הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הזרקת Intracardiac מונחה אולטרה סאונד של גזע Mesenchymal האנושי כדי להגדיל את יונת אל המעי לשימוש במודלים מאתר של מחלות מעי דלקתיות ניסיוני

12K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55367

⸱

1 בספטמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology and Liver Disease, University Hospitals, Digestive Health Research Institute, Case Western Reserve University, 2Case Cardiovascular Research Institute, School of Medicine, Case Western Reserve University, 3Department of Medicine, Harrington Discovery Institute, Harrington Heart and Vascular Institute, University Hospitals Case Medical Center, 4Department of Radiology, University Hospitals Case Medical Center, 5Department of Biology - Skeletal Research Center, Case Western Reserve University

במאמר זה

סיכום

מאתר מחקרים במודלים של דלקת המעי הגס הראו כי אחוז קטן (1-5%) של גזע mesenchymal (MSC) מוזרק לווריד או intraperitoneally הביתה כדי מודלק colon1,2. מחקר זה מראה כי זריקות intracardiac מונחה אולטרה סאונד של MSCs לגרום בלוקליזציה מוגברת אל המעי.

תקציר

מחלת קרוהן (CD) היא מחלה דלקתית כרונית נפוצה קטן המעי הגס. מאתר ואנושי בתאי גזע mesenchymal (MSCs) יש פוטנציאל לדיכוי המערכת החיסונית, הוכחו לדכא דלקת במודלים של העכבר של דלקת מעיים, אף-על-פי התוואי של המינהל יכול להגביל את יונת ואת האפקטיביות 1 , 3 , 4 , 5. יישום מקומי של MSCs למודלים פציעה שטיפת המעי הגס הראו להתייעלות ב ameliorating דלקת במעי הגס. עם זאת, יש במחסור של נתונים על טכניקות לשיפור הלוקליזציה של האדם הנגזרות מח עצם MSCs (hMSCs) אל המעי הדק, האתר של דלקת במודל SAMP-1/YitFc (SAMP) של קרוהן ניסיוני. עבודה זו מתארת טכניקה חדשנית עבור הזרקה intracardiac מונחה אולטרה סאונד של hMSCs בעכברים SAMP, מודל ספונטנית מאופיין היטב של דלקת מעיים כרונית. סקס - ואת גיל-מתאימים, עכברים AKR/J (AKR) ללא דלקת שימשו פקדים. כדי לנתח את biodistribution ואת ההתאמה, hMSCs היו transduced עם lentivirus המכילה כתב משולשת. הכתב טריפל כללה גחלילית לוציפראז (פל), עבור הדמיה מייצרים אור; monomeric אדום חלבון פלואורסצנטי (mrfp), למיון תא; קטום הרפס וירוס תימידין קינאז (ttk), עבור הדמיה טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET). התוצאות של מחקר זה מראים הזה 24 שעות לאחר מתן של intracardiac, hMSCs לשפה במעי הדק של SAMP עכברים לעומת עכברים AKR ללא דלקת. הרומן מונחה אולטרה סאונד הזרקה של hMSCs החדר השמאלי של SAMP עכברים מבטיח שיעור הצלחה גבוה המסירה תאים, ומאפשר התאוששות מהירה של עכברים עם מינימלי התחלואה והתמותה. טכניקה זו יכולה להיות שיטה שימושית עבור ההתאמה משופרת של MSCs במודלים אחרים של דלקת קטנה-מעיים, כגון TNFΔRE6. מחקרים עתידיים יקבע אם לוקליזציה מוגברת של hMSCs על ידי משלוח התוך עורקי יכול להוביל יעילות טיפולית מוגברת.

