מאמר שיטה

ניתוח של הפרדת כרומוזום, אצטון היסטון, ומורפולוגיה ציר ב סוס ביציות

DOI:

10.3791/55242

⸱

11 במאי 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Health, Animal Science and Food Safety, University of Milan, 2IRCCS. Istituto Ortopedico Galeazzi, 3PRC, CNRS, IFCE, Université de Tours, INRA, 4PAO, INRA, 5Clinique des Animaux de Compagnie et des Équidés, Université de Liège, 6University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, Romania

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר גישה ניסיונית מורפולוגית וביוכימית לאפיין ביציות סוסים. באופן ספציפי, העבודה הנוכחית מדגימה כיצד לאסוף ביציות של בוגר בוגרת ובוגרת על ידי אולטראסאונד מונחה איסוף ביצית (OPU) וכיצד לחקור הפרדה כרומוזום, מורפולוגיה ציר, acetylation היסטון גלובלי, ביטוי mRNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השדה של רבייה בסיוע פותחה לטיפול בבעיות פוריות אצל נשים, חיות נלוות וסוגים הנמצאים בסכנת הכחדה. בסוס, רבייה מסייעת גם מאפשר ייצור של עוברי מן ביצועים גבוהים בלי להפריע את הקריירה הספורטית שלהם תורמת לעלייה במספר הסייחים ממאדים של ערך גנטי גבוה. כתב היד הנוכחי מתאר את הנהלים המשמשים לאיסוף ביציות בוגר ו בוגר מן השחלות באמצעות ביצית איסוף (OPU). ביציות אלה שימשו אז כדי לחקור את השכיחות של aneuploidy על ידי התאמת פרוטוקול שפותח בעבר בעכברים. באופן ספציפי, הכרומוזומים ואת centromeres של הביציות metaphase II (MII) היו תווית fluorescently ונספר על תוכניות מוקד רציף לאחר מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה. ניתוח זה גילה שכיחות גבוהה יותר בשיעור aneuploidy כאשר ביציות בוגרים נאספו הזקיקים והתבגר במבחנה לעומתIn vivo. Immunostaining עבור tubulin ואת הצורה acetylated של היסטון ארבע בשאריות lysine ספציפיים חשף גם הבדלים במורפולוגיה של ציר מיוטי ובתבנית הגלובלית של אצטילציה היסטון. לבסוף, הביטוי של mRNAs קידוד עבור היסטון deacetylases (HDACs) ו acetyl- העברות (HATs) נחקר על ידי שעתוק לאחור quantitative-PCR (q-PCR). לא נמצאו הבדלים בביטוי היחסי של התמלילים שנצפו בין המבחנה לבין הביציות המתבגרות של vivo . בהסכמה עם השתקה כללית של פעילות תמליל במהלך התבגרות הביציות, הניתוח של כמות התמליל הכולל יכול רק לחשוף יציבות mRNA או השפלה. לכן, ממצאים אלה מצביעים על כך שתקנות טרנסלציוניות ופוסט-טרנסלציוניות נוספות עשויות להיות מושפעות.

בסך הכל, המחקר הנוכחי מתאר גישה ניסיונית מורפולוגית וביוכימית לאפיין את הביצית סוס, ceLl סוג זה מאתגר מאוד ללמוד בשל זמינות מדגם נמוך. עם זאת, הוא יכול להרחיב את הידע שלנו על ביולוגיה הרבייה ועקרות מינים monovulatory.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מגוון רחב של טכניקות רבייה בסיוע פותח לטיפול בבעיות פוריות אצל נשים, חיות נלוות וסוגים הנמצאים בסכנת הכחדה. אחד ההליכים הנפוצים ביותר במסגרות קליניות הוא אחזור של ביציות הבמה metaphase II (MII) של זקיקי השחלות על ידי שאיפה transvaginal מונחה אולטרסאונד, איסוף ביצית (OPU) 1 . ביציות אלה מופרות אז במבחנה (IVF), עם העובר שנוצר (ים) מושתל ברחם הנמען. בשלב MII (בוגרת) ביציות מאוחזרים בעקבות ניהול של גונדוטרופינים אקסוגניים. עם זאת, טיפול זה קשור, בחלק מהחולים, עם התפתחות של תסמונת hyperstimulation השחלות (OHSS) 2 .

