Method Article

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

DOI:

10.3791/55301

⸱

August 15th, 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology, Cornell University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasmodesmata (Pd) הם חיבורים לתא לתפקד כשערי שדרכו מולקולות קטנות וגדולות מועברים בין תאי הצמח. ואילו משטרת התעבורה של מולקולות קטנות, כגון יונים, מים, יש להניח להתרחש באופן. פסיבי, תחבורה לתא של מקרומולקולות ביולוגיות, כגון חלבונים, קרוב לוודאי מתרחשת דרך מנגנון פעיל המערבת אותות מיקוד ספציפי על מועבר מולקולה. המחסור אותות לוקליזציה מזוהה plasmodesmata (Pd) (PLSs) הגבלות קשות על ההבנה של מיון חלבונים המעורבים בצמח-לתא macromolecular תחבורה ותקשורת. מתוך שפע של הצמח חלבונים אנדוגני וויראליים ידועים תעבורה דרך Pd, PLSs רק שלושה דווחו עד היום, כולם בעלי פרוטאינים צמחיים אנדוגני. לכן, חשוב לפתח אסטרטגיה שיטתית ואמין ניסיוני לזהות את רצף PLS פונקציונלי, הוא הצורך וגם מספיק עבור מיקוד Pd, ישירות בסלון לשתול תאים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה אחת כזו באמצעות כמו פרדיגמה החלבון-לתא התנועה (MP) של נגיף פסיפס הטבק (TMV). ניסויים אלו, מזוהה, מאופיין הראשון לשתול PLS ויראלי, ניתן להתאים עבור גילוי PLS רצפי חלבונים ביותר, ממוקדות Pd.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפונקציה plasmodesmata (Pd) כערוצים עבור תעבורה המערכת של הרגולטורים מפתח של התפתחות הצמח, מורפוגנזה, ועד גורמי שעתוק mRNA של מולקולות RNA קטנות. יתר על כן, יכולתו macromolecular התחבורה של המשטרה הוא מנוצל על ידי מרבית הווירוסים צמח על התפשטות המערכת שלהם במהלך זיהום; כדי לעבור בין Pd, וירוסים התפתחו חלבונים מיוחדים, כינה את התנועה חלבונים (MPs), שמתמקדים Pd1,2,3,4,5,6 , 7. מסלולים מולקולריים התחבורה Pd רוב הסיכויים הם מחוברים בצורה אינט....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. חומר צמחי

  1. הבחירה של מיני צמחים
  2. השתמש המין צמח ילידי החלבון של עניין, דהיינו, אחד אשר מקודד חלבון זה חלבונים אנדוגני, או המייצג המארחת הטבעי של המחלה חלבונים נגיפיים. בנוסף, המין הצמח הנבחר חייב להיות נוטה? בשיטה של שינוי גנטי ארעית.
    הערה: המחקרים באופן שגרתי להעסיק טבק benthamiana, אשר מייצג מארח טוב עבור TMV, עובר טרנספורמציה ביעילות על ידי טכניקת בתיווך Agrobacterium שינוי גנטי, קרי, agroinfiltration (ראה שלב 3). צמחים benthamiana (ש ע) גם הם מגדלים בקלות, יש עלים גדולים, מחוסן בקלות על-ידי Agrobacterium ומותאמים בקלות נותחו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
  3. צימוח
    1. צמח

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנתונים נציג, בנאמנות להמחיש את התוצאות צפוי מן הפרוטוקולים שתואר ולזהות את TMV MP PLS, המותאמים מ יואן. et al. 21. איור 1A מסכם ראשון המבנים העיקריים לבטא את באורך מלא TMV MP (1-268), TMV MP PLS (הכוללת את שאריות חומצה אמינית קודם 50 של החלבון, 1-50), ו שלה אלנין סריקה V4A נגזרים דבוקה CFP (נוצר כמו שמתואר 2.2 השלבים, 5.2 ו- 6) ואילו איור 1B והשוואה מכמתת לוקליזציה subcellular של חלבונים אלה מתויגות. איור 1C

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה יש ארבעה מרכיבי הליבה: הרעיון של זיהוי רצף הוא נחוץ וגם מספיק עבור מיקוד לתחנת משטרה, חטיבת שיטתית של החלבון עניין לחלקים שגודלם מצטמצם בהדרגה אורך, פיוזינג נבדק קטעים לחלבון autofluorescent המשמשת כתג והן מטען macromolecular, וכן assay פונקציונלי עבור משטרת פילוח חיים צמח רקמות בעקבות הביטוי ארעית של החלבונים פיוז'ן שנבדקו. שימו לב כי הביטוי ארעי בתיווך Agrobacterium יוצר נתונים בתוך תקופה קצרה יחסית של זמן, קרי, מספר ימים, לעומת הנדרש לייצור של הצמחים הטרנסגניים משמש לעתים קרובות מחקרים דומים

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על חוסר מקום, בקידושין שהבאנו בעיקר סקירת מאמרים, אנו מתנצלים לעמיתים שלנו שעבודתם המקורי לא צוטט. העבודה במעבדה וייטקונג נתמך על ידי מענקים NIH, ה-NSF, משרד החקלאות/NIFA, ברד, BSF וייטקונג, המעבדה S.G.L. נתמך על ידי NIH כספים מן המחלקות של פתולוגיה ביולוגיה צמח-חיידק S.G.L.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM)ZeissLSM5כל CLSM עם יכולות דומות מתאים
תוכנת זן להדמיית מיקרוסקופ קונפוקליגרסת Zeiss 2009התוכנה צריכה להיות תואמת לערכת
המוטגנזה המכוונת לאתר CLSM המשמשת Quickchange II Agilent200523
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
MESSigma-Aldrich69892
מזרקים ללא מחטיםBD309659
MgCl2FisherScientificM33-500
Spectinomycin סיגמא-אולדריץ'S4014
ריפמפיציןסיגמא-אולדריץ'R3501
אמפיצילין סיגמא-אולדריץ'A0166

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasmodesmata LocalizationProtein Targeting SignalsAgrobacterium InfiltrationConfocal MicroscopyFluorescent Protein TaggingTobacco Mosaic VirusPlant Cell CommunicationMolecular TransportPlasmodesmata TargetingCell to Cell Transport

Related Articles