הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אוסף העופות זרע על ידי עיסוי Cloacal ובידוד של ה-DNA של הזרע

17K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55324

⸱

5 בפברואר 2018

 , 
1Environmental and Conservation Sciences Program, North Dakota State University, 2Department of Biological Sciences, North Dakota State University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר עיסוי cloacal, טכניקה ידני פולשני עבור איסוף זרע מן הציפורים, והפקת DNA מן העופות הזרע באמצעות ערכת חילוץ מסחרי עם שינויים.

תקציר

איסוף זרע עשויה להיות שימושית עבור מגוון רחב של יישומים כולל מחקרים שכללו איכות זרע, זרע טלומר dynamics, אפיגנטיקה. ציפורים נמצאים בשימוש נרחב הנבדקים במחקר ביולוגי והם אידיאליים עבור מחקרים שכללו דגימות זרע חוזרות ונשנות. עם זאת, מעט משאבים זמינים כעת עבור אלה המעוניינים ללמוד כיצד לאסוף לחלץ את ה-DNA של הזרע העופות. כאן נתאר עיסוי cloacal, טכניקה ידני עדין, לא פולשנית עבור איסוף זרע העופות. למרות טכניקה זו נוצר בספרות, זה יכול להיות קשה ללמוד מן התיאורים זמינים. כמו כן, אנו מספקים מידע עבור חילוץ דנ א בזרע העופות באמצעות ערכת חילוץ מסחרי עם שינויים. עיסוי cloacal יכול לשמש בקלות על ציפור זכר קטן-בינוני במצב הרבייה. בעקבות אוסף, הזרע שניתן להשתמש באופן מיידי עבור מבחני תנועתיות או קפוא להפקת DNA בעקבות הפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך. פרוטוקול החילוץ זה היה מעודן לזרע העופות, נעשה בהצלחה על דגימות שנאסף מספר מינים ציפורי שיר מ (פאסר דומסטיקוס Spizella passerina, Haemorhous mexicanus, migratorius ציור ), אחד columbid (ליוויה יונה).

מבוא

ציפורים הן נושאים אידיאלי עבור מחקרים שכללו איכות הזרע, תחרות1, זרע טלומר dynamics2, אפיגנטיקה3ונושאים דומים, הם נמצאים בשימוש נרחב המחקר הביולוגי, זרע ניתן בקלות לטעום באמצעות cloacal עיסוי. עיסוי cloacal היא טכניקה ידני עדין, לא פולשנית עבור איסוף זרע מן הציפורים-4,-5,-6. דוגמאות חוזרות ניתן להשיג בקלות, אין כלים מיוחדים נדרשים, עושה את זה פשוט לבצע בשדה או מעבדה. למרות עיסוי cloacal כבר בשימוש במשך עשרות שנים, קשה ללמוד לכתוב תיאורים זמינים. פרסום זה מיועד להפחית את הזמן ואת אי הוודאות מעורב לימוד עיסוי cloacal.

הזרע שנאסף ציפורים באמצעות עיסוי cloacal שניתן להשתמש מיד תנועתיות-הערכת-4,-7 או הזרעה מלאכותית8או קפוא לשימושים אחרים כגון הדמיה מתקדמות והפקת דנ א. דגימות זרע מציפורי שיר מ הם קטנים, אך מכיל זרע בצפיפות. ה-DNA מופק באמצעות ערכת חילוץ מסחרי עבור פשטות, עם שינויים כדי להתגבר על התכונות מגן מיוחדות של זרע9. לאחר החילוץ, טלומרים זרע ניתן למדוד באמצעות qPCR10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה כרוך נושאים בעלי חוליות, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת המדינה של צפון דקוטה.

1. זרע מהאוסף ציפור שיר באמצעות עיסוי cloacal

הערה: עיסוי Cloacal שיטת איסוף זרע יעיל על ציפורים reproductively פעילים בלבד, אך ניתן לבצע בהצלחה מחוץ לעונת הקינון במצבים המתאימים בשבי. פעילות הרבייה צריך להיקבע עבור היעד מינים לפני באמצעות עיסוי cloacal. ניתן להשתמש בטכניקה זו על ציפורי בר על לכידת או על ציפורים מוחזק בשבי.

