תא להתאמה אישי עבור נדידת תאים מדידות

Summary

פרוטוקול זה מפרט שיטה להתאמה אישית למדוד נדידת תאים בתגובת chemoattractants שעשוי לשמש גם כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של תרופה מתוך פולימר מטריקס.

Abstract

נדידת תאים היא חלק חיוני של מערכת חיסונית, צמיחה, וריפוי פצעים. נדידת תאים היא תהליך מורכב הכרוך אינטראקציות בין תאים, תאי מטריקס, וגורמים כימיים מסיסים ובלתי מסיס (למשל, chemoattractants). שיטות תקן למדידת ההגירה של תאים, כגון assay הקאמרית בוידן, עבודה על ידי ספירת תאים משני צדי מחיצה. טכניקות אלו קלות לשימוש; עם זאת, הם מציעים שינוי גיאומטרי קטן עבור יישומים שונים. לעומת זאת, מכשירי microfluidic יכולים לשמש כדי לצפות נדידת תאים עם מילויי ריכוז להתאמה אישיים של גורמי מסיסי ^{1, 2.} עם זאת, שיטות להכנת מבחנים מבוססים מיקרופלואידיקה יכולות להיות קשות ללמוד.

כאן אנו מתארים שיטה קלה ליצירת תאי תרבית תאים למדוד נדידת תאים בתגובה הדרגתית ריכוז כימי. המייל הסלולרי שלנושיטה קאמרית הגירה יכולה ליצור הדרגתי ריכוז ליניארי שונה על מנת ללמוד נדידת תאים עבור מגוון רחב של יישומים. שיטה זו היא יחסית קלה לשימוש והיא מבוצעת בדרך כלל על ידי סטודנטים לתואר ראשון.

תא microchannel נוצר על ידי צבת הוסף אקריליק בצורה של חדר microchannel הסופי היטב לתוך צלחת פטרי. אחרי זה, פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) נמזג על גבי להכניס את. את PDMS הורש להקשיח ואז להכניס הוסר. זה אפשר ליצירת בארות בכל צורה או גודל רצוי. תאים עשויים להיות שיצטרפו בעתיד תא microchannel, וסוכני מסיסים ניתן להוסיף אחת הבארות על ידי השריית גוש agarose ב הסוכן הרצוי. בלוק agarose מתווסף באחת הבארות, ואת הזמן לשגות תמונות שניתן לנקוט של חדר microchannel על מנת לכמת נדידת תאים. וריאציות שיטה זו יכולה להיעשות עבור יישום נתון, מה שהופך גדולות בשיטה זוhly להתאמה אישית.

Introduction

על מנת שתהליכים חיוניים כגון ריפוי פצעים, תגובות חיסוניות והתפתחות עוברית יתרחשו, חייבת להתרחש נדידת תאים. נדידת תאים כוללת אינטראקציה בין תאים לתאים שכנים, המטריצה החוץ-תאית ורמזים כימיים מסיסים (מושכים או דוחים). כדוגמה, בתהליך ריפוי פצעים, פיברובלסטים ממלאים תפקיד אינטגרלי בפיברוגנזה ובהתכווצות הפצע, כאשר התאים מגויסים לאתר הפציעה כדי לסנתז קולגן על מנת ליצור את המטריצה החוץ-תאית³. נחקרו מנגנונים רבים מאחורי נדידת פיברובלסטים לאתר פצע, והם כוללים גורמים מכניים, פיזיים, חשמליים וכימו-טקטיים שונים⁴. פיברובלסטים מגיבים טוב במיוחד לשיפועי ריכוז שונים של גורמי גדילה. גורמי גדילה שונים אלה פועלים יחד כדי לייעל את התחדשות הרקמות⁵. תוך התבוננות בתגובה הכימוטקטית של פיברובלסטים לריכוזי גורמי גדילה, ניתן לחקור את דפוס הנדידה הכיוונית של פיברובלסטים וכיצד הם מכוונים את עצמם סביב מכשולים פיזיים על מנת להגיע ליעדם. לכן, מטרות מחקר זה היו קודם כל לפתח מערכת שבה ניתן לעקוב אחר צמיחת פיברובלסטים בהנחיית מחסומים פיזיים ושנית למדל את צמיחת הפיברובלסטים כשהם מנווטים במערכת.