ניצול של היכולת המהותית של בוגרות, בוגרות בוגרת (שלב GV) כדי לחדש את המיוזה מיד לאחר מבודדים מן הזקיקים שלהם, ניתן להשיג ביציות בוגרות ללא adminisגונדוטרופין 3 . הליך זה נקרא ביצית במבחנה חוץ גופית (IVM) ומייצג גישה פחות סמים, פחות יקר, יותר ידידותי לסבלנות לסיוע טכנולוגיה הרבייה. עם זאת, ההצלחה של התפתחות העובר עם ביציות במבחנה מעובד הוא בדרך כלל נמוך יותר מאשר עם vivo התבגר vivo 4 , 5 . הסבר אפשרי הוא כי ביציות בוגרת מבחנה מושפעים יותר על ידי טעויות הפרדה כרומוזום, וכתוצאה מכך aneuploidy פוגעת התפתחות עובריים נורמלי 6 .

הבנת הבסיס המולקולרי של הפרעה מוטעית כרומוזומלית במהלך IVM תגלה בסופו של דבר את הפוטנציאל המלא של טכניקה זו. ברוח זו, הגישה הניסויית המשמשת לבדיקת התכונות המורפולוגיות והביוכימיות של ביציות במבחנה , בהשוואה ל vivo maturביציות אד כאן מתואר 7 , 8 . באופן ספציפי, את ההליכים עבור OPU של ביציות בשלים בוגרת IVM של ביציות בשלים מודגמים באמצעות סוסים בוגרים טבעי רכיבה כמודל ניסיוני. לאחר מכן, immunofluorescence וניתוח התמונה משמשים לחקור הפרדה כרומוזום, מורפולוגיה ציר, ואת דפוס העולמי של אצטילון היסטון על gametes אלה. לבסוף, פרוטוקול של שעתוק לאחור PCR כמותי מתואר לניתוח ביטוי mRNA.

בהשוואה למודלים של בעלי חיים מכרסמים, סוסים אינם מאפשרים מניפולציה גנטית, הם פחות קל לתמרן, ודורשים תחזוקה יקר. עם זאת, מודל זה הוא צובר עניין רב עבור המחקר של התבגרות הביצית 9 , 10 בשל הדמיון הפיזיולוגיה השחלות האדם 11 , 12 </ Sup>. יתר על כן, פיתוח של פרוטוקולים אמינים של IVM-IVF בסוס יש אינטרס כלכלי משמעותי, שכן זה יאפשר עלייה במספר הסוסים ממאדים של ערך גנטי גבוה.

אחת המגבלות של ביצוע ניסויים על ביציות, במיוחד במינים monovulatory, הוא זמינות מדגם מוגבל. מגבלה זו כבר התגבר כאן על ידי התאמת גישה, שפותחה בעבר בעכברים, כדי ביציות סוס 13 , 14 כדי לבצע ספירת כרומוזום כי ממזער את ההפסד המדגם (ראה דיון להשוואה עם טכניקות אחרות זמין). יתר על כן, פרוטוקול מכתים הקרינה משולשת כבר אופטימיזציה לבצע ניתוחים מרובים על המדגם אותו, וניתוח ה- Q-PCR בוצעו על בריכות של 2 ביציות בלבד.

בסך הכל, המחקר הנוכחי מתאר גישה ניסיונית שמטרתה מורפולוגית ביוכימית צ'הRacterize את הביצית סוס, סוג התא כי הוא מאתגר מאוד ללמוד בשל זמינות מדגם נמוך. עם זאת, הוא יכול להרחיב את הידע שלנו על ביולוגיה הרבייה ועקרות של מינים monovulatory.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה CEEA Val de Loire מספר 19 ו בוצעו על פי העקרונות המנחים לטיפול ושימוש של חיות מעבדה.