מבוא

מחלת קרוהן (CD) היא מחלה דלקתית כרונית נפוצה קטן המעי הגס ונחשב כתוצאה מענה לא הולם של מערכת החיסון המארחת החיידקים במעיים7,8. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי מאתר והן אנושית בתאי גזע mesenchymal (MSCs) יכול לדכא דלקת במודלים של העכבר של דלקת מעיים1,3,4,5. ישנם ניסויים קליניים מתמשך מרובות המשתמשות MSCs האנושי שמקורם במח העצם או רקמת שומן לטיפול בחולים עם מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי), אשר כוללת תקליטור9. שני מסלולים לטיפול MSC שומש בניסויים קליניים אלה: אחד כרוך החדרת מערכתית (קרי, דרך הווריד) של MSCs עבור luminal מחלת המעי הדלקתי (כולל תקליטור), והשני כולל היישום מקומי/ההזרקה של תאי גזע בפיסטולה מערכת של חולים עם perianal CD. ב האחרונה מטא אנליזה של MSC. טיפול מחלת המעי הדלקתי, מערכתית (קרי, תוך ורידי) MSC. טיפול luminal מחלת המעי הדלקתי (כולל תקליטור) היה יעיל ב- 40% (95% CI: 7-79%) של חולים, ואילו היעילות גבוהה בהרבה, 61% (95% CI: 36-85%), כאשר MSCs היו מוזרק באופן מקומי פיסטולה CD חולה9. Multicenter השלישי שלב זה התבצעה מבוקר פלסבו ניסוי של תאי גזע allogeneic אדיפוז מוזרק ישירות לתוך פיסטולה perianal של תקליטור חולים הראו משמעותי סטטיסטית ראיות קליני, רדיולוגית fistulae perianal ריפוי, אקראי מאמתים את ממצאי מטא אנליזה10. הסיבות יעילות נמוכה של טיפול MSC דרך הווריד לתקליטור luminal נחקר כראוי, אבל אחת הסיבות עשויה להיות יונת לקוי של MSCs לאתר של דלקת. מאתר מחקרים במודלים של דלקת המעי הגס הראו כי רק אחוז קטן של MSCs (1-5%) מוזרק לווריד להגיע המעי הגס מודלק; MSCs הנותרים מסוננים על ידי הריאות (אפקט כניסה ראשונה)1,2 ,5,11,12. מספר מחקרים מאתר ולכן השתמשו המסלול בקרום הבטן (i.p.) עבור ניהול MSC במודלים חייתיים של קוליטיס4. עם זאת, גם הדגים כי רק חלק קטן של תאים להגיע engraft המעי הגס ואת זה היעילות הקשורים ההפרשה של גורמים paracrine מסיסים, כמו גידול נקרוזה מקדם-inducible ג'ין 6 חלבונים (TSG-6)2. MSC מנגנון החיסוני וריפוי כרוך בגישה multipronged המערבת paracrine; גורמים קרבה תלויית התא, כמו TSG-6; ותא גורמים תלויי-קרבה, כמו מתוכנת מוות-ליגנד 1 (PD-L1); או 1 משוננים. לכן, לוקליזציה MSC לאתר של דלקת עלולה לגרום יעילות מוגברת9,13. למעשה, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי MSCs מושתל ישירות באתר של פציעה שטיפת המעי הגס גרמו ריפוי על ידי הפרשת אנגיוגנזה קידום כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF). מצד שני, אפקט ריפוי מינימלית צוין לאחר הזרקה תוך ורידי5. כדי להגדיל לוקליזציה שלהם לאתר של דלקת (קרי, המעי הדק בעכברים SAMP), פותחה טכניקה זו מונחה אולטרה סאונד הזרקת intracardiac לניהול MSC החדר השמאלי. הזרקת תמונה מונחה מבטיחה הזרקה מדויקת, אשר מוביל אל שיעור גבוה יותר של הצלחה, כדי ירדו התחלואה ואת התמותה. יתר על כן, ההזרקה של MSCs לתוך החדר השמאלי מספק להם הדם העורקי, שבו הם יכולים להגיע המעי הדק מודלק לפני הופך להיות לכוד בתוך הריאות.

במחקר זה, האדם הנגזרות מח עצם MSCs (hMSCs) שימשו הזרקת במודל SAMP-1/YitFc (SAMP) מאתר של CD14. SAMP הוא מודל מאופיין היטב מאתר ספונטנית של דלקת כרונית אשר מפתחת דלקת מעיים-קטן עם כמעט 100% penetrance14. הדלקת מתפתחת בתגובה microflora, בהעדר כל מניפולציה כימית, אימונולוגי או גנטי, הדומה CD האנושי11. סקס - ואת גיל-מתאימים ללא דלקת AKR/J (AKR) עכברים, העכברים בקרת הורים של SAMP, השתמשו במחקר זה.