נכון לעכשיו, בדיקת תא בוידן היא המערכת הנפוצה ביותר למדידת נדידת תאים⁶. תא בוידן מורכב מצלחת רב-בארית בת שני תאים, כאשר כל באר עשויה להכיל מדיום עם או בלי כימיקום⁷. קרום פילטר מספק ממשק נקבובי בין שני התאים בכל באר; זה יוצר מחסום כך שתאים לא יכולים לעבור אלא אם כן זה על ידי הגירה פעילה. בדרך כלל, עבור תא בוידן מתווסף חומר משיכה כימי לתא התחתון, והמערכת מורשית להתאזן ליצירת שיפוע בין הבאר העליונה והתחתונה⁴. בעיה אחת עם מבחן תא בוידן היא ששיפועים תלולים נוצרים בסופו של דבר לאורך ציר יחיד בניצב לפני השטח של הממברנה. זה גורם להבדל בריכוז הכימותרפיה בין הבארות העליונות והתחתונות להיות נמוך ממה שהיה צפוי בתחילה. בשל אילוץ זה, בדיקת תא בוידן מקשה על מתאם בין תגובות תאים ספציפיות עם מאפייני שיפוע מסוימים, כגון השיפוע והפרש הריכוז. ללא מדידות אלה, קשה לחקור שילוב אותות מרובי שיפועים.

כדי לטפל בחלק מהאילוצים של מבחן תא בוידן, פותחו מבחני מיקרופלואידיקה ליצירת שיפועי ריכוז הניתנים להתאמה אישית¹. שיטות סטנדרטיות ליצירת מערכות מיקרופלואידיות דורשות חדרים נקיים לטכניקות ליטוגרפיות. טכניקות אלו יכולות להיות קשות ללמידה, במיוחד במסגרת כיתה סטנדרטית. לפיכך, תכננו מערכת תאים למדידת נדידת תאים שניתן לבצע ללא שימוש בחדר נקי. באמצעות המערכת שלנו, ניתן לכוונן את בארות הבדיקה לגודל מועדף, ולייצר שיפוע ריכוז ליניארי של שיפוע מותאם אישית. זה מאפשר מדידה מדויקת של כימוטקסיס מתנועה אקראית. העיצוב הוא מערכת זולה וקלה לשימוש למידול צמיחת תאים בתגובה לגירויים כימיים שונים.

Protocol

1. הפקת לשכת microchannel ליצור מפל ריכוזים

1. חיתוך חתיכת עובש אקריליק
   1. השג חתיכת אקרילי בעובי הרצוי. משתמשים בדרך כלל 1/16 אינץ 'בעובי גליונות אקריליק. גיליונות עבים קשים לחתוך היטב דק מאוד סדינים אין את החוזק המכאני הנדרש, מה שגרם להם לשבור או עיוות תוך כדי התהליך.
   2. יצירת קובץ CAD עם הצורה הרצויה של היצירה אקריליק לייצר חלל בתוך polydimethylsiloxane (PDMS). התאם את רוחב הערוץ וארך כדי להשיג את השיפוע הרצוי רלוונטי פרוטוקולי ניסוי פרט.
      1. הנה, להשתמש פיסת אקריליק של הממדים הבאים: שני ריבועים (0.254 ס"מ x 0.254 ס"מ) המחוברים באמצעות ערוץ רחב 0.127 ס"מ (0.254 ס"מ) (איור 1).
   3. ייבא את קובץ CAD לתוך המכשיר חיתוך לייזר ולמקם היצירה אקריליק חותך לייזר על פי manuהפרוטוקול של facturer.
      הערה: לחילופין, 3D-להדפיס את היצירה מעיצוב CAD. היתרון של שיטה זו הוא כי חומרים חלופיים יכולים לשמש עבור העובש; עם זאת, החלטת השחזור יכולים להיות ירידה עם הדפסת 3D לעומת חיתוך ליזר.