1. ביצית אוסף ב התבגרות חוץ גופית

  1. ביצית איסוף
    1. מדי יום להעריך על ידי אולטרסאונד את קוטר זקיקי השחלות בתוך קבוצה של סוסות בוגרים. בהופעתו של זקיק ≥33 מ"מ (זקיק דומיננטי), להזריק את הסוסה עם 1,500 IU של גונדוטרופין כוריוני האדם (hCG) בחלק העליון של הווריד הצוואר (iv).
      1. לפני ביצוע ההזרקה, ספוגית את האזור עם אלכוהול, לאתר את התלם הצוואר, ומניחים את האגודל 2-3 ס"מ מתחת לאתר ההזרקה כדי לעורר את הווריד לעלות. הכנס את המחט כמעט מקביל הצוואר לשאוף לוודא כי המחט נמצאת בווריד (הדם ייכנס מזרק). בשלב זה, להזריק; HCG יגרמו למטראטרקציה של הביצית בזקיק הדומיננטי.
    2. 35 שעות לאחר הזרקת hCG, להרגיע את הסוסה עם detomidine (15 מיקרוגרם / ק"ג, IV), butoranol טרטרט (10 מיקרוגרם / ק"ג, IV) ו butylescopolamine ברומור (0.2-0.3 מ"ג / ק"ג, 15 מ"ל / סוסה, IV).
    3. חבר את המחט בדיקה אולטראסאונד. הכנס את בדיקת אולטרסאונד בנרתיק והחזק את השחלה באופן שגוי כדי להתמודד עם בדיקה אולטראסאונד. הנחה מפעיל אחד לתמרן את המחט והשני להחזיק את השחלה במקום, עם זקיק מול בדיקה אולטראסאונד . התחל מן השחלה עם זקיק דומיננטי.
    4. לנקב את הקיר הנרתיק ואת הקיר של זקיק דומיננטי עם המחט (בדיקות אולטרסאונד עבור OPU מצוידים ערוץ עבור המחט מחובר למערכת יניקה); Theneedle יהיה גלוי בתמונה echographic.
    5. לשאוב את נוזל follicular בצינור 50 מ"ל חרוטי מחובר למערכת היניקה. יוצקים את התוכן של חרוטיצינור לתוך צלחת פטרי גדול ולחפש את קומולוס, ביצית מורכבת (COC) באמצעות stereomicroscope.
    6. מאז COC הוא לא תמיד לאחזר עם נוזל זקיק, לשטוף את זקיק עם Dulbecco שונה של פוספט שנאגרו מלוחים (DPBS) המכיל 5 IU / מ"ל ​​הפרינאט 37 ° C. בדוק DPBS עבור נוכחות COC, כפי שתואר לעיל עבור נוזל זקיק בשלב 1.1.5. שטוף מספר פעמים עד שה - COC מאוחזר.
    7. לאחר COC מן הזקיק הדומיננטי הוא לאחזר, לנקב ולרוקן את הזקיקים ≥5 ו ≤ 25 מ"מ, כמתואר עבור זקיק דומיננטי במדרגות 1.1.3-1.1.4; זקיקי ≥5 ו ≤25 אינם מבטאים luteinizing הורמון / choriogonadotropin קולטן (LHCGR), ולכן, הביציות שלהם לא יבשיל בתגובה hCG ו ייאספו בשלב GV (לא בוגר). רק לשמור על COCs עם כמה שכבות שלמות של תאים קומולוס ואופלאזמה חומה, מגורענת דק. מחק את האחרים.
    8. בסוף ה- OPU, בJect הסוסה עם benzyl-penicillin 15,000 IU / בעל חיים כדי למנוע הידבקות.
    9. בית סוסה באורווה שקטה, נקי לפחות 2 שעות. בדוק סימנים של מודעות על ידי קביעת המיקום של האוזניים, תגובה לגירויים ( למשל, רעש), ואת ההליכה לפני החזרת הסוסה לחברה של בעלי חיים אחרים.
  2. התבגרות חוץ גופית
    1. HEPES חם שנאגרו TCM199 (20 מ"מ hepes) בתוספת 1,790 IU / L הפרין, 0.4% אלבומין בסרום שור (BSA), פניצילין, סטרפטומיצין ו 37 מעלות צלזיוס. הכן מראש את המדיום. סנן לעקר ולשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
    2. הכן את המדיום IVM על ידי הוספת NaHCO 3- BCMered TCM199 (25 מ"מ NaHCO 3 ) עם 50 ng / מ"ל ​​אפידרמיס גורם הגידול (EGF) ו 20% עגל בסרום 7 . השתמש NaHCO 3- ניפח TCM199 תוך 3 שבועות של פתיחת בקבוק חדש. הכן את EGF מראש כמו מניות 100x, להקפיא אותו ב -20 מעלות צלזיוס, ולהשתמש בו בתוך 6 חודשים. לוותר על 500 μL בבארות של צלחת 4-היטב ו דגירה באוויר humidified עם 5% CO 2 ב 38.5 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות.
    3. לאחר אחזור של COCs מן ≥ 5 ו ≤ 25 מ"מ זקיקי, לשים אותם בצלחת פטרי (3.5 ס"מ קוטר) מלא 2 מ"ל של HEPES-TCM199. להעביר את COCs לאזורים שונים של המנה כדי לשטוף את פסולת הסלולר.
    4. מעבירים את COCs למדיום IVM ו דגירה במשך 28 שעות באוויר humidified עם 5% CO 2 ב 38.5 מעלות צלזיוס.

