מאמר שיטה

אידוי צמצום מצב התרבות מגביר את השחזור של גיבוש התאי אליפטית צלחות microtiter טובות

DOI:

10.3791/55403

⸱

7 במרץ 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההפסד האחיד של מדיום מצלחות microtiter משפיע על השחזור של היווצרות אליפטית גידול רבה-תאיים אחידה. שיפור תנאי תרבות כדי לצמצם את אובדן בינוני משמעותי ישפר את השחזור של היווצרות אליפטית ותוצאות מבחנים מבוסס אליפטית בטכניקה הנוזלת כיסוי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים גידול כי לחקות באופן הדוק בתנאים vivo הופכים פופולריים יותר ויותר גילוי ופיתוח תרופות להקרנה של תרופות נוגדות סרטן פוטנציאליים. Spheroids הגידול תאיים (MCTSes) ביעילות לחקות את התנאים הפיזיולוגיים של גידולים מוצקים, מה שהופך אותם מצוין במודלים חוץ גופית עבור אופטימיזציה להוביל ואימות היעד. מתוך הטכניקות השונות העומדות לתרבות MCTS, שיטת נוזלי כיסוי על agarose היא אחת השיטות הכי הזולות לייצור MCTS. עם זאת, ההעברה האמינה של תרבויות MCTS באמצעות נוזלי כיסוי להקרנת תפוקה גבוהה עלולה לסכן ידי מספר המגבלות, כולל הציפוי של צלחות microtiter (MPS) עם agarose ואת irreproducibility של היווצרות אחידה MCTS פני בארות. חברי פרלמנט נוטים באופן משמעותי בימים אלה לדחוק תופעות נובעות אידוי יתר של מדיום מן הצד החיצוני של הצלחת, למנוע את משך השימוש של הצלחת כולה על תרופהבדיקות. כתב יד זה מספק שיפורים טכניים מפורטים לטכניקה הנוזלת כיסוי כדי להגדיל את יכולת ההרחבה ואת השחזור של היווצרות MCTS האחידה. בנוסף, פרטים על כלי תוכנה פשוטה, חצי אוטומטי, וישים באופן אוניברסלי להערכת MCTS כולל לאחר טיפול תרופתי מוצג.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים סרטניים בגידולים מסודרים פיסיולוגי מבנה מורכב, 3-ממדי (3D) המוקף מטריקס ותאי אינטראקציה. כמו כמעט כל התאים ברקמות מתגוררים בסביבת 3D, הצורך יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במודלי גידול במבחנה מחקות תכונות גידול הביא לפיתוח טכניקות תרבות 3D מספר 1, 2, 3. מודלים אלה עכשיו הופכים כלי מחקר בסיסיים עבור לומד את התפקיד של microenvironment הגידול על תגובה גרורה ותא כדי רפוי ב -3 D 2. יתר על כן, לעומת 2-ממדים (2D) תא תרבויות 4, מודלי 3D לאפשר הבנה טובה יותר של אינטראקציות גידולי stroma, אשר משפיעות מסלולי איתות תאיים.

spheroids גידול התאי (MCTSes) של שורות תאים סרטניות נמצא בשימוש תדיר ג תאי 3Dמודלים ulture בשל הקרבה היחסית שלהם גידולים in vivo. מתוך מספר הטכניקות בשימוש, טכניקת כיסוי-הנוזלית (הרבה) של דור MCTS על צלחות מצופות agarose צברה עניין משמעותי עבור אימות אופטימיזציה עופרת יעד 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. הדבר ניכר מן המחקרים האחרונים כי הצליחו בהצלחה לרוץ מסכי טייס של ספריות מתחמות בתרבויות MCTS באמצעות לוט 6, 7. עם זאת, גם ל-גם השתנות במורפולוגיה MCTS וצמיחה עקב האובדן האחיד הנגרם האידוי של מדיום הם מכשולים נפוצים שמלווים במגרש באמצעות צלחות microtiter (חברי הפרלמנט). כתוצאה מכך, ההיווצרות של לא אחידה MCTSes פשרות המשמעות ורלוונטיתנתוני מבחנים תרופתיים 8, 12, 13. בנוסף לנושאי השחזור, בעיה מעשית אחר המשפיעה מבחני תפוקה גבוהה מבוססות לוט הוא הציפוי של חברי הפרלמנט עם agarose בעת השימוש נוזלי אוטומטית מחלק יחידות. למרות היחידה מהחלק יכולה להישמר מחוממת כדי למנוע את gelling של agarose, הסתימה של קלטת מחלק הצינורות היא דאגת פוטנציאל מערכות רובוטיות 6.