איור 1: תכנון בעזרת מחשב (CAD) ייצוג microchannel הקאמרית. תמונה זו מתארת ​​את ציור CAD של הוסף אקריליק הדרושים ליצירת תא microchannel. 1 א) להציג לראש ציור CAD, 1B) הצד לנוכח CAD ציור עם מידות בסנטימטרים, 1C) נוף לראש CAD ציור עם מידות בסנטימטרים אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. יציקת polydimethylsiloxane (PDMS)
   1. בסירה לשקול, לערבב 10 חלקים לפי משקל של אלסטומר בסיס מסחרי (למשל Sylgard 184) עם חלק 1, לפי משקל, סוכן מסחרי אלסטומר אשפרה (למשל Sylgard 194). בדרך כלל, לערבב 10 גרם של מאגר אלסטומר עד 1 גרם של סוכן אלסטומר אשפרה.
   2. מערבבים לשלב את הבסיס סוכן ריפוי עם micropipette למשך 5 דקות.
   3. הגדרת פעמון ואקום ומניחים הסירה לשקול עם PDMS בריק במשך 30 דקות כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו.
   4. כבה את הוואקום ולהסיר את הסירה לשקול. יוצקים את PDMS על גבי מחוץ לחתוך אקריליק בצלחת פטרי קטנה. ודא כי PDMS מכסה לחלוטין את הכנס.
   5. אפשר PDMS כדי לרפא לילה (לפחות 18 שעות) בטמפרטורת החדר.
3. הסרת הכנס מן PDMS
   1. לאחר לרפא את PDMS, להסיר את המכסה על ידי חיתוך PDMS בזהירות סביב חתיכת אקרילי עם אזמל.

2. ציפוי התאים בתא microchannel

1. עיקור לתא עבור תאי ציפוי.
   הערה: בעוד PDMS ניתן לעקר באמצעות אתילן אוקסיד או טכניקות אחרות, טיפול UV מהיר הוא מהיר, זול, ומספיק מחקרי תרבית תאים. משך טיפול UV הקצר לא לפגוע שלמות מבנה או מכאני של יצירת PDMS.
   1. בארון תרבית תאים סטנדרטי, מכסה לחלוטין את החדר עם אתנול 70%.
   2. שים את צלחת פטרי ברדס זרימה למינרית עם המכסים מעל.
   3. סתום את מכסה המנוע ולהדליק את האור האולטרה סגול. לחשוף לאור UV למשך 1-2 שעות.
   4. פתח את מכסה המנוע זרימה למינרית ולחכות 15 דקות כדי לחדש את זרימת.
   5. הסר את אתנול 70%.
   6. לשטוף לתאי פעמיים עם בופר פוספט סטרילית (PBS). השתמש 1 מ"ל של PBS עבור כל שטיפה. הסר PBS ולאפשר תאים לייבוש למשך הלילה עם המכסים מעל.
      הערה: לחילופין, במקוםשל שימוש במנדף זרימה למינרית, להשתמש בתיבת קאמרית UV לעיקור אם אחד זמין. להפוך את תיבת UV על ידי הצבת מקור אור UV בחלק האחורי של קופסת קרטון מרופדת בנייר אלומיניום. רדיד האלומיניום משקף את האור כדי לאפשר גם תאורה של המדגם.
2. תאי ציפוי ב קאמרי
   1. ספירת תאים באמצעות trypan כחול ו hemocytometer.
      1. הוספת 100 μL של השעית תא 400 μL של 0.4% Trypan כחולים ומערבבים בעדינות. החל 100 μL של פתרון זה hemocytometer על ידי מילוי שני התאים בעדינות מתחת coverslip הזכוכית.
      2. שימוש במיקרוסקופ עם מטרה 10X להתמקד הרשת על hemocytometer. השתמשתי מונה נקודות יד לספור את התאים בלא הכתם חיים בתוך קבוצה אחת של 16 ריבועים על hemocytometer.
      3. ספירת תאים בכל 4 סטים של 16 ריבועים. קח את ספירת תאי הממוצע מן 4 סטים של 16 ריבועים ולהתרבות על ידי 5x10 ^4. המספר הסופי זהו number של תאים / מ"ל ​​ההשעיה תא.
   2. להוסיף 2,500 תאים היטב אחד בכל תא. זה מתרגם ל צפיפות התאים ליד ומחוברות של ~ 30,000 / ² ס"מ.
   3. אפשר תאים לשבת בתא במשך 60 דקות לפני הוספת מדיה (הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco, 10% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין, סטרפטומיצין).