HMSCs היו מבודדים והתרחבה במעבדה של דגימות מח עצם (מוניטור) שהושג מתורמים נורמלי, לא מזוהה, לאחר הסכמה מדעת באמצעות לאמת ופורסמו בעבר פרוטוקולים15,16. לאחר בידוד, הרחבה, היכולת MSC adipogenic osteogenic, בתוך, בידול chondrogenic היה מלווה במעבדה ע י מבחני מספר15. וזמינותו פונקציונלי osteogenic בוצע על ידי השתלת קוביות קרמיקה של היידרוקסיאפטיט/tricalcium פוספט מטריצה המכילה hMSCs subcutaneously ב CB17-Prkdc SCID immunocompromised עכברים17. קוביית וזמינותו מדגים פרכת ו chondrogenesis פוטנציאליים ונחשב במבחן האולטימטיבי להערכת MSC בודדים ההכנות17. כדי להמחיש hMSCs ויוו לאחר ההזרקה, lentivirus שימש מגלי hMSCs עם הבונה ג'ין כתב טריפל המורכב גחלילית לוציפראז (פל), חלבון פלואורסצנטי אדום monomeric (mRFP) ו הרפס ויראלי תימידין קינאז (ttk ), מונע על ידי יזם וירוס (mnd)18ששונה myeloproliferative סרקומה. גחלילית לוציפראז ב הכתב משולש הוא אנזים luciferin מוזרק את coverts כדי oxyluciferin ב hMSCs ומייצרת פוטונים/לבן אור. זה מזוהה על ידי המצלמה רגיש תשלום מצמידים מכשיר (CCD) (ביולומינסנציה) ויוו אופטי מערכת, המאפשר את החזיית בשידור חי hMSCs בעכברים הדמיה. ביולומינסנציה הדמיה (בלי) היא טכניקה רגיש יכול לשמש באופן סדרתי עבור מעקב אחר תאים ו- ex-vivo לניתוח. השימוש של מקדם mnd חזקה כוננים הביטוי רציפה של פיוז'ן טריפל כתב ג'ין הבונה ומאפשר ההדמיה של hMSCs מוזרק עבור יותר מ 16 שבועות19. HMSCs קשים מגלי ויש של יעילות נמוכה התמרה חושית. באמצעות פרוטוקול ממוטבת, היעילות התמרה חושית hMSCs היה משופר, הביטוי transgene היה משופר18. באמצעות ביטוי mRFP (אחד הגנים כתב טריפל) cytometry זרימה, הדגימו את היכולת מגלי hMSCs עם יעילות גבוהה של עד 83%. מבחני בידול, ויוו קוביה מבחני הפגינו את היכולת של hMSCs transduced להבדיל לתוך chondrocytes, adipocytes ו- osteocytes17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל העכברים ניסויים ופרוצדורות במחקר אושרו על-ידי אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב ' s אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש. ההליכים התנהלו בבית האגודה הערכה, הסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים (AAALAC) מוכר מתקן. ויטביע היה aspirated תחת פרוטוקול שאושרו על-ידי אוניברסיטת בתי חולים מוסדיים המנהלים במתקן הליבה של תאי גזע על אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב לאחר מדעת.

1. תרבות, התמרה חושית של מח עצם האדם, נגזר בתאי גזע Mesenchymal (hMSCs)

הערה: בידודו של hMSCs מתואר בפירוט פרסומים קודמים 15 , 20-

  1. תרבות מבודד hMSCs ב Dulbecco ' s נשר ששינה בינונית-נמוכה בינונית גלוקוז (DMEM-LG) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS). התרבות התאים 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO 2 מבחנות T175 25 מ של מדיום הגידול. החלף את המדיום כל 3-4 ימים. ביום 14, לבצע את המעבר הראשי של hMSCs.
    1. כאשר התאים להגיע למפגש 80%, להסיר לחלוטין את המדיום הישן ולשטוף בעדינות את התאים 5 מ ל תמיסת סטרילית באגירה פוספט (PBS; עבור תרביות רקמה 75 ס מ מבחנות).
    2. להסיר הבקבוקון של PBS ולהוסיף 4 מ"ל של 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). המקום הבקבוק בחזרה בחממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5-10 דקות לשמור את הזמן של חשיפה קצרים ככל האפשר.
    3. כאשר הרוב המכריע של תאים הפכו להיות מגובשים או להיות מנותקת המנה תרבות, לעצור את התגובה על-ידי הוספת נפח של סרום עגל שור שווה חצי נפח של טריפסין.
    4. להעביר התליה תא שפופרת צנטריפוגה בגודל המתאים. Centrifuge התאים ב 400 g x עבור 5 דקות ולאחר מכן הסר בזהירות את תגובת שיקוע.
    5. Resuspend התאים 5 מיליליטר בינוני (DMEM-LG + 10% FBS) ולספור את התאים עם hemocytometer.
      הערה: בשלב זה, התאים שניתן subcultured או transduced עם כתב משולשת.
  2. לבצע התמרה חושית של hMSCs עם כתב משולשת. . הבקבוק
    1. בתאי זרע 1.5 x 10-6 T175 אחד התרבות התאים 25 מ של מדיום הגידול-CO 37 ° C, 95%, לחות ו-5% 2. חכה 24 שעות ביממה עבור התאים לצרף.
    2. לייצר וירוס קוקטייל צינורות 15-mL, כפי שמתואר הפניה 18.
      1. Lentivirus הפשרה-37 מעלות צלזיוס ב מים באמבטיה. להוסיף µL 160 של פתרון סולפט 5 מ"ג/מ"ל proteamine Dulbecco ' s בינוני נשר שונה (DMEM) עד 8 מ"ל של תרבות בינוני (DMEM-LG + 10% FBS) עבור ריכוז הסופי של µg 100/mL. מערבולת על הוסף ס' 3 ריבוי וירוס זיהום (MOI) 5 (פעם ראשונה הקרת) .
    3. להסיר בינוני את הבקבוק התרבות התא (שלב 1.2.1) ולהוסיף את הקוקטייל הוירוס לתאים. תקופת דגירה של h 10 ב 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO 2.
  3. להוסיף 4 מ"ל של סולפט proteamine µg/mL 100 מ"ל 4 DMEM-LG + 10% FBS דגירה על ה 14 נוספים
  4. לעצור את התמרה חושית לאחר 24 שעות על-ידי החלפת 25 מיליליטר בינוני (DMEM-LG + 10% FBS).
  5. יעילות התמרה חושית אישור על-ידי הערכת ביטוי mRFP על ידי cytometry זרימה 18.
    הערה: כאן, hMSCs זה היו transduced עם מעל 65% יעילות שימשו.
  6. להרחיב את התאים על-ידי החלפת 25 מיליליטר בינוני טריים (DMEM-LG + 10% FBS) פעמיים בשבוע. התרבות התאים-CO 37 ° C, 95%, לחות ו-5% 2. מעבר תאים לאחר שיגיעו למפגש 80%.
  7. לאחר מספר התאים הרצוי מתמלאת, לבצע trypsinization לכל השלבים 1.1.2 - 1.1.4.
  8. לספור את התאים ו להשעות אותם ב- PBS סטרילי (1 x) ירידה בריכוז הסופי עונה 1 פרק 10 6 תאים/75 µL. לשמור את התאים על הקרח להעברה מכונת האולטרסאונד. לניסויים, להשתמש hMSCs ממספרים מעבר 2-5-

2. אולטרסאונד מונחה הזרקה Intracardiac של hMSCs לתוך החדר השמאלי

הערה: שימוש SAMP1/YitFc עם הוקמה קטן-מעיים דלקת ותואמים גיל - ו מגדר AKR/J עכברים בשביל הניסויים. לשמור על העכברים SAMP, AKR בתנאים מסוימים ללא הפתוגן, להאכיל אותם מעבדה סטנדרטיים צ'או ולשמור אותם על 12-h/כהה מחזורים. כאן, זריקות לב מונחה אולטרה סאונד בוצעו באותו חדר ייעודי אולטראסאונד ללא הפתוגן הלב ממוקם במתקן המחקר בבעלי חיים CWRU היה מחוטא עם חומר מחטא, שטפה עם אלכוהול 70%. עובדי מחקר מעבדה חייב ללבוש ציוד מגן אישי, כולל שמלות, מסכות פנים עם עין מגן, כפפות סטריליות במהלך זריקות intracardiac. חום הגוף של העכבר חייבת להישמר משך ההליך.