2. Immunofluorescence וניתוח תמונה

  1. כרומוזום לספור
    1. לאחר איסוף מן זקיק דומיננטי או בסוף IVM, דגירה COCs עם monastrol 100 מיקרומטר עבור 1 שעות באוויר humidified עם 5% CO 2 ב 38.5 מעלות צלזיוס. הכן monastrol מראש כמו מניות 100x ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 1 שנה.
    2. הסר את התאים cumulusעל ידי טיפול בהם עם 0.5% hyaluronidase או על ידי pipetting בעדינות; להסיר את zona pellucida על ידי טיפול בו 0.2% pronase. הכן hyaluronidase ו pronase מראש כמו מניות 10x ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 1 שנה.
    3. תקן את הביציות ב paraformaldehyde 4% DPBS במשך 15 דקות ב 38.5 מעלות צלזיוס ואחריו 45 דקות נוספות ב 4 מעלות צלזיוס.
      זְהִירוּת! ללבוש ציוד מגן אישי בעת טיפול paraformaldehyde, ולהשליך חומרים מזוהמים בהתאם להנחיות פסולת מסוכנים.
    4. לשטוף את הביציות על ידי העברת ברצף ב 3 בארות מלאים 500 μL של DPBS בתוספת 0.1% אלכוהול פוליוויניל (PVA). Permeabilize ב 0.3% Triton X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    5. בלוק שאינם ספציפיים incby הדגירה ב DPBS בתוספת 1% אלבומין בסרום שור (DPBS-1% BSA) ו 10% בסרום חמור רגיל לפחות 30 דקות ב RT. דוגמאות ניתן לשמור על חסימת פתרון ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים.
    6. עבור מכתים העיקרי, דגירה ביציות ארנב נגד אורורה B-phospho-Thr232 ב DPBS בתוספת 1% BSA (דילול 1:50) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    7. שטפו את הביציות כמתואר בשלב 2.1.4. דגירה ביציות בפתרון של tetra-methylrhodamine isothiocyanate (TRITC) - חמור conjugated נגד ארנבת IgG (1: 100 ב DPBS-1% BSA) במשך שעה 1 ב RT בחושך.
    8. שטפו את הביציות כמתואר בשלב 2.1.4, ולאחר מכן מקום 3-4 ביציות בטיפה של לא התקשות, נגד דהייה הרכבה בינונית בתוספת 20 מיקרומטר YOPRO1 על שקופיות זכוכית. חזור על התהליך עד כל הביציות מותקנים (3-4 ביציות לכל שקופית).
    9. אפשר ביציות להתיישב על 10 דקות במדיום הרכבה, ולאחר מכן לכסות אותם עם coverslip. כדי למנוע מוחץ ביציות, להחיל שתי רצועות של קלטת דו צדדית לפני הנחת coverslip על השקופית זכוכית.
      הערה: אמצעי זהירות זה גם יבטיח כי כל הדגימות דחוסים באותה מידה בין sli זכוכיתדה ואת coverslip. זכוכית שקופיות ניתן קפוא ב -20 מעלות צלזיוס ו צילמו במהלך 2-3 ימים הבאים.
    10. תמונה דגימות על מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה עם מטרה 60X באמצעות אדום (centromeres) וירוקים (כרומוזומים) ערוצים 7 , 13 , 14 , 20 , 21 . סרוק את דגימות פורש את הצלחת metaphasic על ציר ה- Z, עם צעדים כל 0.35 מיקרומטר. שמור את התמונות הדיגיטליות של כל תוכנית אחת.
    11. ספירת centromeres בסעיפים confocal סדרתי באמצעות פונקציה לספור תאים של NIH ImageJ תוכנה (זמין ב: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
      הערה: הימנע מספירה חוזרת של centromeres המופיעים על חלקים סמוכים על ידי זיהוי centromeres להופיע, להישאר ונעלמים מקטעים רציף עם קוד מספרי.
    12. חזור על שיתוף הכרומוזומיםללא שינוי בשלב 2.1.11 עם מפעיל עצמאי.
      הערה: לסווג את הביציות כמו euploid (32 כרומוזומים), היפרפלואיד (32), או היפופלויד (<32).
  2. מורפולוגיה ציר ואצטילציה היסטון
    1. לאחר איסוף מן הזקיק הדומיננטי או בסוף IVM, להסיר את התאים קומולוס על ידי טיפול ב 0.5% hyaluronidase או על ידי pipetting עדין, כמתואר בשלב 2.1.2.
    2. לשטוף את הביציות DPBS-PVA, כמו בשלב 2.1.4, ולתקן אותם paraformaldehyde 2.5% במשך 20 דקות ב 38 ° C. לשטוף באופן נרחב, כמתואר בשלב 2.1.4, ו permeabilize ב 0.1% Triton X-100 עבור 5 דקות ב RT.
      הערה: ללבוש ציוד מגן אישי בעת טיפול paraformaldehyde ו להשליך חומרים מזוהמים בהתאם להנחיות פסולת מסוכנים.
    3. לחסום שאינם ספציפיים incby הדגירה ב DPBS השלימו עם 2% אלבומין בסרום שור (DPBS - 2% BSA), 0.05% saponin, ו 10% סרום חמור רגילh r 2 ב RT.
      הערה: דוגמאות ניתן לשמור על חסימת פתרון ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים.
    4. עבור מכתים העיקרי, דגירה ביציות העכבר נגד אלפא טובולין (1: 150) ו ארנב נגד acH4K16 (1: 250) ב BBS DPBS-2% עם 0.05% saponin ב 4 ° C במשך הלילה.
    5. שטפו את הביציות כמו בשלב 2.1.4. דגירה ביציות בפתרון של ירוק צבע ניאון חמור מצומדות חמור אנטי עכבר IgG (1: 500) ו TRITC- מצומדות חמור נגד ארנבת IgG (1: 100) ב BBS DPBS-2% עם 0.05% saponin במשך שעה 1 ב RT בחושך.
    6. לשטוף את הביציות כמו בשלב 2.1.4, ולאחר מכן מקום 3-4 ביציות טיפה של הלא מתקשה, אנטי דוהה הרכבה בינונית בתוספת 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) על שקופית זכוכית.
    7. הר ביציות על שקופיות זכוכית כמתואר בשלב 2.1.8.
    8. תמונה דגימות על מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה עם מטרה 60x באמצעות אדום (acH4K16), ירוק (אלפא טובולין), וכחול (DNA) ערוצים.
      הערה: שמור את הגדרות הלייזר עבור הערוצים האדומים והכחולים קבוע במהלך הרכישה של כל הדגימות. סרוק את דגימות פורש את כל ציר מיוטית צלחת metaphasic על ציר ה- Z, עם צעדים כל 0.35 מיקרומטר. שמור את התמונות הדיגיטליות (תוכניות יחיד ותמונה 3D מוקרן).
    9. מדוד את אורך ציר מוט אל מוט ואת קוטר ציר על רוחב מרבי על התמונה המוקרנת באמצעות פונקציית המדידה של NIH ImageJ תוכנה (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30 .html). חזור על כל 3 פעמים ולחשב את הממוצע.
    10. לכמת את הקרינה היחסית של acH4K16 באמצעות פונקציית צפיפות משולבת של NIH ImageJ תוכנה (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). לנרמל את זה עבור צפיפות משולבת של מכתים DAPI.

3. ניתוח הביטוי mRNA

  1. לאחר COCs כבר לאחזר 5 עד 25 מ"מ זקיקים, לאסוף את התאים granulosaUspension שנותר בצלחת פטרי לשטוף אותו פעמיים DPBS קר על ידי צנטריפוגה ב XG 10,600 במשך 2 דקות. הצמד להקפיא חנקן נוזלי. חנות דגימות ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים; התאים ישמשו עבור עקומת תקן.
  2. בזהירות להסיר את כל התאים cumulus, כמתואר בשלב 2.1.2, מ בוגר (GV), במבחנה התבגר, ב vivo התבגר ביציות.
  3. שטפו את הביציות, כמתואר 2.1.4, ב DPBS-PVA, לאסוף אותם ביחידות 1 μL, ושכב 2 RNALater μL על גבי. הצמד להקפיא חנקן נוזלי. חנות דגימות ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  4. הוסף 2 pg של RNA לוציפראז לכל מדגם כמו ספייק ב. בריכה ביציות 2 x 2 ו לחלץ את סך RNA באמצעות סיליקה קרום מסנן מבוסס ערכת מתאים לשחזר RNA מדגמים קטנים.
  5. היפוך-לתמלל את ה- RNA μL 10 עם 0.25 מיקרוגרם מיקרוגרם אקראי העכבר Moloney לוקמיה וירוס transcriptase הפוך עבור 1 שעה ב 37 & # 176; חנות דגימות ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  6. לדלל את cDNA מהתאים גרנולוזה במים RNAse חינם ל 50 ng / μL. סדרתי לדלל את הפתרון הזה 1:10 כדי לקבל 5 ng / μL, 0.5 ng / μL, 0.05 ng / μL, ו 0.005 ng / פתרונות μL.
  7. להרכיב תגובות בשלושה עותקים בהיקף של 20 μL לכל תגובה באמצעות cDNA שווה 0.05 ביציות כמו המצע, או 5 μL של דילולים סדרתי של cDNA תא granulosa, 10 μL של supermix SYBR ירוק, 0.3 מיקרומטר של כל פריימר ספציפי ( טבלה 1 ).
  8. הפעל את התגובה cycler תרמי באמצעות פרוטוקול 3 שלבים: 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו 72 מעלות צלזיוס במשך 20 שניות, חוזרות על עצמה 40 פעמים. לבסוף, לרכוש את עקומת ההיתוך, החל מ 60 מעלות צלזיוס, ולהגדיל את הטמפרטורה על ידי 0.5 מעלות צלזיוס כל 20 s עד 95 ° C.
  9. להעריך את כמות ההתחלה (SQ) של mRNA ספציפי בדגימות הביצית באמצעות עקומת תקןF "15 מחושב על בסיס מדגם התא גרנולוזה, להביע את הנתונים כיחס בין SQ של הגן של עניין SQ של הגנים משק בית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הממצאים המקוריים של ניסויים אלה תוארו בעומק בעבר 7 והם מדווחים כאן כדוגמה לתוצאות שניתן להשיג באמצעות הפרוטוקולים המתוארים.

שיעור התבגרות

מתוך 32 COCs שאוחזרו על ידי OPU מזקיקים דומיננטיים, 28 (88%) היו בשלב MII. ארבעה עשר מתוך...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות IVM בוצעה בסוסים במשך יותר מ 20 שנים 16 , אנחנו עדיין לא יודעים אם הביצית יכולה להיות המקור של aneuploidy עובריים, כפי שהוצע עבור בני אדם 17 . הסיבה היא כנראה כי הכנת מתפשט הביצית עבור ספירת כרומוזום התוצאות להפסד מדגם ניכר. עם זאת, בסקר של שיטות המשמשות לחקירת טעויות הפרדה כרומוזום נערך לחפש את הטכניקה המתאימה ביותר ליישם ביציות סוס. ארבע טכניקות עיקריות נמצאו בספרות המדעית: 1) פרוסות כרומוזומליות 5