כדי להתגבר על חלק מהאתגרים הללו, אנו פתחנו לאחרונה כמה שינויים במגרש עבור MCTS תרבות 8. שינויים אלה מבוססים בעיקר על דרכים אפשריות למניעת נשירה בינונית אחידה מן החברים הפרלמנט באמצעות מכשירים מצויים לרוב במעבדות הקרנת תפוקה גבוהה. נוהל מפורט של המגרש שונה עבור הדור של MCTSes בגודל לשחזור באופן אחיד על פני 384-גם צלחות (WPS) מוצגות כאן. כתב היד גם מציגה שגרה אוטומטית למחצה להערכת גודל MCTS, במיוחד בחלקו מתפורר, MCTSes מטופלים בתרופה כי אין גבול ברור למדידת שטח חתך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת צלחות מצופות Agarose

  1. לשקול 0.75 גרם של נקודת agarose התכה נמוכה ולהוסיף אותו ל -100 מ"ל של מדיום 5A של מקוי (עם או ללא פנול אדום) ללא בסרום. מחממים את הפתרון במיקרוגל ו מערבולת כל 1-2 דקות כדי לפזר את agarose לחלוטין. חיטוי הפתרון לעקר אותה.
  2. מצננים את autoclaved agarose לכ -70 מעלות צלזיוס, לסנן אותו דרך העליון 500 מ"ל, 0.22 מיקרומטר מסנן על ידי סינון ואקום בתוך קופסה זרימה למינרית. Aliquot פתרון agarose המסונן 0.75% (FAS) לתוך כמויות קטנות יותר אם לא באמצעות הפתרון כולו בבת אחת. בחנות זו בסביבה נקייה מחיידקים פתרון agarose מוכן לשימוש בחדר קר או 4 ° C במקרר עד 4 שבועות.
  3. צרף צינור קטן עם בפלסטיק או קלטת מחלק שקצו מתכת מנפק מגיב קומבי וראש הקלטת עם 70% אתנול (EtOH) ולאחר מכן עם פוספט שנאגר המלוח סטרילית (PBS) בקופסא זרימה.
  4. לפני השימוש, לחמם aliquot מאוחסן של FAS i n במיקרוגל כדי להמיס אותו. ראש הקלטת מחלק עם פתרון agarose ומעיל 384 גם, בתרבית רקמה (TC) -treated "מיוחד" microplates עם 15 μL של FAS. אפשר agarose בצלחת לצינון למשך 15-20 דקות לפני זריעת התאים. אחסן את הצלחות מצופות agarose בסביבה נקיה מחיידקים, עטופות בשקית פוליאתילן בחדר קר או ב 4 ° C, הרחק מאור שמש ישיר.
    הערה: הימנע חימום חוזר ונשנה של 0.75% FAS למנוע שינוי בריכוז של agarose בפתרון המניות. צלחות מצופות agarose ניתן לאחסן עד 2 שבועות כאשר הם מאוחסנים בתנאים הנ"ל. FAS אינו דורש חימום במהלך הציפוי של צלחות.
  5. נקה את הקלטת מהחלק ידי תחול זה עם 70-80 ° C מים סטריליים כדי להסיר כל agarose שנותר טיפי הקלטת וצינורות.