  1. להגדיר את האולטרסאונד מערכת הדמיה לפני מאלחש את העכבר. עבור פרוטוקול זה, השתמש את מכונת האולטרסאונד מיועד העכבר ואק ג.
    1. להפעיל את העוצמה ואת initialize המתמר (30 מגה-הרץ) כדי להגדיר את המחקר החדש-
  2. עזים ומתנגד העכבר תא אינדוקציה באמצעות 3-4% איזופלוריין 100% חמצן בשיעור של 0.2 - 0.5 L לדקה לשמור על החיה על כל התהליך עם 2% איזופלוריין 100% חמצן דרך קונוס האף. לאשר ההרדמה המתאים לפני ביצוע הדמיה על ידי צובט את הבוהן, לגלגל את העכבר ולאחר התבוננות העדר תנועה-
    הערה: משחה אופטלמולוגיות צריך להיות מוחל על העיניים בעקבות של אינדוקציה של הרדמה כדי למנוע ייבוש הקרנית. העברה העכברים anesthetized המכונות הדמיה (קרי, מערכת הדמיה ביולומינסנציה ו אולטרסאונד), שבו הם יקבלו מנה תחזוקה של איזופלוריין הרדמה. לקבוע ההרדמה להתחיל זמן ואת העומק של הרדמה על ידי התבוננות חוסר תגובה צובט על הזנב ואת הרגל לרפד כל 10 דקות למשך כל הרדמה.
  3. לקבוע את הטמפרטורה של הג'ל הטבלה, אולטראסאונד הדמיה 37 מעלות צלזיוס.
  4. להסיר לחלוטין את הפרווה על אזור החזה של העכבר anesthetized באמצעות קרם להסרת שיער.
  5. הנח את העכבר על השולחן הדמיה במצב פרקדן ולאבטח בשני הגפיים העליונים והתחתונים עם דבק כדי למנוע תנועת הגוף במהלך ההליך. להשתמש צג רל במהלך ההליך עבור עכברים כל.
  6. לנקות את העור של אזור החזה בעזרת מקלון povidone/יוד 10% ואחריו מקלון אתנול 70%. למרוח שכבה עבה של ג'ל לאזור בית החזה של העכבר.
  7. הר המתמר למחזיק ולהתאים את מעמדה עד החדר השמאלי בבירור על שדה הראייה.
  8. טען 150 µL של transduced hMSC תא השעיה (2 x 10 6 hMSCs ב µL 150 ל- PBS סטרילי) לתוך מזרק 1-mL עם 28-G מחט ולאבטח את המזרק עם בעלי המתאים. כדי להמחיש דם פועמת, לשמור על עמודת האוויר קטן במזרק. כדי למנוע את הצליעה, להשעות את התאים לפני הזריקה.
  9. לקדם את המזרק לעבר בית החזה העכבר, להתאים את מסלול המחט בעזרת ההדרכה אולטרסאונד, והזן החדר השמאלי.
  10. בעקבות ההדרכה של ההדמיה אולטרסאונד, לחדור המחט מזרק בחלל הבין-צלעי ולתוך החדר השמאלי של העכבר.
    הערה: מחט מזרק שניתן יהיה החדר השמאלי על התמונה ultrasonographic. השמה נכונה צריכה להיות עוד יותר מאושרות על ידי תזרים דם עורקי טרי לתוך המזרק. . אלו סימנים הכניסה מוצלחת.
  11. להזריק התליה תא hMSC מאוד לאט במשך 2 דקות, החלת טרום עדיןssure.
  12. בעקבות הזריקה של תאים על תנאי, בעדינות לשלוף את המחט, ותנקה הג'ל אולטרסאונד, שחרר את לחצן העכבר מהאזיקים הקלטת.
  13. למקם את החיה לכלוב חדש, נקי עם כרית preheated.
    הערה: לאחר סיום ההליך, סביבה חמה צריך להינתן לעכברים לפני התאוששות. חימום יתר יש להימנע, מאז vasodilation היקפיים פוגעת ההתאוששות. העכברים צריכים להיות תחת פיקוח מתמיד, מנע מבודדים אחרים עכברים עד החלמה מלאה שלהם, שמציין את יכולתם לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
  14. לפקח החיה עד הם להשיג התאוששות מלאה מן ההרדמה, מדי יום עד תום הניסוי.