3. Dextran ספוג בלוקים Agarose

1. יצירת גוש agarose
   1. יוצקים 3% agarose לתוך תבנית מודפס 3D (2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ).
   2. אפשר agarose כדי לחזק בתא ואקום למשך 30 דקות כדי להסיר בועות.
   3. הסר את הבלוק agarose מן התבנית.
      הערה: לחילופין, יוצקים 3% agarose לתוך צלחת קטנה פטרי בעובי של 2 מ"מ. חותכים בלוק 2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ באמצעות אזמל או כלי חיתוך אחרים. זה לא מדויק כמו מערכת העובש אבל זה יכול להיות קצת יותר קל לעשות.
2. לגמרי submergדואר לחסום agarose בתמיסה של הריכוז הרצוי של גורם chemotactic. כדי להעריך את היווצרות מפל ריכוזים, שטוף את התא הראשון עם dextran ניאון. הריכוז ועל משקל מולקולרי של dextran צריך להתאים לזה של גורם או סמים מסיסים של עניין.
3. משרים את הלילה לחסום agarose.

4. זמן לשגות של דיפוזיה Dextran להעריך את מפל ריכוזי הפקטור המסיס

1. מניחים את גוש agarose ספוג dextran בתוך באר ריבוע קטן של החדר microchannel.
2. הנח את תא microchannel במערכת הדמיה תא או להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי אחר עם יכולת זמן לשגות. להתחיל את הזמן לשגות פי הוראות היצרן.
   הערה: התוצאות המוצגות נלקחים עם מסנן GFP, 50% אור, 4/10 pH, והגדלה 4X.

5. זמן לשגות של גדילת התא

1. פלייט תאים בתא microchannel בקצה אחד שלתָא. הנה, להשתמש 3T3 פיברובלסטים. להוסיף 2,500 תאים היטב אחד בבית הבליעה microchannel. ספירת תאים כמתואר 2.2.1.
   1. אפשר תאים לשבת בתא במשך 60 דקות לפני הוספת מדיה (הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco, 10% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין, סטרפטומיצין). שמור על תא microchannel עם תאים מצופה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2. נדידת תאי הדרך ניתן לצפות בערוץ עם מיקרוסקופ.
   2. הוספת סמן או להשתמש פגם מיקרוסקופי בתא כסמן כדי לשמש נקודת זינוק לכמת את המרחק המהלכים מול התא.
2. ליצור שיפוע ידי הצבת ג'ל agarose (8 מ"מ ³ בלוק) המכיל את גורם הגדילה מרוכז,-attractant הכימותרפיה, סמים, או גורם אחר שנבדק (כאן, 40% FBS נמצא בשימוש כדוגמה) בקצה אחד של microchannel תָא.
3. קח זמן לשגות תמונות של חזית התא נעה. הנה, התוצאות מראות תמונות של התא הלוך ושובNT כי נלקחו כל 12 שעות באמצעות מערכת הדמיה.
4. השתמש בתמונות של חזית התא לכמת שיעור צמיחת תאים. לחשב את שיעור הצמיחה באמצעות הראשון פונקצית polyfit MATLAB (roipoly) כדי ליצור מסכה מצולעים שהוגדרה על ידי מול התא, קירות הערוץ, ואת סמן הפנייה. ממד המסכה הזאת להניב מרחק הגירה של החזית שממנו המהירות מול התא ממוצעת מחושבת. מחקרים אחרים לא מנוצלים בשיטה דומה ^8.
   הערה: השווה את הקצה מול צמיחת תאים על כל מסגרת לריכוז של הגורם המסיס באותו מרחק. השיפוע גורם ריכוז המסיס מחושב באמצעות קירוב מודל דיפוזיה 1D.
5. קח תמונות הניאון של תאים באמצעות מכתים Phalloidin ו DAPI.
   1. תקן תאים לפני צביעה עם Phalloidin.
      1. paraformaldehyde 4% חם ב 37 מעלות צלזיוס.
      2. הוסף מספיק 4% paraformaldehyde לכסות תאים. שמור את התאים בparaformaldehyde למשך 10 דקות.
      3. יש לשטוף פעמים עם PBS במשך 15 דקות בכל פעם. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים.
   2. הסר PBS מתאי ולהוסיף פתרון מספיק permeabilizing (0.1% Triton X-100 ב PBS) כדי לכסות תאים. השאר פתרון במשך 10 דקות.
   3. שטוף פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל פעם. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים.
   4. הסר PBS מתאי ולהוסיף פתרון לחסימת (1% אלבומין בסרום שור ב PBS) במשך 20 דקות.
   5. סור פתרון חסימה ולשטוף 2 פעמים עם PBS במשך 5 דקות בכל פעם. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים.
   6. מנקודה זו, להגן על תאים מפני אור עם רדיד אלומיניום כאשר לא בשימוש. הסר PBS מתאי ולהוסיף Phalloidin 488 בדילול 1:50 ב PBS עבור H 1.
   7. לשטוף 2 פעמים PBS במשך 5 דקות לכל לשטוף. השתמש מספיק PBS כדי לכסות את התאים. ואז להסיר PBS מתאי.
   8. הוסף DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) מדולל 1: 1,000 ב PBS לתאים במשך 15 דקות.
   9. הסר DAPI ולשטוף תאים פעמים עם PBS במשך 5 דקות לכל לשטוף.
   10. הסר לשטוף האחרון ולהוסיף מספיק PBS לכסות תאים. תאים יכולים להיות צילמו עכשיו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Results