גיבוש 2. תא תרבות MCTS

  1. תרבות תאי HCT116 אדם גסת קרצינומה, כפי שתואר לעילילדה = "Xref"> 8.
  2. הסר את המספר הדרוש של מצופה agarose, 384 גם, TC שטופלו microplates מ בקירור לאזן אותם לטמפרטורת החדר (RT) במשך 15 דקות.
  3. הכן את המנפק מגיב קומבי עבור זריעת תאים על ידי תחול קלטת מחלק הצינור רגילה עם 70% EtOH ו PBS סטרילית. כוון את עוצמת קול הזריעה אל μL הנדרש ואת המהירות שספק עד בינוני באמצעות לחצני הגדרה הידניים על המנפק.
    הערה: תהליך זריעת תא כולו מבוצע בתנאים סטריליים בתוך קופסא זרימה למינרית.
  4. לנתק תאים חסידים מהבקבוק בתרבית הרקמה באמצעות אנזים דיסוציאציה תאי רקומביננטי. הפוך מלאה השעית תא מבחנה סטרילית עם תאי זרע בצפיפות של 2.5 x 10 4 תאים / מיליליטר לכל היטב 50 μL של מדיום גידול להשלים. כאשר זריעה יותר מאחד 384-WP, מערבבים את התאים בעזרת בוחש מגנטי כדי למנוע מהם מלהתיישב לתחתית הכוס.
  5. אפשרצלחות לנוח למשך 30 דקות ב RT ואז צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 4 x ז.
  6. בינתיים, לקחת מכסה הסביבה להפחתת אידוי ולמלא אותו עם 8 מ"ל של H 2 O סטרילי או 5% sulfoxide דימתיל (DMSO) בצדדים קצר (שמאל וימין) באמצעות (איור 1 א) 5 מ"ל פיפטה. ראשית, לוותר 4 מ"ל של מילוי נוזל לתוך השוקת בצד שמאל על ידי גורף את קצה פיפטה לאט למעלה ולמטה. חזור על פעולה זו עם השוקת בצד הימני.
    הערה: ודא כי הנוזל מתווסף שקתות הצד אינו מתבצע במרכז המכסה, ולהשאיר פער לחילופי גז (איור 1 א). הוספת סכום עודף של H 2 O תוצאות החלחול של H 2 O על הצד החיצוני של המכסה ולאחר מכן לתוך הבארות החיצוניות של 384 גם צלחות TC.
  7. מלאו את מיכל נוזל של הצלחת TC 384 גם עם סטרילי H 2 O ולהחליף את מכסים בצלחת רגיל עם מכסים סביבתי מלא נוזל (איור 2 א).
  8. מניחים את הצלחות באינקובטור רוטרי 37 מעלות צלזיוס עם לחות 95%, 5% CO 2, ו -20% O 2, ולאפשר לתאים כדי לצבור לתוך MCTSes במשך 4 ימים. הימנע מפתיחת הדלת בחממה במשך זמן רב מדי בימים שלאחר מכן כדי למנוע את רמת הלחות מלהפיל בפתאומיות.

3. המרה בינונית באמצעות מערכת רובוטית

  1. ביום 4 לאחר היווצרות MCTS, להוסיף 30 μL של המדיום מראש חימם לכל טוב באמצעות מתקן מכונת כביסה microplate אוטומטיות. אפשר MCTSes לגדול במשך 3 ימים נוספים. החלף את המדיום קבוע כל 3 ימים, עד שהם מגיעים לגודל הרצוי לניסויים.
  2. כדי לשאוב נפח מוגדר בינוני מכל טוב, באופן אמפירי להתאים את z -height של סעפת מכונת הכביסה. לשאוב 30 μL של המדיום לכל טוב ולהחליפו 30 μL של מדיום חדש, מחומם מראש.
    הערה: הגדרת מהירות מהחלק את המהירות שבה סעפת מכונת הכביסה נוסעת במורדלתוך בארות בשיעור הנמוך ביותר כדי למזער מערבולת הבארות.