3. ביולומינסנציה (בלי) הדמיה של hMSCs

  1. תמונה העכברים 24 שעות לאחר הזריקה intracardiac ביולומינסנציה מערכת הדמיה. להפעיל את ויוו imaging התוכנה. אתחול מערכת ההדמייה ופתח מחקר חדש.
    1. בחלונית ' בקרה ', להגדיר את הפרמטרים הדמיה באמצעות לחיצה על " רצף ההתקנה. " במצב הדמיה, בחר " הארה " ו " תצלום. " לקבוע את זמני חשיפה של 0.5 s כדי 10 דקות להגדיר את binning " בינוני " ו- F את / עצור כדי " 1. " להגדיר את המסנן עירור " בלוק " ו מסנן פליטה כדי " פתוח. " להגדיר שדה הראייה " C " עבור שני עכברים. הוספת הגדרת רצף לאשף התמונה על ידי לחיצה על לוח הבקרה של רכישת.
  2. לעבור על משאבת חמצן, ערכת איזופלוריין 2.5% התא אינדוקציה והן את האף חרוט בתוך המכונה.
  3. להחדיר את העכבר i.p. µL 300 של D-Luciferin (12.5 מ"ג/מ"ל).
  4. הנח את העכבר בבית הבליעה אינדוקציה הרדמה.
    1. לאחר 2-3 דקות, להעביר את העכבר לתוך ה-ויוו הדמיה קאמרית, עם ראשו של קונוס האף על יריעה ההרדמה. להחיל משחה אופטי כדי להגן על העיניים במהלך דימות. לשיקוף עכברים מרובות, השתמש בתימהון אור שחור כדי למנוע את השתקפות האור על גבי עכברים סמוכים.
  5. לחץ " לרכוש " כפתור כדי להתחיל את רכישת התמונה 10 דקות לאחר ההזרקה D-Luciferin.
  6. חזור על השלבים 3.3-3.5 לשיקוף עכברים יותר.
  7. לאחר רכישת התמונה ויוו, המתת חסד העכברים באמצעות אינהלציה 2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם, כדי לאשר את מותו. בצע הניתוח של ex-vivo.
    1. אם הניתוח שמחוץ מבוצע לאחר 20 דקות, לחזור על הזריקה luciferin (שלב 3.3) לפני להקריב את העכברים; האות רבנות בלי עלולה להפחית 20 דקות אחרי הזריקה luciferin.
  8. לנתח העכברים כדי להסיר את מערכת העיכול שלם (קרי, מאזור הבטן פי הטבעת) לימפה מצע המעי העליון (MLN), הריאות, הטחול, הכבד. מקם אותם בתוך צלחות פטרי באמצעות מלקחיים ומספריים 2 , 4.
  9. למקם את צלחת פטרי המכילות את האיברים explanted בבית הבליעה הדמיה ולרכוש רבנות בלי תמונות לכל השלבים 3.1-3.6.
  10. לאחר רכישת התמונה, להעביר את האברים explanted הדגימה בתבניות המכיל טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) במתחם. Cryofreeze התבניות ב-80 מעלות צלזיוס באמצעות קרח יבש. לבצע אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן אנטי לוציפראז במקטעי קפוא כדי לאשר את הנוכחות של hMSCs 16.
  11. לשימוש כימות של עוצמת האור, האזור של כלי הריבית (ROI) הכלי הצבעים 16 , 19. בחר במסגרת הטקסט ROI ולהעביר אותה לאזור עניין על התמונה. לחץ על " מדידת ROI " ולשמור את הנתונים בתבנית קובץ SEQ. לייצא את הנתונים כקובץ. txt ולהשתמש בתוכנה סטטיסטית לבצע הבדיקות הסטטיסטיות הבסיסיות עבור כימות 16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מראה כי hMSCs יכול להיות transduced עם הכתב טריפל-יעילות גבוהה, שמירה על תכונותיהם לתאי גזע. Transduced hMSCs, ניתן לאבחן בזמן אמת על ידי רבנות בלי (1C איור, איור 3). הרומן מונחה אולטרה סאונד הזרקה של hMSCs לתוך החדר השמאלי של SAMP עכברים מבטיח שיעור הצלחה גבוה מאוד של זריקה, ומאפשר התאוששות מהירה של העכברים עם תחלואה מינימלית ותמותה (איור 2). הזמן הממוצע עבור מזר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מתאר טכניקה חדשנית עבור הזרקה intracardiac מונחה אולטרה סאונד של hMSCs במודל של עכברים קטנים-מעיים של תקליטור ניסיוני. טכניקה זו יש שיעור גבוה מאוד של הישרדות והצלחה, גם המסלול של המחט ניתן להתאים בהתבסס על תמונות בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה של החדר העכבר השמאלי, שסופקו על-ידי. האולטרסאונד. היתרון של משלוח אל החדר השמאלי הוא כי hMSCs ואז מופצים intra-arterially, לעקוף את הסירקולציה ורידים, וכך למנוע הצבירה של תאים בתוך הריאות. בעבר, שימשה צנתור עורק הראש למסירה התוך עורקי להזריק MSCs16,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