  1. החל זכר ציפור, (גידול בתנאי) לאחיזה של סיטרה ביד האחרת, להעביר את הציפור אל היד הדומיננטית עם הצד הגחון שלו נוגע כף היד (איור 1).
    1. ודא כי הראש של העוף הקרוב קצה לרוחב של כף היד. בקלילות לאבטח ראש וגוף באמצעות פינקי, טבעת, באצבעות. זה משאיר פתח וזנב של העוף חשוף.
    2. להשאיר את הרגליים של העוף רופף או בקלילות מאופקת באמצעות כף היד.

figure-protocol-1
איור 1 : גריפ עבור עיסוי cloacal. הציפור מאובטח בקלילות ביד הדומיננטית עם הצד הגחון שלו נוגע את דקל ובראש מאובטח על ידי אצבע הזרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. למקם את דומיננטי האצבע והאגודל משני צדי בסוף נעלה קלואקה וצבטתי קלות את האצבעות יחד תוך הפעלת לחץ קל מאוד לכיוון הזנב ( איור 2). קלואקה אוורט, חשיפת רירית cloacal (ורוד פנימי).
    הערה: אם הציפור לא כיום לייצר זרע, בליטה cloacal יכול להיות קטן, קלואקה, קשה, אוורט. עם ניסיון, קל להבחין בין cloacas של הזכרים reproductively פעיל, לא פעיל5,11.

figure-protocol-2
איור 2 : אצבע המיקום ואת בליטה cloacal. אוורט קלואקה על ידי הפעלת לחץ קל עד הסוף מעולה (א). ב זכר ציפורי שיר reproductively פעיל, ברור בליטה cloacal המשרד (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. עם היד הלא דומיננטית, במקום משטח של האצבע המורה על הצד הגבי של בסיס הזנב לייצב את היד, ולאחר מכן מקם קצה האגודל מתחת קלואקה everted.
    הערה: תמונה ממוזערת קצרה וחלקה הוא יתרון לביצוע עיסוי cloacal, מגן על הציפור מהפציעה.
  2. להזיז את האגודל-הדומיננטי עמוק, cranially עם לחץ בינוני, להישאר מתחת קלואקה קרבנותיו. המשך עד גומר הציפור. תלוי הפרט, זה בדרך כלל לוקח בין קווים 1 ו מספר עשרות.
  3. ברגע שהציפור גומר, לאסוף את הזרע צינור microhematocrit. חזור על עיסוי cloacal להשיג שופך מרובים.
    הערה: ציפורי שיר מ חום בהיר של זרע בדרך כלל יש עקביות עבה במקצת. חומרים בהיר או כהה הוצאת from קלואקה הן לא זרע, עשויים לזהם את דגימת הזרע. המראה של כמות קטנה של דם על קלואקה או מעורבת עם הזרע נגרמת בדרך כלל על ידי לחץ רב מדי בעיסוי.
  4. להפקת DNA, מקם את הזרע לתוך צינור microcentrifuge עם µL 20 ל- x 1 PBS (pH 7.4). הערה: זרע המאוחסן ב- 1 x PBS אינו מתאים הפריה מלאכותית, אך יכול לשמש להפקת DNA במועד מאוחר יותר כאשר הוא מאוחסן ב- 80 ° C טוב, מגניב יכול להיות בטמפרטורת החדר או מקורר, אבל צריך להיות במצב נוזלי כאשר דגימת הזרע הוא מופקד.
    1. לאשר הנוכחות של הזרע בדגימה על-ידי הצגת כמות קטנה של המדגם מדולל תחת מיקרוסקופ תרכובת (איור 3).
  5. לאחסן הזרע מדולל ב-80 מעלות צלזיוס עד מיצוי.

2. הפקת דנ א בזרע ציפור

הערה: פרוטוקול זה נבדק עם מספר ערכות חילוץ מסחרי של DNA, אך עברו רק מוצלח בעת שימוש ב- DNA אחד ערכת12. צעדים שעברו שינויים בפרוטוקול ערכת מסומנים באמצעות *.