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים היו רוצים להודות Fabrice וינסנט לתמיכה עם לייזר סריקת מיקרוסקופיה confocal (LSCM) , ואת פיליפ Barrière ו תיירי בלארד לביצוע אולטרסאונד סריקה השחלה היומית וזריקה hCG. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי פרויקט "אזור Sardegna ו Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (מענק מס '26096200 ל AML); את "לוריאל איטליה עבור כל דון e la Scienza 2012" המלגה (חוזה 2012 ל FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, מחקר הסוכנות (REA) "Pro-Ovum" (מענק מס '303640 ל VL); ועל ידי בית הספר הפוסט-דוקטורט לחקלאות ולרפואה וטרינרית, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית, תוכנית מבצעית סקטוריאלית לפיתוח משאבי אנוש 2007-2013 (חוזה מס 'POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 ל- IM). אוסף הביציות של vivo מומן על ידי מכון המחקר של Cheval et de l'Equitation.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בדיקת אולטרסאונדאלוקהUST-5820-7,5
גונדוטרופין כוריוני אנושיצנטראבטCHO0041,500 יחידה/בעל חיים IV
דטומידיןצנטראבטMED0109 - 15 ומיקרו; גרם/ק"ג
IV butylscopolamine bromurecentravetEST0010.2 מ"ג/ק"ג
סטריאומיקרוסקופNIKONSMZ-2B
butorphanolcentravetDOL00310µ גרם/ק"ג IV
בנזיל-פניציליןסנטרבטDEP203 IM15,000 UI/בעלי חיים
TCM199אבקת סיגמא-אולדריץ'M3769 10X1Lעבור חוצץ hepes TCM199
מלח נתרן HepesSigma-AldrichH3784-100G
אלבומין סרום בקרSigma-AldrichA8806
heparin Sigma-AldrichH3149-10KU
NaHCO3-buffered TCM199Sigma-AldrichM2154-500MLנוזל ל-IVM
גורם גדילה אפידרמליSigma-AldrichE4127
סרום עגל יילודSigma-AldrichN4762-500ML
4-well כליםNUNCLON144444
אינקובטורהראוסBB6060
מונסטרולסיגמא-אולדריץ'M8515
היאלורונידאזסיגמא-אולדריץ'H3506
פרונאזסיגמא-אולדריץ'P5147
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ'P6148
אלכוהול פוליווינילסיגמא-אולדריץ'341584
טריטון-X 100Sigma-AldrichT8787
סרום חמור רגילSigma-AldrichD9663
ארנב נגד Aurora B phospho-Thr232BioLegend636102
TRITC מצומד חמור נגד ארנב IgGVector Laboratories711-025-152
Vecta-ShieldVector LaboratoriesH-1000
YOPRO1Thermofisher ScientificY3603
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליLSM 780Zeiss
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליLSM 700Zeiss
ImageJ תוכנהrsb.info. nih.gov/ij/download.htmlעכבר
אנטי-אלפא טובוליןSigma-AldrichT8203
ארנב אנטי-acH4K16אפסטייט ביוטכנולוגיה07-329
AlexaFluor 488-coniugated חמור נגד עכבר IgGLife TechnologiesA21202
4',6-diamidino-2-phenylindoleSigma-AldrichD8417DAPI
צנטריפוגהEppendorf5417R
RNALaterInvitrogenAM7020
Luciferase RNAPromegaL4561
PicoPure RNA Isolation KitApplied Biosystems12204-01
הקסמרים אקראייםThermofisher ScientificN8080127
עכבר מולוני וירוס לוקמיה הפוך טרנסקריפטאזThermofisher Scientific28025013
SYBR ירוק סופרמיקסBioRad1708880
פריימרים ספציפייםSigma-Aldrichפריימרים ספציפיים תוכננו באמצעות תוכנת Primer3Plus (משאב חופשי)
תרמי-ציקלרBioRadMyiQ
עכבר חד שבטי אנטי-CENPAAbcamab13939
עכבר חד שבטי אנטי-אורורה BAbcamab3609
IV בינוני משאבים בחינם

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467(1984).
  2. Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
  3. Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
  4. Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
  5. Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
  6. Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
  7. Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
  8. Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
  9. Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
  10. Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
  11. Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
  12. Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
  13. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  14. Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
  15. Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
  16. Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
  17. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  18. Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
  19. Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
  20. Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
  21. Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
  22. Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
  23. Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217(2012).
  24. Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377(2013).
  25. Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
  26. Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58(2013).
  27. Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
  28. Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
  29. Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
  30. Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
  31. Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

qPCRIn Vitro Maturation

מאמרים קשורים