4. הדמית ביצועי תוכן של MCTS וניתוח תמונה חצי אוטומטי

  1. תמונה את MCTS במערכת הדמיה אוטומטית גבוה תוכן באמצעות מטרת אוויר 4X (NA 16).
  2. קבע את זמן החשיפה ל -11 מילי-שניות ואת binning עד 4 x 4. התאם את מספר או רווחים של z -stacks ואת binning פיקסל כפי הרצוי כדי שהניסוי ללכוד MCTS כולו לכל טוב.
  3. לעבד את בשלבי תמונות, כמתואר "readme," באמצעות שגרה ללא צורך במיקור חוץ נכתבה בשפת תכנות.
    הערה: קבצי קוד .M ו readme .txt זמינים כקבצי קוד משלים (איור 1B). המודד השיגרתי באזור MCTS, צירים ראשיים ומשניות, היקף מוצק מתמונות 2D.

figure-protocol-1
איור 1:הכנת מכסים סביבתיים תרשים זרימה של השגרה חצי האוטומטית. (א) תמונה של מכסה סביבה להפחתת אידוי מלא הנכון (משמאל) העודף (מימין) כמות מילוי נוזלי (כאן, DMSO 5%). החץ מציין שוקת הקצרה בצד להוספת נוזל. הכוכבית ממחישה את הפער באמצע המכסה בעקבות התוספת של הנפח הנכון של DMSO. (ב) עבודה מראה את השלבים כרוכים משגר ניתוח תמונה אוטומטי למחצה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההפסד לא השווה של מדיום, במיוחד מבארות פריפריה, הוא בעיה נתקלה לעתים קרובות חברי פרלמנט עם כרכי תרבות קטנים. באופן משמעותי תנאי תרבות משופרים, כגון חממות עם מבוקר היטב מערכות טמפרטורה / humidification וחברי פרלמנט מפחיתי אידוי מכסה בצלחת, להפחית את האובדן המשמעותי של מדיום על פני בארות 8. כדי למדוד את האידוי יחסית, כמויות שווות של אורנג 'G (OG) נוספו כל טוב, והשינוי ספיג OG מעל 3 ימים נרשם צלחות עם מכסים קבועים וסביבתיים באי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציפוי צלחות TC 384 ובכן עם מסונן Agarose

המנהג הסטנדרטי לוט הוא להשתמש נקודת agarose 1-1.5% התכה נמוכה כדי לצפות את הצלחות, המחייבת את agarose ו / או יחידת ניפוק להישמר מחומם כדי למנוע את gelling של agarose 6. Gelling של agarose הוא דאגת פוטנציאל בעת הכנת הצלחות מרובות באמצעות קלטות מחלק נוזל עם פתחי צינורות קטנים הנעים בין 0.2 ל 0.4 מ"מ קוטר. כדי להתגבר על הבעיה הפוטנציאלית של סתימת קלטות מה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממשרד החינוך הצ'כי, הנוער והספורט (LO1304) והסוכנות הטכנולוגית של צ'כיה (TE01020028). המחברים מבקשים להודות לד"ר לאקשמן ורנאסי שהקדיש תמונות סטילס של עפעפיים סביבתיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AgaroseSigma-AldrichA9414
McCOY's 5A בינונינמסM8403
' מהיר" מסנן FiltermaxTPP995050.22 μ מ', 500 מ"ל
Multidrop™ מתקן ריאגנט קומבי Thermo Fisher Scientific5840300
קלטת חלוקת צינורות קטנים תרמו פישר סיינטיפיק24073295טיפ מתכת 
צלחת TC 384 בארות סוג צלחת6057308 PerkinElmer
קלטת חלוקת צינורות סטנדרטיתCellCarrier Thermo Fisher Scientific24072670
MicroClime מכסה סביבתיLabcyteLLS-0310
DMSOSigmaD4540
אינקובטור סיבובי (SteriStore)HighRes Biosolutions23641מספר סידורי: D00384
מתקן למכונת כביסה Microplate BioTekדגם לא מוגדר: EL406 
מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה (CellVoyager)תאגיד החשמל יוקוגאווהלא מוגדר: CV7000
Orange GNew England BiolabsB7022S
TrypLE™ מגיב דיסוציאציה תאים רקומביננטי אקספרסתרמו פישר סיינטיפיק12604021פנול אדום חינם
אינץ- דגם

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  2. Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
  3. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
  4. Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
  5. Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895(2015).
  6. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
  7. Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
  8. Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
  9. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751(2014).
  10. Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
  11. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  12. Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
  13. Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
  14. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103(2016).
  15. Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
  16. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
  17. Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים