אידוי צמצום מצב התרבות מגביר את השחזור של גיבוש התאי אליפטית צלחות microtiter טובות

סיכום

ההפסד האחיד של מדיום מצלחות microtiter משפיע על השחזור של היווצרות אליפטית גידול רבה-תאיים אחידה. שיפור תנאי תרבות כדי לצמצם את אובדן בינוני משמעותי ישפר את השחזור של היווצרות אליפטית ותוצאות מבחנים מבוסס אליפטית בטכניקה הנוזלת כיסוי.

תקציר

מודלים גידול כי לחקות באופן הדוק בתנאים vivo הופכים פופולריים יותר ויותר גילוי ופיתוח תרופות להקרנה של תרופות נוגדות סרטן פוטנציאליים. Spheroids הגידול תאיים (MCTSes) ביעילות לחקות את התנאים הפיזיולוגיים של גידולים מוצקים, מה שהופך אותם מצוין במודלים חוץ גופית עבור אופטימיזציה להוביל ואימות היעד. מתוך הטכניקות השונות העומדות לתרבות MCTS, שיטת נוזלי כיסוי על agarose היא אחת השיטות הכי הזולות לייצור MCTS. עם זאת, ההעברה האמינה של תרבויות MCTS באמצעות נוזלי כיסוי להקרנת תפוקה גבוהה עלולה לסכן ידי מספר המגבלות, כולל הציפוי של צלחות microtiter (MPS) עם agarose ואת irreproducibility של היווצרות אחידה MCTS פני בארות. חברי פרלמנט נוטים באופן משמעותי בימים אלה לדחוק תופעות נובעות אידוי יתר של מדיום מן הצד החיצוני של הצלחת, למנוע את משך השימוש של הצלחת כולה על תרופהבדיקות. כתב יד זה מספק שיפורים טכניים מפורטים לטכניקה הנוזלת כיסוי כדי להגדיל את יכולת ההרחבה ואת השחזור של היווצרות MCTS האחידה. בנוסף, פרטים על כלי תוכנה פשוטה, חצי אוטומטי, וישים באופן אוניברסלי להערכת MCTS כולל לאחר טיפול תרופתי מוצג.

מבוא

תאים סרטניים בגידולים מסודרים פיסיולוגי מבנה מורכב, 3-ממדי (3D) המוקף מטריקס ותאי אינטראקציה. כמו כמעט כל התאים ברקמות מתגוררים בסביבת 3D, הצורך יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במודלי גידול במבחנה מחקות תכונות גידול הביא לפיתוח טכניקות תרבות 3D מספר ^{1, 2, 3.} מודלים אלה עכשיו הופכים כלי מחקר בסיסיים עבור לומד את התפקיד של microenvironment הגידול על תגובה גרורה ותא כדי רפוי ב -3 D ^2. יתר על כן, לעומת 2-ממדים (2D) תא תרבויות ^4, מודלי 3D לאפשר הבנה טובה יותר של אינטראקציות גי....

פרוטוקול

1. הכנת צלחות מצופות Agarose

1. לשקול 0.75 גרם של נקודת agarose התכה נמוכה ולהוסיף אותו ל -100 מ"ל של מדיום 5A של מקוי (עם או ללא פנול אדום) ללא בסרום. מחממים את הפתרון במיקרוגל ו מערבולת כל 1-2 דקות כדי לפזר את agarose לחלוטין. חיטוי הפתרון לעקר אותה.
2. מצננים את autoclaved agarose לכ -70 מעלות צלזיוס, לסנן אותו דרך העליון 500 מ"ל, 0.22 מיקרומטר מסנן על ידי סינון ואקום בתוך קופסה זרימה למינרית. Aliquot פתרון agarose המסונן 0.75% (FAS) לתוך כמויות קטנות יותר אם לא באמצעות הפתרון כולו בבת אחת. ב....

תוצאות

ההפסד לא השווה של מדיום, במיוחד מבארות פריפריה, הוא בעיה נתקלה לעתים קרובות חברי פרלמנט עם כרכי תרבות קטנים. באופן משמעותי תנאי תרבות משופרים, כגון חממות עם מבוקר היטב מערכות טמפרטורה / humidification וחברי פרלמנט מפחיתי אידוי מכסה בצלחת, להפחית את האובדן המשמעותי של מדיום על פני בארות ^8. כדי למדוד את האידוי יחסית, כמויות שווות של אורנג 'G (OG) נוספו כל טוב, והשינוי ספיג OG מעל 3 ימים נרשם צלחות עם מכסים קבועים וסביבתיים.......

דיון

ציפוי צלחות TC 384 ובכן עם מסונן Agarose

המנהג הסטנדרטי לוט הוא להשתמש נקודת agarose 1-1.5% התכה נמוכה כדי לצפות את הצלחות, המחייבת את agarose ו / או יחידת ניפוק להישמר מחומם כדי למנוע את gelling של agarose ^6. Gelling של agarose הוא דאגת פוטנציאל בעת הכנת הצלחות מרובות באמצעות קלטות מחלק נוזל עם פתחי צינורות קטנים הנעים בין 0.2 ל 0.4 מ"מ קוטר. כדי להתגבר על הבעיה הפוטנציאלית של סתימת קלט.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414
McCOY's 5A בינוני	נמס	M8403
' מהיר" מסנן Filtermax	TPP	99505	0.22 μ מ', 500 מ"ל
Multidrop™ מתקן ריאגנט קומבי	Thermo Fisher Scientific	5840300
קלטת חלוקת צינורות קטנים	תרמו פישר סיינטיפיק	24073295	טיפ מתכת
צלחת TC 384 בארות	סוג צלחת	6057308 PerkinElmer
קלטת חלוקת צינורות סטנדרטית	CellCarrier Thermo Fisher Scientific	24072670
MicroClime מכסה סביבתי	Labcyte	LLS-0310
DMSO	Sigma	D4540
אינקובטור סיבובי (SteriStore)	HighRes Biosolutions	23641	מספר סידורי: D00384
מתקן למכונת כביסה Microplate	BioTek	דגם לא מוגדר	: EL406
מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה (CellVoyager)	תאגיד החשמל יוקוגאווה	לא מוגדר	: CV7000
Orange G	New England Biolabs	B7022S
TrypLE™ מגיב דיסוציאציה תאים רקומביננטי אקספרס	תרמו פישר סיינטיפיק	12604021	פנול אדום חינם

אינץ- דגם