איור 2 מציג את התנועה של חזית התא מעבר לתעלה בתגובת שיפוע של בסרום שור העובר להציב בקצה השני של הערוץ מהמקום שבו התאים מצופים. חזית התא מוצגת 48 שעות (איור 2 א), 72 שעות (איור 2 ב), 96 שעות (איור 2 ג), ו -120 שעות ציפוי פוסט (איור 2 ד). התנועה של חזית התא הייתה במעקב עם הזמן לשגות תמונות אלה, ושיעור הגירת מרחק וצמיחה חושבו על ידי פונקצית polyfit MATLAB. כלומר, התוצ...

Discussion

תא microchannel שלנו עשוי לשמש מספר רב של מטרות, כולל קביעת שיעור נדידת תאים בתגובה גורמי גדילה chemoattractants ומדידת קצב הדיפוזיה של תרופה ממטריקס פולימר. אפשר לנצל תא microchannel שלנו לגדל תאים ומקום chemoattractant בקצה אחד של החדר. התאים גדלים בתגובה chemoattractant, ואת נדידת תאים ניתן לכמת על ידי לקיחת תמונות זמן לשגות כי ניתן לנתח על מנת לקבוע את שיעור נדידת תאים. נציג תוצאות של שיטה זו מוצגות באיור 3, כאשר שיעור הצמיחה היה נחוש בדעתו להיות 13.4 מיקרומטר...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184	761036 סיגמא-אולדריץ		(דימתילסילוקסן) ערכת 2 חלקים כולל בסיס אלסטומר סיליקון וחומר ריפוי אלסטומר סיליקון
יריעות אקריליק	ארה"ב פלסטיק	44200
כלי פטרי חד פעמיים	בז	25373-041
פלואורסצאין איזותיוציאנט וכו'; dextran	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Agarose, Type I, Low EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Dulbecco's Modified Eagle's	Medium Fisher Scientific	11965092	רכיבי מדיה תאית
בקר עוברי סריום	פישר מדעי	16000036	רכיבי מדיה תאית
פניצילין-סטרפטומיצין	פישר סיינטיפיק סיינטיפיק		15140148 רכיבי מדיה תאית
פוספט חוצץ מלח (PBS)	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific	AME3300	מכשיר המשמש לצילום תמונות זמן-lapse
Versa	Laser Universal Laser Systems, Inc.	מספר דגם: VLS2.30	חותך לייזר המשמש לחיתוך פלסטיק