  1. להכין פתרון 1 מ' של dithiothreitol (DTT) במים ולערבב באמצעות vortex.*
    1. Aliquot הפתרון DTT ואחסן אותו ב-20 ° C עד מיד לפני השימוש. כל דגימה לצורך פריסה מדחיסה דורש 10 µL של 1 מ' DTT solution.*
  2. הכנת מאגר המכיל 20 מ מ טריס-קלרנית, pH 8.0; 20 מ מ EDTA; 200 מ"מ NaCL; 4% מרחביות. כל דגימה לצורך פריסה מדחיסה דורש µL 90 של buffer.* הזה
    1. אחסן את המאגר בטמפרטורת החדר. אם זה יש זירז, לחמם את זה עד 56 ° C כדי dissolve.*
  3. מחממים אינקובטור המכיל של רוקר או שאכר כ- 65 ° C.*
  4. מיד לפני תחילת החילוץ, מערבבים 10 פתרון DTT µL עם µL 90 המאגר מוכן בשלב 2.2 עבור כל הדגימה כדי לחלץ, למשל 900 µL מאגר בתוספת 100 µL DTT פתרון אם חילוץ 10 דוגמאות. תערובת זו ייקרא DTT-buffer.*
  5. להוסיף 70 µL 1 x PBS המדגם כולו זרע מדולל, לערבב היטב באמצעות vortex.*
  6. להוסיף 100 µL DTT-buffer וכדי לפתור proteinase K µL 10 המדגם. מערבולת במשך 20 שניות, ואז דגירה בחממה preheated למשך שעה על הנדנדה או shaker.*
  7. להוסיף 200 µL מאגר AL ו- 200 µL EtOH טרי (100%) ו מערבולת עבור 20 seconds.*
  8. להעביר את הדגימה כל עמודה ספין, centrifuge 1 דקה-g 6,000 x. להשליך את הצינור אוסף.
  9. במקום העמודה על צינור חדש ולהוסיף µL הכין 500 מאגר AW1. Centrifuge 1 דקה-g 6,000 x. להשליך את הצינור אוסף.
  10. במקום העמודה על צינור חדש ולהוסיף µL הכין 500 מאגר AW2. צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 6,000 x ג למחוק את זרימה דרך ומקום העמודה חזרה ברכבת התחתית.
  11. Centrifuge 3 דקות ב- 20,000 g x. להשליך את הצינור אוסף ומניחים את העמודה על צינור microcentrifuge 1.5 mL.
  12. Pipet 35 µL של AE מאגר ישירות על גבי קרום עמודה, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 minutes.*
  13. Centrifuge 1 דקה-g 14,000 x. להשליך את העמודה ספין ולאחסן דגימות שחולצו ב-80 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עיסוי cloacal, ה-DNA חילוץ באמצעות שהפרוטוקול המתואר בוצע מספר מינים ציפורי שיר מ, אחד columbid (טבלה 1). הנוכחות של זרע זרע הדגימות שנאספו על ידי עיסוי cloacal אושר על-ידי הצגת כמות קטנה של הדגימות מדולל תחת מיקרוסקופ מתחם בהגדלה X 400 (איור 3). לאחר חילוץ DNA דגימות זרע שנאספו מן הבית דרורים באמצעות פרוטוקול המתואר כאן, שמונה דגימות היו פועלים בג'ל עם סולם הדנ א (שלוש דוגמאות ניתן לראות באיור4). להקות שונות ללא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מתארים שיטה פשוטה ואמינה איסוף זרע מעופות קטנים ובינוניים במצב פעיל reproductively, חילוץ DNA של הזרע העופות.

פרוטוקול מיצוי DNA זרע מתואר שינוי ערכה של פשטות, אבל היה מעודן לשימוש על זרע העופות. הזרע הם עמידים בפני פירוק על ידי מיצוי סטנדרטי כימיקלים9,13, דגימות זרע שנאסף passerines קטן למדי (בדרך כלל כמה microliters). גורמים אלה מציגים אתגרים הם בהצלחה להתגבר על-ידי שימוש של הריכוז המתאים של DTT המקננת ב 65 º C. באמצעות שיטה זו, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

אנו מודים חוזה Noguera לקבלת סיוע מוקדם עם עיסוי cloacal, ותמיכה ג'פרי Kittilson עבור המעבדה. עבודה זו נתמכה על ידי פרס ND EPSCoR FAR0022429 כדי BJH. עלויות הפרסום בנדיבות נתמכו על ידי NDSU במחלקה למדעי הביולוגיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות נימיים מיקרוהמטוקריטפישרברנד22-362566ניתן להשתמש בכל ספק. צינורות קטנים יותר עשויים להיות יעילים יותר לאיסוף דגימות זרע קטנות, כגון מעופות עוברים קטנים מאוד כמו דרור סתת.
צינורות מיקרוצנטריפוגהכל
1x PBSכל משמשלאחסון דגימות זרע לפני מיצוי DNA.
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD0632
Tris baseSigma-Aldrich10708976001ניתן להשתמש בכל ספק.
EDTAסיגמא-אולדריץ'1233508ניתן להשתמש בכל ספק.
NaClSigma-Aldrich793566ניתן להשתמש בכל ספק.
SDSSigma-Aldrich1614363ניתן להשתמש בכל ספק.
ערכת מיקרו QIAamp DNAQiagen56304Qiagen QIAamp ערכת מיקרו DNA מומלצת במיוחד. פרוטוקול מיצוי DNA זה נוסה עם ערכות מסחריות אחרות אך ללא הצלחה רבה. הסיבות לכך אינן ידועות לנו. 

מקורות

  1. Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
  2. Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
  3. Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
  4. Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
  5. Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
  6. Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
  7. Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
  8. Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
  9. Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA 'fingerprints'. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
  10. Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
  11. Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).
  12. QIAamp DNA Micro Handbook. , Third edition (2014).
  13. Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
  14. Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
  15. Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
  16. Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
  17. Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד DNA מזרההפקת זרה מעוףטכניקה לאיסוף זרעזרה של ציפורי השירפרוטוקול להפקת DNAבדיקת ניידות זרהמיקרוסקופיה תרכובתאלקטרופורזה של ג'ל
אוסף העופות זרע על ידי עיסוי Cloacal ובידוד של ה-DNA של הזרע
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.