות משמעותיות של מודלי עכבר מהונדסים גנטי, כוללים את הפנוטיפ הצפויה של מוטנטים עכבר ממוקדים לגבי תפקוד גן משוער, ולא פנוטיפ מוטנטים null בדגמים מסוימים, השפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים, עבודה אינטנסיבית זמן רב בתהליך של פיתוח מודלי עכבר. לכן, הפרשנות של המשמעות של הממצאים רק גנטי מודיםמודלי עכבר fied אינם תמיד ברור 6. ניתן להתגבר על מגבלות אלה באמצעות מערכת תרבות איבר במבחנה אשר נותנת לנו את הגמישות כדי לתפעל מסלולי איתות מרובים בזמן אמת בתנאי תרבות מבוקרת. מערכת תרבות איברים היא סייעה בהבנת הפיזיולוגיה והפתולוגיה של איברים שלמים 7. יתר על כן, הדמיה של כל איברים מוכתמים נוגדנים שכותרתו fluorophore מאפשרת לנו לדמיין את הסמנים של עניין בהקשר תלת ממדי, כפי שהיא קיימת in vivo, ובכך לספק הבנה טובה יותר של הצורה של האיבר, מבנה ותפקוד 8.
הנה, יש לנו תארנו את השיטות לבידוד תרמי של רכסי אשכים עובריים בעכבר, במבחנת תרבות הדמית immunofluorescence הר שלמה של WDS, שניתן ליישם כדי לענות על מגוון של שאלות הנוגעות morphogenesis איברים צינורי כגון WDS. בפרוטוקול זה, אנועכבר מבודד עובריים רכסים ואברי המין מ -15.5 ימים שלאחר coitum (DPC) סכרים בהריון מתורבת אותם במשך 3 ד ואחריו immunostaining עבור סמן תא אפיתל (cytokeratin 8, CK8), סמן התפשטות תאים (phospho-היסטון 3, PH3) ופעיל βcatenin.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
טיפול בבעלי חיים הפרוצדורות בוצעו בהתאם להנחיות של טיפול בבעלי חיים ועדת האתיקה של אוניברסיטת ניוקאסל אישר חוק בעלי חיים למחקר ניו סאות 'ויילס, ניו סאות' ויילס החיה מחקר תקנה, ואת קוד האוסטרלי של טיפול השימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות. כל נוהל שיושם על עכברים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים ואתיקה של אוניברסיטת ניוקאסל.
1. זמן הזדווגות
- זוג 6 - 8 שבועות זכר ישן עכברות רק לפני סוף מחזור אור יום.
- בדוק את הנקבות עבור הנוכחות של תקעי נרתיק הבוקר מוקדם (או לפני 8.00 בבוקר), כל יום. יום של תקע נחשב 0.5 DPC.
- מעבירים את הנקבה עם תקע הנרתיק לתוך כלוב חדש (בלי זכר) ואת התווית מועד תקע.
2. בידוד של רכסי אשכי עכבר עובריים
- לבודד עכבר embryonic רכסים האשכים מ -15.5 לנשים בהריון DPC כמתואר 9, עם כמה שינויים כמפורט להלן.
- לבצע דיסקציה לפני הצהריים כזמן נשים בהריון נחשבות להיכנס למחרת של ההריון על ידי אחר הצהריים.
- להקריב 15.5 לנשים בהריון DPC באמצעות נקע בצוואר רחם (או על פי הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית בעלי החיים).
- שמור את העכבר על גבו על נייר סופג ולרסס את הצד הגחוני של הבטן עם אתנול 70%.
- הרם את העור בבטן התחתונה (צד הגחון) עם מלקחיים ולעשות חתך לרוחב באמצעות מספריים כירורגיות, המשתרעת הפתיחה ואברי המין עד הסוף כדי כלוב הצלעות. משוך את העור לכיוון הראש של החיה על מנת לחשוף את הבטן.
- חותכים את שרירי הבטן עם מספריים כירורגיות לחשוף חלל הצפק. תפוס את הרחם הרה להולדת עם מלקחיים מעל צוואר הרחם ולעשות חתך. עכשיו להרים את הרחם על ידי לחיצה על to בשלפוחית השתן לחתוך את רצועת הרחם רחב ואחריו חתכים בצמתים uterotubal לנתק הרחם מן מצורף הצפק.
- מעבירים את הרחם לתוך צינור 50 מ"ל המכיל קר כקרח HBSS (תמיסת מלח מאוזן של האנק). שטוף את הרחם הרה להולדת בעדינות עם HBSS קר כקרח כדי להסיר את הדם העודף.
- שמור הרחם בצלחת פטרי המכילות HBSS קר כקרח ולשמור על הקרח. חותכים את דופן הרחם ולהוציא את העוברים. שמור את העוברים בצלחת פטרי טריה עם HBSS על קרח.
- קח נייר טישו סטרילי נקי והנחת אותו על צלחת פטרי חדשה. תרסיס אתנול 70% על נייר טישו. שמור העובר על נייר זה בצד לרוחב ופצע אותו מן הבטן התחתונה באמצעות סכין סטרילית בכיוון כפי שמוצג על ידי הקו המקווקו באיור 1.
- תקן את העובר על בסיס ספוג סטרילי ידי מצמיד את עמוד השדרה.
- מניחים אותו תחת סטראו לנתח לחתוך בזהירות לאורך קו האמצע הגחון. הסר את הכבד והמעיים. מערכת המין ודרכי שתן עכבר (כליות, שופכן, testis, WD, ואת זרע הזרע) כעת אמורה להיות גלויה.
- חותך את testis ואת WD, ולשמור בצלחת פטרי טריה עם HBSS, על קרח. כדי להוציא את WD ו testis, לחתוך את זרע הזרע הקרוב זיקתו השופכה לחתוך את הקובץ המצורף של חלק תחתון של WD מן gubernaculum.
- פינת האשכים ו- WDS מן העוברים מאותה הקבוצה (עשוי להשתנות לפי התכנית הניסיונית).
3. תרבות של רכסי האשכים עובריים (איור 2)
- כן בינוני עבור culturing רכסי האשכים העובריים ידי השלמת DMEM / F12 עם 10% FBS (בסרום שור עוברי), 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו 1% L- גלוטמין. מומלץ לחמם את התקשורת כדי 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- הוספת 300 μL של התקשורת לכל גם צלחת תרבית תאים 24 גם.
- קח צלחת פטרי טריה לשים טיפה קטנה של HBSS סטרילי עליו. שים קרום לחרוט פוליקרבונט המסלול (0.881; מ ') על ירידה זו של HBSS עם המשטח הנוצץ שלה מול HBSS.
- מלקחיים נקיים באמצעות לשים שני WDS ואשכים על הממברנה (על המשטח המחוספס שלה, פונה כלפי מעלה) ולהסיר את הסכום המקסימאלי של HBSS שימוש במגבונים סטריליים / נייר סופג. אל תיגע רקמות עם נייר סופג; אחרת, זה יהיה נזק לרקמות.
- ודא כי לא WDS ולא בלוטות המין הם נוגעים זה בזה. אחרת, הם יוכלו להישאר ביחד במהלך הדגירה לאחר מכן.
- מעביר את הממברנה עם הרקמות גם צלחת 24-היטב המכילה בינוני תרבות 300 μL ותרבות אותם ממשק אוויר-בינוני. מדיום תרבות מדי על תוצאות ממברנות ב גידול פיברוזיס של WDS.
- דגירה את הצלחת על 37 ° C חממה, בנוכחות של 5% CO 2.
- שנה את מדיום התרבות מדי יום. כדי לשנות את המדיום עם פיפטה, להסיר את המדיום מן הבאר הראשונה ולאחר מכן להוסיף 300 μL של המדיום החדש prewarmed.
הערה:לקבלה אשר בדק את השפעתו של מסלולי איתות שונים על morphogenesis WD, activators הכימי ו / או מעכבים בריכוזים נדרשו ניתן להוסיף עד בינוני התרבות. - תרבות הרקמות עבור 3 ד. בתוך 3 ד, uncoiled WDS שנאסף מעובר 15.5 DPC להפוך צינורות מפותלים מאוד (איור 3 ב). תוספת של מעכב Wnt, IWR1, התוצאה היא עיכוב של WD התפתלות (איור 3 ג).
- לקציר רקמות אלה לקחת צלחת פטרי עם קרים כקרח PBS. מעביר את הממברנה עם בלוטת מין תרבותי WD לתוך צלחת פטרי. הקרום יצוף על PBS. לחצו על הממברנה ולהשקיע אותו PBS ולהוציא את בלוטת המין ו WD.
- תקן את הרקמות עם paraformaldehyde 4% (PFA) O / N ב 4 ° C או עבור 1 ש 'ב RT. במידת הצורך, לקחת תמונות שדה בהירות של WDS לפני הקיבעון.
4. Immunofluorescence הר שלם
- שטפו את הרקמות הקבועות 3x עם PBS-T (PBS + 1%טריטון X-100) עם נדנדה איטית, 10 דקות כל אחד, ב RT.
- מייבש את הרקמות בסדרת אתנול מדורגת (25%, 50%, 75% ו -100%), 10 דקות כל אחד, ב 4 ° C, עם נדנדה איטי (~ 30 סל"ד). בשלב זה, הרקמות ניתן לאחסן 4 ° C באתנול 75%.
- כדי לשנות את אתנול, לשמור על הרקמות ללא הפרעה במשך 2 דקות ולתת הרקמות להתיישב. להוציא supernatant ככל האפשר ולאחר מכן להוסיף את הריכוז הגבוה הבא של אתנול. כדי למנוע נזק לרקמות, קצה פיפטה צריך תיגע רקמות בכל שלב.
- בעקבות התייבשות, רעננותם הרקמות בסדרת אתנול מדורגת (100%, 75%, 50% ו -25%), 10 דקות כל אחד, ב 4 ° C, עם נדנדה איטית.
- שטפו את הרקמות עם PBS-T (PBS + 0.1% Triton X-100), 4x, 20 דקות כל אחד, ב RT, עם נדנדה עדין (~ 30 סל"ד).
- חסום את הרקמות של 1 ש 'ב RT עם חסימת חיץ (PBS + 1% BSA + 0.2% דל שומן יבש אבקת חלב + 0.3% Triton X-100).
- After חסימה, להעביר את הרקמות פתרון נוגדן ראשוני (מדולל חסימת חיץ) דגירה O / N ב 4 ° C עם נדנדה עדין (~ 30 סל"ד). דילולים של הנוגדנים העיקריים בשימוש מתוארים לוח החומרים.
- למחרת, לשטוף רקמות עם PBS-MT (PBS + 2% דל שומן יבש אבקת חלב + 0.5% Tween-20), 4x, 30 דקות כל אחד, ב RT, עם נדנדה עדין (~ 30 סל"ד).
- בעקבות צעד זה כביסה, להוסיף נוגדנים משני בדילול של 1: 250 (צעד זה צריך אופטימיזציה עבור נוגדנים אישיים) במאגר חסימת דגירה של 1 ש 'ב RT, עם נדנדה עדינה.
- מעתה ואילך לשמור על הרקמות מכוסות בנייר אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור כמו נוגדנים משני מסומנים עם fluorophores הרגיש לאור.
- שטוף את הרקמות 3x עם PBS-T (-20 Tween% PBS + 0.1), 30 דקות כל אחד, עם נדנדה עדינה.
- כן שקופיות להרכבת הרקמות המוכתמות.
- בשביל זה, לחתוך את תלושי זכוכית המכסהלרצועות דקות באמצעות עט יהלומים ואת מקל שתי רצועות אחד על הפנים השניים בשקופית הזכוכית באמצעות אמייל מסמר. הפוך שני גבולות ורקמות מקום בין שני הגבולות האלה.
- הוסף בינוני הרכבה המכיל DAPI ולבש להחליק את המכסה. החל אמייל מסמר בזוויות להחליק את המכסה כדי לתקן את זה לשקופית.