דייב מאניש נתמך על ידי מענק ההגנה PR141774 ואת קרוהן קוליטיס כיבית של אמריקה הקריירה פיתוח פרס. המעבדה של פאביו Cominelli נתמך על-ידי NIH מעניקה DK042191 (עירוני), DK055812 (עירוני), DK091222 (עירוני), DK07948 (עירוני). המעבדה של ארנולד קפלן נתמך בחלקה על ידי דוד ל' וקרן בולדווין אי וירג'יניה. סוכנויות מימון היה אין תפקיד מחקר ניתוח או הכתיבה של כתב היד. התוכן שלה הם אחריות הכותבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEM-LG   Gibco31600-091
0.25% trypsin-EDTAGibco25-200-072
Proteamine SulfateSigma AldrichP4020-1G
D-LuciferinGoldbioluck-500
סרום בובין עובריGibco26140-079
אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייתGibco15240-062
PBSHyCloneSH30256.01
175 ס"מ צלוחיות חיתוך רקמותקורנינג431080
75 ס"מ צלוחיות חיתוך רקמותקורנינג430720
צינורות צנטריפוגהCrysalgen23-2265
רקמות פלוס O.C.T. תרכובתFisher HealthCare4585
Cryomold StandardTissue-Tek 4557
מערכת אריזת ביטוי HIV Lenti-PacGeneCopoeiaHPK-LvTR-20 
Povidone Ionidine ספוגיותMedlineMDS093901
קרם להסרת שיערNairN/A
Isoflurane פיראמל הלת'קר NDC 66794 013 25
מלקחיים Fine Science Tools11200-33
מספריים לדיסקציה (Wagner)כלי מדע עדיניםWagner 14068-12
משחה וטרינרית PuralubePuralubeNDC 17033-211-38
Aquasonic 100 ג'ל שידור אולטרסאונדמעבדות פרקר01 08
צלחת פטריעכברי
SAMPמרכז הליבה לחקר מחלות העיכול של קליבלנד
Visual Sonics, טורונטו, קנדה
  מערכת סדרת ספקטרום IVIS PerkinElmer, Waltham, MA
תוכנת תמונה חיה CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA
כתב משולשסופק באדיבות על ידי ד"ר ג'נג-הונג לי, CWRU, (ציטוט 19)
פישר סיינטיפיק FB0875711A עכברי AKR מרכז הליבה לחקר מחלות העיכול של קליבלנד מערכת הדמיה Vevo 770 

מקורות

  1. Duijvestein, M., et al. Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis. Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).
  2. Sala, E., et al. Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine. Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).
  3. Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses. Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).
  4. Dave, M., et al. Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion. Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).
  5. Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).
  6. Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).
  7. Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).
  8. Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics. Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).
  9. Dave, M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis. Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).
  10. Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), (2016).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).
  13. English, K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation. Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).
  14. Pizarro, T. T., et al. SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis. Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).
  15. Lennon, D. P., Caplan, A. I. Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).
  16. Lin, P., et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).
  17. Dennis, J. E., Caplan, A. I. Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin. J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).
  18. Lin, P., et al. Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).
  19. Love, Z., et al. Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET. PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).
  20. Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. Bone. 13 (1), 81-88 (1992).
  21. Ishizaka, S., et al. Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke. Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).
  22. Schenk, S., et al. Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor. Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).
  23. Hayashi, Y., et al. Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).
  24. Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system. J. Vis. Exp. (80), e50843(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

דימוי ביולומינסנציהמערכת שלוש רפורטריםהגעה למעי הדקמודל עכברים SAMPשיעור הצלחת הובלת תאיםניתוח של מערכת העיכול
הזרקת Intracardiac מונחה אולטרה סאונד של גזע Mesenchymal האנושי כדי להגדיל את יונת אל המעי לשימוש במודלים מאתר של מחלות מעי דלקתיות ניסיוני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.