הערה: רקמות מוכנות כעת הדמיה. אחסן את השקפים האלה ב -20 ° C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במהלך הפיתוח, WD עובר שינויים משמעותיים שבו צינור פשוט ישר הופך דביק מורכב מפותל מאוד. באמצעות שיטות שתוארו לעיל, WDS עוברת טרנספורמציה דומה בתנאי תרבות. כאן אנו הראינו את התוצאות של WDS בתרבית למשך 3 ד (איור 3). כדי לנתח מנגנונים מולקולריים המעורבים המורפוגנזה WD, מדיום התרבות זו יכול להיות מלווה מעכבים ו activators מיקוד מסלולי איתות שונים. איור 3 ג תערוכות התיר WD אחרי 3 ד התרבות בנוכחות של Wnt איתות מעכב ספציפי, 10 IWR1. חצים לסמן מ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מערכת התרבות האיבר יש יתרונות רבים על פני מערכת תרבית תאים המסורתית. מערכת זו שומרת על יחסים ואינטראקציות מבניים המקוריים בין סוגי תאים שונים. הוא מחק במערכות vivo ומעניק מידע מדויק יותר לימודי תרבות תא שבו הגורם הנישה נעדרת. השימוש במערכות תרבות איברים קיימים גם יתרונות על פני שימוש החיה כולה. אלה כוללים את העלות הגבוהה של שימוש בבעל חי טיפול קל ותחזוקה של מערכת התרבות איבר, ועוד יותר מכך, סוכנים תרופתיים שונים או תרופות יכולים להיבדק על איברים מבודדים / תרבותיי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות לחברי הקבוצה לאונקולוגיה גינקולוגיה לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו בוצעה שנשען בחלקו על ידי מימון בריאות ממלכתי המועצה למחקר רפואי, המועצה למחקר האוסטרלי, ואת NSW מכון הסרטן (PST). ח"כ הוא הנמען של אוניברסיטת מחקר אחוות שלאחר התואר הראשון ניוקאסל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ניתן לרכוש צלחות 24 בארות | Corning, USA | 3524 | מספקים אחרים |
| Hank' s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, ארה"ב | SH30031.02 | ניתן לרכוש מספקים אחרים |
| מדיום הנשר השונה של Dulbecco: תערובת נוטריינטים F-12 (DMEM/F12) | Sigma, ארה" | D8437 | חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Interpath, אוסטרליה | SH30034.02 | 10% FBS בשימוש במדיום תרבית |
| L-גלוטמין | GE Healthcare מדעי החיים, ארה" | SH30034.01 | ריכוז 1% בשימוש |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Gibco, ארה"ב | 15070-063 | ריכוז 1% בשימוש |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, ארה"ב | ממברנה 110409 | (0.8 ומיקרו; m) |
| IWR1 | סיגמא, ארה"ב | 10161-5 מ"ג | 100 ומיקרו; ריכוז M בשימוש |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% מלאי, 4% ב-PBS לשימוש. רעיל - ללבוש כפפות ולא ניתן להשליך לכיור |
| אתנול | תרמו סיינטיפיק פישר, ארה" | 214-20L PL | מוחלט, להכין 25, 50 ו<>75% עם מים מיליQ. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, ארה"ב | 2509-500 מ"ל | צמיג מאוד, זהיר בעת חלוקת |
| Triton X-100 | Sigma, ארה"ב | T8787-50 מ"ל | צמיג מאוד, זהיר בעת חלוקת |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, ארה"ב | 621-500 מ"ג | ניתן לרכוש מספקים אחרים |
| נתרן די-מימן פוספט | Ajax Finechem, ארה"ב | 4745-500 גרם | ניתן לרכוש מספקים אחרים |
| נתרן כלוריד | תרמו סיינטיפיק פישר, ארה" | 465-500 גרם | ניתן לרכוש מספקים אחרים |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, ארה"ב (DHSB) | TROMA-I | 1:250 בחסימת מאגר |
| פעיל ובטא; קטנין | טכנולוגיית איתות סלולרי, ארה" | D13A1 | 1:200 בחסימת מאגר |
| פוספו-היסטון 3 | Millipore, MA, ארה" | 06-570 | 1:200 בחסימת |
| מאגר Alexa488 עז נגד ארנב IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, ארה" | 111-545-047 | 1:250 בחסימת מאגר |
| Alexa594 עז נגד חולדות IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, ארה" | 112-585-072 | 1:250 בחסימת מאגר |
| גליצרול | תרמו פישר סיינטיפיק, ארה" | 242-500 מ"ל | ניתן לרכוש מספקים אחרים |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370-2 | |
| -(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, ארה" | D9564-10mg | השתמש להכתמת חומצות גרעין (DNA) |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, ארה"ב | 2225-500 מ"ל | |
| תלושי כיסוי ממס (24 x 50 מ"מ) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
מקורות
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
- Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 9, 283-292 (2005).
- Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling. Dev Biol. 412, 234-249 (2016).
- Murashima, A., et al. Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation. Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development? Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).
- Hirashima, T., Adachi, T. Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development. PLoS One. 10, 0135343(2015).
- Chan, W. Y., Blomberg, L. A. Germline Development: Methods and Protocols. Methods Mol Biol. 825, (2012).
- Karner, C. M., et al. Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development. Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).
- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
